Un nou tipus de bacteris gramnegatius, aeròbics, tolerants a la sal, actius, en forma de vareta i depredadors ASxL5T es va aïllar d'un estany de fem de vaca a Nottinghamshire, Anglaterra, i va utilitzar Campylobacter com a presa. Posteriorment, es van descobrir com a preses altres espècies de Campylobacter i membres de la família Enterobacteriaceae. Després del subcultiu sense cèl·lules hoste, es va aconseguir un creixement asèptic feble en Brain Heart Infusion Agar. Les condicions òptimes de creixement són 37 °C i el pH és de 7. La microscòpia electrònica de transmissió va revelar algunes característiques morfològiques molt inusuals relacionades amb la disponibilitat de preses. L'anàlisi filogenètica utilitzant la seqüència del gen 16S rRNA va indicar que l'aïllat està relacionat amb un membre de la família de l'espirulina marina, però no es pot classificar clarament com a membre de cap gènere conegut. La seqüenciació de tot el genoma d'ASxL5T va confirmar la relació amb els membres de les espiroquetes marines. Una cerca a la base de dades va revelar que diversos ASxL5T comparteixen seqüències del gen 16S rRNA amb diversos bacteris no cultivats de l'oceà, la superfície terrestre i les aigües subterrànies. Suggerim que la soca ASxL5T representi una nova espècie en un nou gènere. Recomanem el nom Venatorbacter cucullus gen. novembre, sp. Al novembre, es va utilitzar ASxL5T com a soca tipus.
Els bacteris depredadors són bacteris que mostren la capacitat de caçar i matar altres bacteris vius per obtenir materials biosintètics i energia. Això és diferent de la recuperació general de nutrients dels microorganismes morts, i també és diferent de les interaccions paràsits, en què els bacteris formen una estreta relació amb el seu hoste sense matar-los. Els bacteris depredadors han desenvolupat diferents cicles de vida per aprofitar les fonts d'aliment abundants als nínxols on es troben (com els hàbitats marins). Són un grup taxonòmicament divers, que només estan connectats pel seu cicle de vida d'esterilització únic1. S'han trobat exemples de bacteris depredadors en diversos phyla diferents, incloent: Proteobacteris, Bacteroides i Chlorella.3. Tanmateix, els bacteris depredadors més ben estudiats són els organismes Bdellovibrio i Bdellovibrio i similars (BALOs4). Els bacteris depredadors són una font prometedora de nous compostos biològicament actius i agents antibacterians5.
Es creu que els bacteris depredadors milloren la diversitat microbiana i tenen un impacte positiu en la salut, la productivitat i l'estabilitat de l'ecosistema6. Malgrat aquests atributs positius, hi ha pocs estudis sobre nous bacteris depredadors a causa de la dificultat de cultivar bacteris i la necessitat d'observar acuradament les interaccions cel·lulars per entendre els seus cicles vitals complexos. Aquesta informació no és fàcil d'obtenir de l'anàlisi informàtica.
En una era d'augment de la resistència antimicrobiana, s'estan estudiant noves estratègies per dirigir-se als patògens bacterians, com ara l'ús de bacteriòfags i bacteris depredadors7,8. Els bacteris ASxL5T es van aïllar l'any 2019 mitjançant la tecnologia d'aïllament de fags a partir de fems de vaca recollits del Dairy Center de la Universitat de Nottingham, Nottinghamshire. L'objectiu de la investigació és aïllar organismes amb potencial com a agents de control biològic. Campylobacter hyointestinalis és un patogen zoonòtic, que s'associa cada cop més amb malalties intestinals humanes10. És omnipresent al sèrum i s'utilitza com a hoste objectiu.
