Нов тип Грам-отрицателни, аеробни, устойчиви на сол, активни, пръчковидни и хищнически бактерии ASxL5T бяха изолирани от езерце с кравешки тор в Нотингамшир, Англия, и използваха Campylobacter като своя плячка. Впоследствие други видове Campylobacter и членове на семейство Enterobacteriaceae са открити като плячка. След субкултивиране без клетки-гостоприемници се постига слаб асептичен растеж върху мозъчно-сърдечен инфузионен агар. Оптималните условия за растеж са 37 °C и pH е 7. Трансмисионната електронна микроскопия разкри някои много необичайни морфологични характеристики, свързани с наличието на плячка. Филогенетичният анализ, използващ генната последователност на 16S rRNA, показва, че изолатът е свързан с член на семейство Marine Spirulina, но не може да бъде ясно класифициран като член на известен род. Секвенирането на целия геном на ASxL5T потвърди връзката с членовете на морските спирохети. Търсене в база данни разкри, че няколко ASxL5Ts споделят 16S rRNA генни последователности с няколко некултивирани бактерии от океана, земната повърхност и подземните води. Предполагаме, че щамът ASxL5T представлява нов вид в нов род. Препоръчваме името Venatorbacter cucullus gen. ноември, сп. През ноември ASxL5T беше използван като типов щам.
Хищните бактерии са бактерии, които показват способността да преследват и убиват други живи бактерии, за да получат биосинтетични материали и енергия. Това е различно от общото възстановяване на хранителни вещества от мъртви микроорганизми и също така е различно от паразитните взаимодействия, при които бактериите създават тясна връзка със своя гостоприемник, без да ги убиват. Хищните бактерии са развили различни жизнени цикли, за да се възползват от изобилните източници на храна в нишите, където се намират (като морски местообитания). Те са таксономично разнообразна група, която е свързана само от техния уникален жизнен цикъл на стерилизация1. Примери за хищнически бактерии са открити в няколко различни вида, включително: Proteobacteria, Bacteroides и Chlorella.3. Въпреки това, най-добре проучените хищни бактерии са Bdellovibrio и Bdellovibrio и подобни организми (BALOs4). Хищните бактерии са обещаващ източник на нови биологично активни съединения и антибактериални средства5.
Смята се, че хищните бактерии подобряват микробното разнообразие и имат положително въздействие върху здравето, производителността и стабилността на екосистемата6. Въпреки тези положителни качества, има малко проучвания върху нови хищнически бактерии поради трудността на култивирането на бактерии и необходимостта от внимателно наблюдение на клетъчните взаимодействия, за да се разберат техните сложни жизнени цикли. Тази информация не се получава лесно от компютърен анализ.
В ерата на нарастваща антимикробна резистентност се изучават нови стратегии за насочване към бактериални патогени, като използването на бактериофаги и хищнически бактерии7,8. Бактериите ASxL5T бяха изолирани през 2019 г. с помощта на технология за изолиране на фаги от кравешка тор, събрана от Млечния център на Университета в Нотингам, Нотингамшир. Целта на изследването е да се изолират организми с потенциал като агенти за биологичен контрол. Campylobacter hyointestinalis е зоонотичен патоген, който все повече се свързва с човешки чревни заболявания10. Той е повсеместен в серума и се използва като целеви гостоприемник.
Бактерията ASxL5T е изолирана от говеждо желе, тъй като е наблюдавано, че образуваните от нея плаки върху моравата на C. hyointestinalis са подобни на тези, произведени от бактериофагите. Това е неочаквано откритие, тъй като част от процеса на изолиране на фаги включва филтриране през 0,2 µm филтър, който е предназначен да премахва бактериалните клетки. Микроскопското изследване на материала, извлечен от плаката, разкрива, че малките грам-отрицателни извити пръчковидни бактерии не натрупват полихидроксибутират (PHB). Асептичната култура, независима от клетките на плячка, се реализира върху богата твърда среда (като мозъчно-сърдечен инфузия на агар (BHI) и кръвен агар (BA)), и нейният растеж е слаб. Получава се след субкултивиране с тежко подобрение на инокулума. Той расте еднакво добре при микроаеробни (7% об./об. кислород) и атмосферни условия на кислород, но не и в анаеробна атмосфера. След 72 часа диаметърът на колонията беше много малък, достигайки 2 mm, и беше бежова, полупрозрачна, кръгла, изпъкнала и лъскава. Стандартното биохимично тестване е затруднено, тъй като ASxL5T не може да се култивира надеждно в течна среда, което предполага, че може да разчита на сложния жизнен цикъл на образуване на биофилм. Въпреки това, суспензията на плочата показа, че ASxL5T е аеробен, положителен за оксидаза и каталаза и може да понася 5% NaCl. ASxL5T е резистентен към 10 µg стрептомицин, но е чувствителен към всички други тествани антибиотици. Бактериалните клетки ASxL5T бяха изследвани чрез ТЕМ (Фигура 1). Когато се отглеждат без клетки плячка на BA, клетките ASxL5T са малки Campylobacter, със средна дължина от 1,63 μm (± 0,4), ширина от 0,37 μm (± 0,08) и единичен дълъг (до 5 μm) полюс. Сексуални флагели. Приблизително 1,6% от клетките изглежда имат ширина по-малка от 0,2 μm, което ще позволи преминаване през филтърното устройство. Наблюдава се необичайно структурно разширение на върха на някои клетки, подобно на обтекател (лат. cucullus) (вижте стрелките в 1D, E, G). Това изглежда е съставено от излишна външна мембрана, което може да се дължи на бързото намаляване на размера на периплазмената обвивка, докато външната мембрана остава непокътната, показвайки "хлабав" вид. Култивирането на ASxL5T в отсъствието на хранителни вещества (в PBS) за дълго време при 4°C доведе до повечето (но не всички) клетки, показващи морфология на кока (Фигура 1C). Когато ASxL5T расте с Campylobacter jejuni като плячка за 48 часа, средният размер на клетката е значително по-дълъг и по-тесен от клетките, отглеждани без гостоприемник (Таблица 1 и Фигура 1E). За разлика от това, когато ASxL5T расте с E. coli като плячка за 48 часа, средният размер на клетката е по-дълъг и по-широк, отколкото когато расте без плячка (Таблица 1), а дължината на клетката е променлива, обикновено показваща нишковидна (Фигура 1F). Когато се инкубират с Campylobacter jejuni или E. coli като плячка в продължение на 48 часа, клетките ASxL5T изобщо не показват флагели. Таблица 1 обобщава наблюденията на промените в размера на клетката въз основа на присъствието, отсъствието и типа плячка на ASxL5T.
TEM дисплей на ASx5LT: (A) ASx5LT показва дълъг камшик; (B) типична батерия ASx5LT; (C) коки ASx5LT клетки след дълга инкубация без хранителни вещества; (D) група ASx5LT клетки показват аномалия (E) ASx5LT клетъчна група, инкубирана с Campylobacter плячка, показва увеличена дължина на клетките в сравнение с тези без растеж на плячка (D) също показва апикална структура; (F) Големи нишковидни камшичета, ASx5LT клетки, след инкубиране с плячка от E. coli; (G) Единична клетка ASx5LT след инкубиране с Е. coli, показваща необичайна горна структура. Лентата представлява 1 μm.
Определянето на генната последователност на 16S rRNA (номер за достъп MT636545.1) дава възможност за търсене в база данни за установяване на последователности, подобни на тези в класа Gammaproteobacteria, и са най-близки до морските бактерии от семейството на морските спирили (Фигура 2) и са членове на рода Thalassolituus Най-близкият роднина на морския бацил. Генната последователност на 16S rRNA е ясно различна от хищните бактерии, принадлежащи към семейството Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria). Сравненията по двойки на B. bacteriovorus HD100T (типов щам, DSM 50701) и B. bacteriovorus DM11A са 48,4% и 47,7%, а за B. exovorus JSS е 46,7%. Бактериите ASxL5T имат 3 копия на гена 16S rRNA, две от които са идентични едно с друго, а третото е на 3 бази една от друга. Два други хищнически бактериални изолата (ASx5S и ASx5O; 16S rRNA генни номера за достъп са MT636546.1 и MT636547.1, съответно) с подобни морфологични и фенотипни характеристики от едно и също място не са еднакви, но са различни от ASxL5T и некултивирана бактерия последователностите от бази данни са групирани заедно с други родове в Oceanospirillaceae (Фигура 2). Цялата геномна последователност на ASxL5T е определена и запазена в базата данни на NCBI, а номерът за достъп е CP046056. Геномът на ASxL5T се състои от кръгова хромозома от 2 831 152 bp със съотношение G + C 56,1%. Последователността на генома съдържа 2653 CDS (общо), от които 2567 са предвидени да кодират протеини, от които 1596 могат да бъдат определени като предполагаеми функции (60,2%). Геномът съдържа 67 РНК-кодиращи гена, включително 9 рРНК (по 3 за 5S, 16S и 23S) и 57 тРНК. Геномните характеристики на ASxL5T бяха сравнени с наличните геноми на щамове от най-близкия относителен тип, идентифицирани от генната последователност на 16S rRNA (Таблица 2). Използвайте аминокиселинна идентичност (AAI), за да сравните всички налични геноми на Thalassolituus с ASxL5T. Най-близката налична (непълна) геномна последователност, определена от AAI, е Thalassolituus sp. C2-1 (добавете NZ_VNIL01000001). Този щам е изолиран от дълбоководните седименти на Марианската падина, но в момента няма фенотипна информация за този щам за сравнение. В сравнение с 2,82 Mb на ASxL5T, геномът на организма е по-голям с 4,36 Mb. Средният размер на генома на морските спирохети е около 4,16 Mb (± 1,1; n = 92 пълни референтни генома, изследвани от https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), така че геномът на ASxL5T е в съответствие с ред В сравнение с останалите членове, той е доста малък. Използвайте GToTree 1.5.54, за да генерирате базирано на геном оценено филогенетично дърво с максимална вероятност (Фигура 3A), като използвате подравнените и свързани аминокиселинни последователности на 172 гена с едно копие, специфични за Gammaproteobacteria 11,12,13,14,15,16, 17 ,18. Анализът показа, че тя е тясно свързана с Thalassolituus, Bacterial Plane и Marine Bacterium. Въпреки това, тези данни показват, че ASxL5T е различен от своите роднини в морската спирулина и данните за неговата геномна последователност са налични.
Филогенетичното дърво, използващо генната последователност на 16S rRNA, подчертава позицията на щамовете ASxL5T, ASxO5 и ASxS5 (с вътрешностите) по отношение на некултивираните и морските бактериални щамове в морските Spirulinaceae. Идентификационният номер на Genbank следва името на щама в скоби. Използвайте ClustalW за подравняване на последователности и използвайте метода на максималната вероятност и модела на Тамура-Ней, за да направите извод за филогенетични връзки и извършете 1000 направлявани репликации в програмата MEGA X. Числото на клона показва, че стойността на насоченото копие е по-голяма от 50%. Escherichia coli U/541T беше използвана като външна група.
(A) Филогенетично дърво, базирано на генома, показващо връзката между морската бактерия Spirospiraceae ASxL5T и нейните близки роднини, E. coli U 5/41T като външна група. (B) В сравнение с T. oleivorans MIL-1T, разпределението на функционалната категория на гените се прогнозира въз основа на клъстера на ортологичната група (COG) на ASx5LT протеин. Фигурата вляво показва броя на гените във всяка функционална COG категория във всеки геном. Графиката вдясно показва процента на геномите, съдържащи се във всяка функционална COG група. (C) В сравнение с T. oleiverans MIL-1T, анализът на пълния модулен път на KEGG (Киото Енциклопедия на гените и геномите) на ASxL5T.