El bacteri ASxL5T es va aïllar de la gelatina de vedella perquè es va observar que les plaques que formava a la gespa de C. hyointestinalis eren similars a les produïdes pels bacteriòfags. Aquesta és una troballa inesperada, perquè part del procés d'aïllament del fag implica filtrar a través d'un filtre de 0,2 µm, que està dissenyat per eliminar cèl·lules bacterianes. L'examen microscòpic del material extret de la placa va revelar que els petits bacteris gramnegatius en forma de vareta corbada no van acumular polihidroxibutirat (PHB). El cultiu asèptic independent de les cèl·lules de presa es realitza en un medi sòlid ric (com l'agar d'infusió de cor cerebral (BHI) i l'agar de sang (BA)), i el seu creixement és feble. S'obté després del subcultiu amb millora d'inòcul pesat. Creix igual de bé en condicions microaeròbiques (7% v/v d'oxigen) i d'oxigen atmosfèric, però no en una atmosfera anaeròbica. Passades 72 hores, el diàmetre de la colònia era molt petit, arribant als 2 mm, i era beix, translúcid, rodó, convex i brillant. Les proves bioquímiques estàndard es veuen obstaculitzades perquè ASxL5T no es pot cultivar de manera fiable en medis líquids, cosa que suggereix que pot dependre del complex cicle de vida de la formació de biofilm. Tanmateix, la suspensió de plaques va demostrar que ASxL5T és aeròbic, positiu per a l'oxidasa i catalasa i pot tolerar un 5% de NaCl. ASxL5T és resistent a 10 µg d'estreptomicina, però és sensible a tots els altres antibiòtics provats. Les cèl·lules bacterianes ASxL5T van ser examinades per TEM (figura 1). Quan es cultiven sense cèl·lules de presa a la BA, les cèl·lules ASxL5T són Campylobacter petites, amb una longitud mitjana d'1,63 μm (± 0,4), una amplada de 0,37 μm (± 0,08) i un sol pol llarg (fins a 5 μm). Flagels sexuals. Aproximadament l'1,6% de les cèl·lules sembla tenir una amplada inferior a 0,2 μm, cosa que permetrà el pas a través del dispositiu de filtre. Es va observar una extensió estructural inusual a la part superior d'algunes cèl·lules, semblant a un carenat (cucullus llatí) (vegeu les fletxes a 1D, E, G). Sembla que es compon d'un excés de membrana externa, que pot ser degut a la ràpida reducció de la mida de l'embolcall periplasmàtic, mentre que la membrana externa es manté intacta, mostrant un aspecte "solt". El cultiu d'ASxL5T en absència de nutrients (en PBS) durant molt de temps a 4 ° C va donar lloc a que la majoria de cèl·lules (però no totes) mostressin una morfologia còccica (figura 1C). Quan ASxL5T creix amb Campylobacter jejuni com a presa durant 48 hores, la mida mitjana de les cèl·lules és significativament més llarga i més estreta que les cèl·lules cultivades sense hoste (taula 1 i figura 1E). En canvi, quan l'ASxL5T creix amb E. coli com a presa durant 48 hores, la mida mitjana de la cèl·lula és més llarga i ampla que quan creix sense presa (taula 1), i la longitud cel·lular és variable, generalment mostrant filamentosa (figura 1F). Quan es van incubar amb Campylobacter jejuni o E. coli com a presa durant 48 hores, les cèl·lules ASxL5T no van mostrar cap flagel. La taula 1 resumeix les observacions dels canvis en la mida de la cèl·lula en funció de la presència, absència i tipus de presa d'ASxL5T.
Visualització TEM d'ASx5LT: (A) ASx5LT mostra un fuet llarg; (B) bateria ASx5LT típica; (C) cèl·lules cocci ASx5LT després d'una llarga incubació sense nutrients; (D) un grup de cèl·lules ASx5LT mostra anormalitat (E) El grup de cèl·lules ASx5LT incubades amb preses de Campylobacter va mostrar un augment de la longitud cel·lular en comparació amb aquelles sense creixement de preses (D) també va mostrar estructura apical; (F) Flagels filamentosos grans, cèl·lules ASx5LT, després de la incubació amb presa d'E. coli; (G) Una única cèl·lula ASx5LT després de la incubació amb E. coli, que mostra una estructura superior inusual. La barra representa 1 μm.