Използването на базата данни KEGG за изследване на компонентните гени, присъстващи в генома ASxL5T, разкрива типичния метаболитен път на аеробния гама Proteus. ASxL5T съдържа общо 75 гена, присвоени на бактериални моторни протеини, включително гени, участващи в хемотаксис, сглобяване на камшичета и система от фимбрии тип IV. В последната категория 9 от 10 гена са отговорни за движението на потрепване на редица други организми. Геномът на ASxL5T съдържа пълен тетрахидропиримидинов биосинтетичен път, който участва в защитния отговор на осмотичния стрес20, както се очаква за халофилите. Геномът също така съдържа много пълни пътища за кофактори и витамини, включително пътища за синтез на рибофлавин. Въпреки че генът на алкан 1-монооксигеназа (alkB2) присъства в ASxL5T, пътят на използване на въглеводорода не е пълен. В последователността на генома на ASxL5T, хомолози на гени, идентифицирани като главно отговорни за разграждането на въглеводороди в T. oleiverans MIL-1T21, като TOL_2658 (alkB) и TOL_2772 (алкохол дехидрогеназа) очевидно отсъстват. Фигура 3B показва сравнението на генното разпределение в категорията COG между ASxL5T и зехтина MIL-1T. Като цяло по-малкият геном ASxL5T съдържа пропорционално по-малко гени от всяка категория COG в сравнение с по-големия свързан геном. Когато броят на гените във всяка функционална категория се изрази като процент от генома, се отбелязват разлики в процента на гените в категориите за транслация, рибозомна структура и биогенеза, както и категориите на функцията за производство и преобразуване на енергия, които съставляват по-големия ASxL5T геном Процентът се сравнява със същата група, присъстваща в генома MIL-1T на T. oleiverans. За разлика от това, в сравнение с генома ASxL5T, T. oleivorans MIL-1T има по-висок процент гени в категориите репликация, рекомбинация и възстановяване и транскрипция. Интересното е, че най-голямата разлика в съдържанието на всяка функционална категория на двата генома е броят на неизвестните гени, присъстващи в ASxL5T (Фигура 3B). Беше извършен анализ на обогатяване на KEGG модули, където всеки KEGG модул представлява набор от ръчно дефинирани функционални единици за анотация и биологична интерпретация на данни за геномна последователност. Сравнението на генното разпределение в пълния път на KOG модула на ASxL5T и маслина MIL-1T е показано на Фигура 3C. Този анализ показва, че въпреки че ASxL5T има пълен метаболитен път на сяра и азот, T. oleiverans MIL-1T не го прави. За разлика от това, T. oleiverans MIL-1T има пълен метаболитен път на цистеин и метионин, но той е непълен в ASxL5T. Следователно, ASxL5T има характерен модул за асимилация на сулфат (дефиниран като набор от гени, които могат да се използват като фенотипни маркери, като метаболитен капацитет или патогенност; https://www.genome.jp/kegg/module.html) В T оливеранс MIL-1T. Сравняването на генното съдържание на ASxL5T със списъка от гени, които предполагат хищнически начин на живот, е неубедително. Въпреки че генът waaL, кодиращ лигазата, свързана с О антигенния полизахарид към ядрото, присъства в генома ASxL5T (но е често срещан в много грам-отрицателни бактерии), гените на триптофан 2,3-диоксигеназа (TDO) могат да включват 60 амино киселинни области, често срещани в хищнически бактерии, които не присъстват. Няма други хищнически характерни гени в генома ASxL5T, включително тези, кодиращи ензими, участващи в изопреноидния биосинтез в мевалонатния път. Имайте предвид, че няма транскрипционен регулаторен ген gntR в изследваната група хищници, но три gntR-подобни гена могат да бъдат идентифицирани в ASxL5T.
Фенотипните характеристики на ASxL5T са обобщени в таблица 3 и сравнени с фенотипните характеристики на свързаните родове 23, 24, 25, 26 и 27, докладвани в литературата. Изолатите от T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis и Oceanobacter kriegii са активни, устойчиви на сол, оксидаза-положителни пръчковидни тела, но нямат почти никакви други фенотипни характеристики с ASxL5T. Средното pH на океана е 8,1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77), което е отразено в T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis и O. криегии. ASxL5T е подходящ за по-широк диапазон на pH (4-9), типичен за неморски видове. Фенотипни характеристики на Thalassolituus sp. C2-1. неизвестен Температурният диапазон на растеж на ASxL5T обикновено е по-широк от този на морските щамове (4–42 °C), въпреки че някои, но не всички изолати на T. marinus са устойчиви на топлина. Невъзможността за отглеждане на ASxL5T в бульонна среда предотврати по-нататъшно фенотипно характеризиране. Използвайте API 20E, за да тествате материалите, изстъргани от BA плочата, ONPG, аргинин дихидролаза, лизин декарбоксилаза, орнитин декарбоксилаза, използване на цитрат, уреаза, триптофан деаминаза, ензим за хидролиза на желатин, всички резултати от теста бяха отрицателни, но без индол, ацетоин и H2S бяха произведени. Неферментиралите въглехидрати включват: глюкоза, маноза, инозитол, сорбитол, рамноза, захароза, мелибиоза, амигдалин и арабиноза. В сравнение с публикуваните свързани референтни щамове, профилът на клетъчните мастни киселини на щама ASxL5T е показан в таблица 4. Основните клетъчни мастни киселини са C16:1ω6c и/или C16:1ω7c, C16:0 и C18:1ω9. Хидрокси мастни киселини C12:0 3-OH и C10:0 3-OH също съществуват. Съотношението C16:0 в ASxL5T е по-високо от отчетената стойност на свързаните родове. За разлика от това, в сравнение с докладвания T. marinus IMCC1826TT, съотношението на C18:1ω7c и/или C18:1ω6c в ASxL5T е намалено. oleivorans MIL-1T и O. kriegii DSM 6294T, но не е открит в B. sanyensis KCTC 32220T. Сравняването на профилите на мастни киселини на ASxL5T и ASxLS разкрива фини разлики в количеството на отделните мастни киселини между двата щама, които са в съответствие с геномната ДНК последователност на същия вид. Не са открити частици поли-3-хидроксибутират (PHB) с помощта на черен тест на Судан.