La determinació de la seqüència del gen de l'ARNr 16S (número d'adhesió MT636545.1) permet que les cerques de bases de dades establisquen seqüències similars a les de la classe Gammaproteobacteria, i que són els més propers als bacteris marins de la família dels espirillums (figura 2) i són membres del gènere Thalassolituus. El parent més proper al bacil marí. La seqüència del gen 16S rRNA és clarament diferent dels bacteris depredadors que pertanyen a la família Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria). Les comparacions per parelles de B. bacteriovorus HD100T (tipus de soca, DSM 50701) i B. bacteriovorus DM11A van ser del 48,4% i del 47,7%, i per a B. exovorus JSS va ser del 46,7%. Els bacteris ASxL5T tenen 3 còpies del gen de l'ARNr 16S, dues de les quals són idèntiques entre elles, i la tercera està separada per 3 bases. Altres dos aïllats de bacteris depredadors (ASx5S i ASx5O; els números d'adhesió del gen rRNA 16S són MT636546.1 i MT636547.1, respectivament) amb característiques morfològiques i fenotípiques similars de la mateixa ubicació no són els mateixos, però són diferents de l'ASxL5T i el bacteri no cultivat. les seqüències de bases de dades s'agrupen amb altres gèneres a Oceanospirillaceae (figura 2). S'ha determinat i desat tota la seqüència del genoma d'ASxL5T a la base de dades NCBI i el número d'accés és CP046056. El genoma d'ASxL5T consta d'un cromosoma circular de 2.831.152 pb amb una relació G + C del 56,1%. La seqüència del genoma conté 2653 CDS (total), dels quals es preveu que 2567 codifiquen proteïnes, dels quals 1596 es poden assignar com a funcions putatives (60,2%). El genoma conté 67 gens que codifiquen ARN, inclosos 9 ARNr (3 cadascun per a 5S, 16S i 23S) i 57 ARNt. Les característiques genòmiques d'ASxL5T es van comparar amb els genomes disponibles de soques del tipus relatiu més proper identificats a partir de la seqüència del gen 16S rRNA (taula 2). Utilitzeu la identitat d'aminoàcids (AAI) per comparar tots els genomes de Thalassolituus disponibles amb ASxL5T. La seqüència del genoma disponible (incompleta) més propera determinada per AAI és Thalassolituus sp. C2-1 (afegiu NZ_VNIL01000001). Aquesta soca es va aïllar dels sediments de les profunditats marines de la fossa de les Mariannes, però actualment no hi ha informació fenotípica sobre aquesta soca per a la seva comparació. En comparació amb els 2,82 Mb d'ASxL5T, el genoma de l'organisme és més gran amb 4,36 Mb. La mida mitjana del genoma de les espiroquetes marines és d'uns 4,16 Mb (± 1,1; n = 92 genomes de referència complets investigats a https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), de manera que el genoma d'ASxL5T està en línia amb el ordre En comparació amb els altres membres, és bastant petit. Utilitzeu GToTree 1.5.54 per generar un arbre filogenètic de màxima probabilitat estimat basat en el genoma (figura 3A), utilitzant les seqüències d'aminoàcids alineades i enllaçades de 172 gens d'una còpia específica de Gammaproteobacteria 11,12,13,14,15,16, 17,18. L'anàlisi va demostrar que està estretament relacionat amb Thalassolituus, Bacterial Plane i Marine Bacterium. Tanmateix, aquestes dades indiquen que ASxL5T és diferent dels seus parents a l'espirulina marina i les dades de la seva seqüència del genoma estan disponibles.
L'arbre filogenètic que utilitza la seqüència del gen 16S rRNA destaca la posició de les soques ASxL5T, ASxO5 i ASxS5 (amb les tripes) en relació amb les soques de bacteris no cultivades i marines a les Spirulinaceae marines. El número d'adhesió de Genbank segueix el nom de la soca entre parèntesis. Utilitzeu ClustalW per alinear seqüències i utilitzeu el mètode de màxima probabilitat i el model Tamura-Nei per inferir relacions filogenètiques i realitzeu 1000 rèpliques guiades al programa MEGA X. El número de la branca indica que el valor de còpia guiada és superior al 50%. Escherichia coli U/541T es va utilitzar com a grup extern.
(A) Un arbre filogenètic basat en el genoma, que mostra la relació entre el bacteri marí Spirospiraceae ASxL5T i els seus parents propers, E. coli U 5/41T com a grup extern. (B) En comparació amb T. oleivorans MIL-1T, la distribució de la categoria funcional dels gens es preveu en funció del grup ortòleg (COG) de la proteïna ASx5LT. La figura de l'esquerra mostra el nombre de gens de cada categoria de COG funcional de cada genoma. El gràfic de la dreta mostra el percentatge de genomes continguts en cada grup COG funcional. (C) En comparació amb T. oleiverans MIL-1T, l'anàlisi de la via modular completa KEGG (Enciclopèdia de Kyoto de gens i genomes) d'ASxL5T.