Хищническата активност на бактериите ASxL5T беше изследвана, за да се определи обхватът на плячката. Тази бактерия може да образува плаки върху видове Campylobacter, включително: Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T; Escherichia coli NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; C lari NCTC 11458 и C. upsaliensis NCTC 11541T. Използвайте културите, изброени в раздела за определяне на обхвата на гостоприемника на метода, за да тествате по-широк диапазон от Грам-отрицателни и Грам-положителни бактерии. Резултатите показват, че ASxL5T може да се използва и при Escherichia coli NCTC 86 и Citrobacter freundii NCTC 9750T. Плаки, образувани върху Klebsiella oxytoca 11466. TEM взаимодействието с E. coli NCTC 86 е показано на Фигура 4A-D, а взаимодействието с Campylobacter jejuni PT14 и Campylobacter suis S12 е показано на Фигура 4E-H в средата. Механизмът на атака изглежда е различен между изследваните типове плячка, с една или повече клетки на Е. coli, прикрепени към всяка клетка ASxL5T и разположени странично по протежение на удължената клетка преди адсорбция. Обратно, изглежда, че ASxL5T се прикрепя към Campylobacter чрез една точка на контакт, обикновено в контакт с върха на клетката на хищника и близо до върха на клетката Campylobacter (Фигура 4H).
TEM, показващ взаимодействието между ASx5LT и плячка: (AD) и E. coli плячка; (EH) и C. jejuni плячка. (A) Типична клетка ASx5LT, свързана с единична клетка на E. coli (EC); (B) Нишковиден ASx5LT, прикрепен към единична EC клетка; (C) Нишковидна ASx5LT клетка, свързана с множество EC клетки; (D) Прикрепване на по-малки ASx5LT клетки към единична клетка на Е. coli (EC); (E) единична ASx5LT клетка, свързана с клетка на Campylobacter jejuni (CJ); (F) ASx5LT атакува клетки на C. hyointestinalis (CH); (G) две Една ASx5LT клетка атакува CJ клетка; (H) Изглед отблизо на точката на закрепване ASx5LT, близо до върха на CJ клетката (лента 0,2 μm). Лентата представлява 1 μm в (A–G).
Хищните бактерии са еволюирали, за да се възползват от изобилните източници на плячка. Очевидно те присъстват широко в много различни среди. Поради малкия размер на членовете на популацията е възможно да се изолират ASxL5T бактерии от суспензията, като се използва методът за разделяне на фаги. Геномното значение на ASxL5T за членовете на семейството на морските бактерии oceanospirillaceae е изненадващо, въпреки че организмът е устойчив на сол и може да расте в среда, съдържаща 5% сол. Анализът на качеството на водата в суспензията показа, че съдържанието на натриев хлорид е по-малко от 0,1%. Следователно калта е далеч от морската среда - както географски, така и химически. Наличието на три свързани, но различни изолати от един и същ източник е доказателство, че тези хищници процъфтяват в тази неморска среда. В допълнение, анализ на микробиома (файлове с данни, налични от https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990) показа, че същата 16S rRNA генна последователност се намира в топ 50 на най-разпространените оперативни таксони (OTU ) В няколко интервала на вземане на проби от калта. Няколко некултивирани бактерии бяха открити в базата данни на Genbank, които имат 16S rRNA генни последователности, подобни на ASxL5T бактерии. Тези последователности, заедно с последователностите на ASxL5T, ASxS5 и ASxO5, изглежда представляват различни клади, отделени от Thalassolituus и Oceanobacter (Фигура 2). Три вида некултивирани бактерии (GQ921362, GQ921357 и GQ921396) бяха изолирани от водата на пукнатина на дълбочина 1,3 километра в южноафриканската златна мина през 2009 г., а другите два (DQ256320 и DQ337006) бяха от подпочвените води (също в Южна Африка). през 2005 г.). Генната последователност 16S rRNA, която е най-тясно свързана с ASxL5T, е част от генната последователност 16S rRNA, получена от културата за обогатяване на пясъчни седименти, получени от плажовете на Северна Франция през 2006 г. (номер за достъп AM29240828). Друга тясно свързана 16S rRNA генна последователност от некултивираната бактерия HQ183822.1 беше получена от събирателен резервоар, излужен от общинско депо за отпадъци в Китай. Очевидно бактериите ASxL5T не са силно представителни в таксономичните бази данни, но тези последователности от некултивирани бактерии вероятно представляват организми, подобни на ASxL5T, които са разпространени по целия свят, обикновено в предизвикателни среди. От филогенетичния анализ на целия геном, най-близкият роднина на ASxL5T е Thalassolituus sp. C2-1, T. marinus, T. oleivorans. И O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus е член на морската облигатна въглеводородна фрагментационна бактерия (OHCB), която е широко разпространена в морска и сухоземна среда и обикновено става доминираща след инциденти с въглеводородно замърсяване 30,31. Морските бактерии не са членове на OHCB групата, но са изолирани от морската среда.
Фенотипните данни показват, че ASxL5T е нов вид и член на неразпознат досега род в семейството на морските спироспирацеи. Понастоящем няма ясен стандарт за класифициране на новоизолирани щамове в нов род. Правени са опити да се определят универсални граници на родовете, например въз основа на процента на генома на консервативен протеин (POCP), препоръчително е граничната стойност да е 50% идентична с референтния щам33. Други предлагат да се използват стойности на AAI, които имат предимства пред POCP, тъй като могат да бъдат получени от непълни геноми34. Авторът смята, че ако стойността на AAI е по-малка от 74% в сравнение с моделния щам на моделния вид, щамът е представител на различни родове. Моделният род в морските spirillaceae е marine spirillum, а моделният щам е O. linum ATCC 11336T. Стойността на AAI между ASxL5T и O. linum ATCC 11336T е 54,34%, а стойността на AAI между ASxL5T и T. oleivorans MIL-1T (щамове от род) е 67,61%, което показва, че ASxL5T представлява нов род, различен от Thalassolituus. Използвайки генната последователност на 16S rRNA като класификационен стандарт, предложената граница на разграничаване на рода е 94,5%35. ASxL5T може да бъде поставен в род Thalassolituus, показващ 95,03% идентичност на 16S rRNA последователност с T. oleivorans MIL-1T и 96,17%. marinus IMCC1826T. Въпреки това, той също ще бъде поставен в рода Bacteroides, който има 94,64% 16S rRNA генна идентичност с B. sanyensis NV9, което показва, че използването на единичен ген като 16S rRNA ген може да доведе до произволна класификация и присвояване. Друг предложен метод използва ANI и Genome Alignment Score (AF) за изследване на групирането на точки от данни от всички видове и нетипови щамове на съществуващи родове. Авторът препоръчва комбиниране на границата на рода с инфлексната точка на оценения род, специфичен за анализираните таксони. Въпреки това, ако няма достатъчно пълни геномни последователности от изолати на Thalassolituus, е невъзможно да се определи дали ASxL5T принадлежи към рода Thalassolituus чрез този метод. Поради ограничената наличност на пълни геномни последователности за анализ, цялото филогенетично дърво на генома трябва да се тълкува с повишено внимание. Второ, методите за сравнение на целия геном не могат да обяснят съществените разлики в размера на сравняваните геноми. Те измерват сходството на запазените основни гени с едно копие между свързани родове, но не са взели предвид големия брой гени, които не присъстват в много по-малкия геном на ASxL5T. Очевидно ASxL5T и групите, включително Thalassolituus, Oceanobacter и Bacterioplanes, имат общ предшественик, но еволюцията е поела по различен път, водещ до намаляване на генома, което може да се дължи на адаптиране към хищнически начин на живот. Това е в контраст с T. oleivorans MIL-1T, който е с 28% по-голям и е еволюирал при различен натиск на околната среда, за да използва въглеводороди 23,30. Може да се направи интересно сравнение с облигатни вътреклетъчни паразити и симбионти, като Rickettsia, Chlamydia и Buchnera. Размерът на генома им е около 1 Mb. Способността да се използват метаболитите на клетката гостоприемник води до загуба на ген, така че претърпява значителна еволюционна геномна деградация. Еволюционните промени от морски химически хранителни организми към хищнически начин на живот могат да доведат до подобно намаляване на размера на генома. Анализът COG и KEGG подчертава броя на гените, използвани за специфични функции и глобалните разлики в геномните пътища между ASxL5T и T. oleivorans MIL-1T, които не се дължат на широко разпространената наличност на мобилни генетични елементи. Разликата в съотношението G + C на целия геном на ASxL5T е 56,1%, а на T. oleivorans MIL-1T е 46,6%, което също показва, че той е сегрегиран.
Изследването на кодиращото съдържание на генома ASxL5T предоставя функционална представа за фенотипните характеристики. Наличието на гени, кодиращи фимбрии тип IV (Tfp), е от особен интерес, тъй като те насърчават движението на клетките, наречено социално плъзгане или конвулсии, без флагели на повърхността. Според докладите Tfp има други функции, включително хищничество, патогенеза, образуване на биофилм, естествено усвояване на ДНК, автоматично клетъчно агрегиране и развитие38. Геномът ASxL5T съдържа 18 гена, кодиращи дигуанилат циклаза (ензим, който катализира превръщането на 2 гуанозин трифосфат в гуанозин 2 фосфат и цикличен diGMP) и 6 гена, кодиращи съответния дигуанилат циклаза фосфат дигуанилат. Генът за естераза (катализира разграждането на цикличния ди-GMP до гуанозин монофосфат) е интересен, тъй като cycl-di-GMP е важен втори пратеник, участващ в развитието и отделянето на биофилма, движението, клетъчното прикрепване и вирулентността 39, 40 в процеса. Трябва също да се отбележи, че при Bdellovibrio bacteriovorus е доказано, че цикличният двоен GMP контролира прехода между свободен живот и хищнически начин на живот41.
Повечето изследвания върху хищните бактерии са фокусирани върху Bdellovibrio, Bdellovibrio-подобни организми и Myxococcus видове. Тези и други известни примери за хищнически бактерии образуват разнообразна група. Въпреки това разнообразие, набор от характерни протеинови семейства, които отразяват фенотипа на 11 известни хищнически бактерии, са идентифицирани 3, 22. Идентифицирани са обаче само гени, кодиращи О антиген лигаза (waaL), което е особено често срещано при Грам-отрицателни бактерии. Тази форма на анализ не е полезна при определянето на ASxL5T като хищник, вероятно защото използва нова стратегия за атака. Наличието на по-разнообразни хищнически бактериални геноми ще помогне за разработването на анализи с по-фина разделителна способност, които вземат предвид доказателства за функционални и екологични различия между членовете на групата. Примери за хищнически бактерии, които не са включени в този анализ, включват членовете на Cupriavidus necator42 и Bradymonabacteria43, защото докато изследователите изследват различни микробни общности, се установяват повече хищнически таксони.
Най-забележителната характеристика на ASxL5T бактериите, заснети от TEM изображение, е неговата уникална и гъвкава морфология, която може да насърчи взаимодействието с плячка бактерии. Видът на наблюдаваното взаимодействие е различен от този на други хищни бактерии и не е бил открит или докладван досега. Предложеният хищнически жизнен цикъл на ASxL5T е показан на Фигура 5. Има няколко примера в литературата с подобни апикални структури, както ние докладваме тук, но тези примери включват Terasakiispira papahanaumokuakeensis, морска спирилална бактерия със случайно разширение на върха 44 и Alphaproteobacteria, Terasakiella pusilla , по-рано принадлежащи към род Oceanospirillum, проявяващ така наречения "полярен филм" 45. Cocci формите често се наблюдават в по-стари култури, особено за бактерии с извити форми, като Vibrio, Campylobacter и Helicobacter 46, 47, 48, които могат да представляват влошено състояние. Необходима е допълнителна работа за изясняване на точния жизнен цикъл на бактериите ASxL5T. Да се ​​определи как улавя и плячка и дали геномът му кодира биологично активни съединения, които могат да се използват за медицински или биотехнологични цели.
Описание на Venatorbacter gen. Ноември Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. е съставен от венатори от L. n. venator, „ловец“ и Gr. n. bacter, „пръчка“. Venatorbacter, „ловна пръчица“ Клетките са аеробни, оцветени по Грам, активността на каталазата и оксидазата не се натрупват Температурен диапазон от 4 до 42 °C Врастналият диапазон на рН от 4-9 е необичаен. C18:1ω9; C12:0 3-OH и C10:0 3-OH се намират като хидрокси мастни киселини не растат в бульонна среда Съдържанието на ДНК G + C е 56,1% членовете на този род показват резистентност към Campylobacter. Филогенетичната позиция на този род е в семейството.
Описание на Venatorbacter cucullus sp. ноември Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus означава обтекател).
В допълнение, описателната характеристика на този род е, че когато се отглеждат върху BA или BHI, клетките са 1,63 µm дълги и 0,37 µm широки. Колониите върху BHI агар са много малки, достигайки 2 mm в диаметър след 72 часа. Те са бежови, полупрозрачни, кръгли, изпъкнали и лъскави. Представителите на този вид могат да използват ешерихия коли и клебсиела. Campylobacter и няколко други грам-отрицателни бактерии служат като плячка.
Типичният щам ASxL5T е изолиран от говеждо мляко в Нотингамшир, Обединеното кралство, и е депозиран в Националната колекция от типови култури (Обединеното кралство): номер за достъп NCTC 14397 и колекцията за бактериални култури в Холандия (NCCB) номер за достъп NCCB 100775. Пълната геномна последователност на ASxL5T е депозиран в Genbank съгласно допълнението CP046056.
Бактериите ASxL5T бяха изолирани от говеждо мляко с помощта на технология за изолиране на фаги9,49. Суспензията се разрежда 1:9 (w/v) в SM буфер (50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 0.1 M NaCl, 8 mM MgSO4.7H2O и 0.01% желатин; Sigma Aldrich, Gillingham, UK), след това се инкубира при 4°C за 24 часа, като се върти бавно за елуиране хищници в буфера. Суспензията се центрофугира при 3000 g за 3 минути. Супернатантата се събира и центрофугира при 13 000 g за втори път в продължение на 5 минути. След това супернатантата се прекарва през 0.45 µm мембранен филтър (Minisart; Sartorius, Gottingen, Германия) и 0.2 µm мембранен филтър (Minisart), за да се отстранят всички останали бактериални клетки. ASxL5T може да премине тези филтри. Мека агарна тревна площ от Campylobacter enterosus S12 (NCBI номер за достъп CP040464) от същата суспензия се приготвя, като се използват стандартни техники. Филтрираната суспензия се разпределя върху всяка от тези плочи с клетки гостоприемници в 10 ul капчици в три екземпляра и се оставя да изсъхне. Плаката се инкубира в микроаерофилен резервоар при 37°С в продължение на 48 часа при микроаеробни условия (5% О2, 5% Н2, 10% СО2 и 80% N2). Получената видима плака се екстрахира в SM буфер и се прехвърля в прясна морава на C. hyointestinalis S12 за по-нататъшно размножаване на лизираните организми. След като се установи, че бактерията е причината за литичната плака, а не фагът, опитайте се да отгледате организма независимо от гостоприемника и да го характеризирате допълнително. Аеробната култура се извършва при 37 °C с 5% v/v дефибринирана конска кръв (TCS Biosciences Lt, Бъкингам, Обединеното кралство, допълнение). Съгласно насоките на Националния комитет по клинични стандарти, методът на дисковата дифузия се използва за тестване на антибактериалната чувствителност. BHI агар се култивира при 37 °C с помощта на диск, съдържащ следните антибиотици (Oxoid) за аеробна култура: амоксицилин и клавуланова киселина 30 µg; цефотаксим 30 µg; стрептомицин 10 µg; ципрофлоксацин 5 µg; Цефтазидим 30 µg Налидиксова киселина 30 µg; Имипенем 10 µg; Азитромицин 15 µg; Хлорамфеникол 30 µg; Цефокситин 30 µg; Тетрациклин 30 µg; Нитрофурантоин 300 µg; Азтреонам 30 µg; ампицилин 10 µg; Цефподоксим 10 µg; Триметоприм-сулфаметоксазол 25 µg. Устойчивостта на сол се установява чрез аеробна инкубация върху BHI агарови плаки при 37 °C. Допълнителен NaCl беше добавен към BHI агарните плаки, за да се осигури обхват на концентрация до 10% w/v. Диапазонът на рН се определя чрез аеробна култура върху плочи с BHI агар при 37°C, където диапазонът на рН е коригиран до между 4 и 9 със стерилна HCl или стерилна NaOH и целевата стойност на рН се проверява преди изливане на блюдото. За анализ на клетъчни мастни киселини, ASxL5T се култивира върху BHI агар за 3 дни и аеробно при 37 °C. Съгласно MIDI (Sherlock Microbial Identification System, версия 6.10) стандартен протокол на FERA Science Ltd, (Йорк, Обединеното кралство), клетъчните мастни киселини бяха извлечени, приготвени и анализирани.
За ТЕМ, ASxL5T се култивира аеробно чрез равномерно разпръскване върху BA при 37°C за 24 часа и след това се събира в 1 ml 3% (обем/обем) глутаралдехид в 0,1 М какодилатен буфер при стайна температура Фиксира се за 1 час, след което се центрофугира при 10 000 g за 3 минути. След това внимателно ресуспендирайте пелетата в 600 μl 0,1 М какодилатен буфер. Прехвърлете фиксираната ASxL5T суспензия върху Formvar/въглероден филм върху медна решетка с размери 200 меша. Бактериите се оцветяват с 0,5% (w/v) уранил ацетат за 1 минута и се изследват чрез TEM с помощта на микроскоп TEI Tecnai G2 12 Biotwin. Както бе споменато по-горе, комбинирайте същия брой плячка и хищник в NZCYM бульон (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) и инкубирайте в продължение на 48 часа при микроаеробни условия на Campylobacter или Campylobacter при 37°C, взаимодействието на хищник и плячка е прегледан и от ТЕЛК. Аеробни условия за ешерихия коли. Независимо изследвайте плячката и хищните бактерии, за да определите всички промени в клетъчната морфология, дължащи се на хищничество. Суданският черен метод беше използван за оптична микроскопия на натрупване на PHB.
Отглеждайте култури ASxL5T за една нощ, като намажете растежа върху BHI или BA плаки със стерилен тампон. Съберете ASxL5T клетки и ги суспендирайте в MRD (CM0733, Oxoid) и след това ги поставете при 4°C за 7 дни, за да гладувате клетките. NCTC референтната или лабораторна изходна бактериална култура се инокулира в BHI бульон или хранителен бульон № 2 (CM007, Oxoid), инкубира се за една нощ, центрофугира се при 13 000 g и се ресуспендира в MRD, докато OD600 стане 0,4. Култура: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, Klebsiella oxytoca 11466, Leuconostoc NCTC 10817, Listeria Специални бактерии NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, Rhodococcus submarine hamburger NCTC 1621T, Salmonella чревни бактерии Mondeville NCTC 5747, клей NCTC 10861, Staphylococcus aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. Гостоприемникът Campylobacter беше микроаеробно инкубиран върху BA плаки при 37°C и суспендиран в NZCYM бульон. Тестваните гостоприемници на Campylobacter са: C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11458, C. lari NCTC 11458, C. jejuni PT14, C... Съберете клетки в MRD, центрофугирайте при 13 000 g и ресуспендирайте в MRD, докато OD600 стане 0,4. Добавете аликвотна част от 0,5 ml суспензия към 5 ml разтопен NZCYM горен агар (0,6% агар) и го изсипете върху 1,2% NZCYM долна чиния. След втвърдяване и изсушаване, серийно разреденият ASxL5T се разпределя като 20 µl капчици върху всяка тревна дъска в три екземпляра. Температурата и атмосферата на културата зависят от изискванията на тестовите бактерии.
Използвайте GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma Aldridge), за да подготвите ДНК от бактериални изолати. Бяха използвани стандартни методи за PCR амплификация на 16S rRNA ген и определяне на последователността на продукта, използвайки химия за терминиране на багрилото (Eurofins Value Read Service, Германия). Използвайте програмата BLAST-N, за да сравните тези последователности с други 16S rRNA генни последователности, за да идентифицирате и съберете тясно свързани видове. Те са подравнени с помощта на ClustalW в програмата MEGA X. Филогенетичното дърво беше реконструирано с помощта на MEGA X, използвайки метода на максималната вероятност, базиран на модела Tamura-Nei, с 1000 ръководени копия54. Използвайте PureLink™ Genomic DNA Kit (Fisher Scientific, Loughborough, UK), за да извлечете ДНК за секвениране на целия геном. Последователността на генома на ASxL5T се определя с помощта на комбинацията Illumina MiSeq, която се състои от 250 bp двустранни четения, съставени от библиотека, приготвена с помощта на комплекта за маркиране Nextera и 2 до 20 kb дълги четения от платформата PacBio. Изследователски център за геномно ДНК секвениране в университета Сембия. Геномът беше сглобен с помощта на CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen, Aarhus, Дания). Културите ASxL5T се депозират в Националната колекция от типови култури (Обединеното кралство) и Холандската колекция от бактериални култури (NCCB). Геномите на сродни организми, използвани за сравнение, са: Thalassolituus oleivorans MIL-1T (номер за достъп HF680312, пълен); Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (номер за достъп BMYY01000001, непълен); Oceanobacter kriegii DSM 6294T (номер за достъп NZ_AUGV00000000, непълен); Marinamonas community DSM 5604T (добавен ASM436330v1, непълен), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (добавен MTSD02000001, непълен) и Thalassolituus sp. C2-1 (добавете NZ_VNIL01000001, непълно). Използвайте JGI Genome Portal36 на https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page=, за да определите резултата за подравняване (AF) и средната идентичност на нуклеинова киселина (ANI). По двойки. Методът на Rodriguez-R & Konstantinidis55 беше използван за определяне на аминокиселинната идентичност (AAI). Използвайте GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18, за да генерирате приблизително филогенетично дърво с максимална вероятност. Входящият геном, представляващ наличния референтен геном, е избран от референтни родове, идентифицирани като свързани с ASxL5T от 16S rRNA филогенеза. Анотира дървото с помощта на онлайн инструмента за интерактивно дърво на живота (https://itol.embl.de/). Функционалната анотация и анализ на генома ASxL5T се извършва с помощта на онлайн инструмента BlastKOALA KEGG, като се използва разпределението на обогатяване на модула KEGG (Киото Енциклопедия на гените и геномите). Разпределението на категориите COG (ортологични групи) се определя с помощта на онлайн инструмента eggNOG-mapper.
Pérez, J., Moraleda-Muñoz, A., Marcos-Torres, FJ и Muñoz-Dorado, J. Бактериално хищничество: 75 години и то продължава! . среда. микроорганизъм. 18, 766–779 (2016).
Linares-Otoya, L. и др. Разнообразие и антибактериален потенциал на хищни бактерии по перуанското крайбрежие. Мартенски наркотици. 15. E308. https://doi.org/10.3390/md15100308 (2017).
Пастернак, З. и др. Чрез техните гени ще ги разберете: геномните характеристики на хищните бактерии. ISME J. 7, 756–769 (2013).
Sockett, RE Хищническият начин на живот на бактериофага Bdellovibrio. инсталирайте. Пастор микроби. 63, 523–539 (2009).
Korp, J., Vela Gurovic, MS & Nett, M. Антибиотици от хищни бактерии. Beilstein J. Хистохимия 12, 594–607 (2016).
Johnke, J., Fraune, S., Bosch, TCG, Hentschel, U. & Schulenburg, H. Bdellovibrio и подобни организми са предиктори на микробиомното разнообразие в различни популации гостоприемници. микроорганизъм. Екология. 79, 252–257 (2020).
Vila, J., Moreno-Morales, J. и Ballesté-Delpierre, C. Открийте текущото състояние на новите антибактериални средства. клинични. микроорганизъм. заразявам. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2019.09.015 (2019).
Hobley, L. et al. Двойното хищничество на фаг и фаг може да унищожи плячката на E. coli без едно хищничество. J. Бактерии. 202, e00629-19. https://doi.org/10.1128/JB.00629-19 (2020).
El-Shibiny, A., Connerton, PL & Connerton, IF Броят и разнообразието на Campylobacter и бактериофаги, изолирани по време на цикъла на хранене на свободно отглеждани и органични пилета. Приложна среда. микроорганизъм. 71, 1259–1266 (2005).
Wilkinson, DA и т.н. Актуализиране на геномната таксономия и епидемиология на Campylobacter свине. наука. Представител 8, 2393. https://doi.org/10.1038/s41598-018-20889-x (2018).
Lee, MD GToTree: Удобен за потребителя работен процес за системна геномика. Биоинформатика 35, 4162–4164 (2019).
Edgar, RC MUSCLE: Метод за подравняване на множество последователности, който намалява сложността на времето и пространството. BMC биологична информация. 5, 113 (2004).
Capella-Gutiérrez, S., Silla-Martínez, JM & Gabaldón, T. TrimAl: Инструмент за автоматично подравняване и подрязване в широкомащабен филогенетичен анализ. Биоинформатика 25, 1972–1973 (2009).
Hyatt, D., LoCascio, PF, Hauser, LJ & Uberbacher, EC ген и прогнозиране на началното място за транслация на метагеномна последователност. Биоинформатика 28, 2223-2230 (2012).
Shen, W. & Xiong, J. TaxonKit: Междуплатформен и ефективен инструментариум за класификация на NCBI. Био Rxiv. (Достъп на 1 юни 2021 г.); https://www.biorxiv.org/content/10.1101/513523v1 (2019).
Price, MN, Dehal, PS & Arkin, AP FastTree 2-приблизително дърво на максималната вероятност с голямо подравняване. PLoS One 5, e9490 (2010).
Tange, O. GNU Parallel. (Достъп на 1 юни 2021 г.); https://zenodo.org/record/1146014#.YOHaiJhKiUk (2018).
Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: Киото Енциклопедия на гените и геномите. Изследване на нуклеинова киселина. 28, 27-30 (2000).
Чехия, L. и др. Ролята на екстремолитите ектоин и хидроксиектоин като протектори на стреса и хранителни вещества: генетика, системна геномика, биохимия и структурен анализ. Ген (Базел). 9. E177. https://doi.org/10.3390/genes9040177 (2018).
Gregson, BH, Metodieva, G., Metodiev, MV, Golyshin, PN & McKew, BA Диференциална протеинова експресия по време на растежа на облигатната морска въглеводородно-разграждаща бактерия Thalassolituus oleivorans MIL-1 по време на растежа на алкани със средна и дълга верига. отпред. микроорганизъм. 9, 3130 (2018).
Pasternak, Z., Ben Sasson, T., Cohen, Y., Segev, E. и Jurkevitch, E. Нов сравнителен геномичен метод за определяне на фенотипно-специфични показатели разкрива специфично наследство в марката на хищнически бактерии. Публична научна библиотека едно. 10. e0142933. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142933 (2015).
Якимов, М. М. и др. Thalassolituus oleivorans ген. ноември, сп. nov., нов вид морски бактерии, специализирани в използването на въглеводороди. интернационалност. J. Система. еволюция. микроорганизъм. 54, 141–148 (2004).
Wang, Y., Yu, M., Liu, Y., Yang, X. & Zhang, XH Bacterioplanoides pacificum gen. ноември, сп. През ноември той се отдели от морската вода, циркулираща в южната част на Тихия океан. интернационалност. J. Система. еволюция. микроорганизъм. 66, 5010–5015 (2016).