L'ús de la base de dades KEGG per examinar els gens components presents al genoma ASxL5T va revelar la via metabòlica típica de la gamma aeròbica Proteus. ASxL5T conté un total de 75 gens assignats a proteïnes motrius bacterianes, inclosos els gens implicats en la quimiotaxi, el muntatge de flagels i el sistema de fímbries tipus IV. En l'última categoria, 9 de cada 10 gens són responsables del moviment de contraccions d'una sèrie d'altres organismes. El genoma d'ASxL5T conté una via biosintètica completa de tetrahidropirimidina que participa en la resposta protectora a l'estrès osmòtic20, com s'esperava per als halòfils. El genoma també conté moltes vies completes per a cofactors i vitamines, incloses les vies de síntesi de riboflavina. Tot i que el gen de l'alcà 1-monooxigenasa (alkB2) està present a ASxL5T, la via d'utilització d'hidrocarburs no està completa. A la seqüència del genoma d'ASxL5T, els homòlegs de gens identificats com els principals responsables de la degradació dels hidrocarburs en T. oleiverans MIL-1T21, com ara TOL_2658 (alkB) i TOL_2772 (alcohol deshidrogenasa) estan òbviament absents. La figura 3B mostra la comparació de la distribució gènica a la categoria COG entre ASxL5T i l'oli d'oliva MIL-1T. En general, el genoma ASxL5T més petit conté proporcionalment menys gens de cada categoria COG en comparació amb el genoma relacionat més gran. Quan el nombre de gens de cada categoria funcional s'expressa com a percentatge del genoma, s'observen diferències en el percentatge de gens en les categories de traducció, estructura ribosòmica i biogènesi, i les categories de funció de producció i conversió d'energia, que constitueixen l'ASxL5T més gran. genoma El percentatge es compara amb el mateix grup present al genoma MIL-1T de T. oleiverans. En canvi, en comparació amb el genoma ASxL5T, T. oleivorans MIL-1T té un percentatge més elevat de gens en les categories de replicació, recombinació i reparació i transcripció. Curiosament, la diferència més gran en el contingut de cada categoria funcional dels dos genomes és el nombre de gens desconeguts presents a ASxL5T (figura 3B). Es va realitzar una anàlisi d'enriquiment dels mòduls KEGG, on cada mòdul KEGG representa un conjunt d'unitats funcionals definides manualment per a l'anotació i la interpretació biològica de les dades de la seqüència del genoma. La comparació de la distribució gènica a la via completa del mòdul KOG d'ASxL5T i l'oliva MIL-1T es mostra a la figura 3C. Aquesta anàlisi mostra que tot i que ASxL5T té una via metabòlica completa del sofre i del nitrogen, T. oleiverans MIL-1T no. En canvi, T. oleiverans MIL-1T té una via metabòlica completa de la cisteïna i la metionina, però és incompleta en ASxL5T. Per tant, ASxL5T té un mòdul característic per a l'assimilació de sulfat (definit com un conjunt de gens que es poden utilitzar com a marcadors fenotípics, com la capacitat metabòlica o la patogenicitat; https://www.genome.jp/kegg/module.html) En T .oleiverans MIL-1T. La comparació del contingut gènic d'ASxL5T amb la llista de gens que suggereixen un estil de vida depredador no és concloent. Tot i que el gen waaL que codifica la lligasa associada amb el polisacàrid de l'antigen O al nucli està present al genoma ASxL5T (però és comú en molts bacteris Gram-negatius), els gens de la triptòfan 2,3-dioxigenasa (TDO) poden incloure els 60 aminoàcids. regions àcides que es troben habitualment en bacteris depredadors que no estan presents. No hi ha altres gens característics depredadors al genoma ASxL5T, inclosos els que codifiquen enzims implicats en la biosíntesi d'isoprenoides a la via del mevalonat. Tingueu en compte que no hi ha cap gen regulador transcripcional gntR al grup de depredadors examinat, però es poden identificar tres gens semblants a gntR a ASxL5T.
Les característiques fenotípiques d'ASxL5T es resumeixen a la taula 3 i es comparen amb les característiques fenotípiques dels gèneres relacionats 23, 24, 25, 26 i 27 informats a la literatura. Els aïllats de T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis i Oceanobacter kriegii són cossos en forma de bastons actius, tolerants a la sal i positius a l'oxidasa, però gairebé no tenen altres característiques fenotípiques amb ASxL5T. El pH mitjà de l'oceà és de 8,1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77), que es reflecteix a T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis i O. kriegii. ASxL5T és adequat per al rang de pH més gran (4-9) típic de les espècies no marines. Característiques fenotípiques de Thalassolituus sp. C2-1. Desconegut. El rang de temperatura de creixement d'ASxL5T és generalment més ampli que el de les soques marines (4–42 °C), tot i que alguns, però no tots, els aïllats de T. marinus són tolerants a la calor. La incapacitat de créixer ASxL5T en medis de brou va impedir una major caracterització fenotípica. Utilitzeu API 20E per provar els materials raspats de la placa BA, ONPG, arginina dihidrolasa, lisina descarboxilasa, ornitina descarboxilasa, utilització de citrats, ureasa, triptòfan desaminasa, hidròlisi de gelatina Enzim, els resultats de la prova van ser tots negatius, però sense indol, acetoïna i H2S es van produir. Els hidrats de carboni no fermentats inclouen: glucosa, manosa, inositol, sorbitol, ramnosa, sacarosa, melibiosa, amigdalina i arabinosa. En comparació amb les soques de referència relacionades publicades, el perfil d'àcids grassos cel·lulars de la soca ASxL5T es mostra a la taula 4. Els principals àcids grassos cel·lulars són C16:1ω6c i/o C16:1ω7c, C16:0 i C18:1ω9. També existeixen els àcids grassos hidroxi C12:0 3-OH i C10:0 3-OH. La proporció de C16:0 en ASxL5T és superior al valor informat dels gèneres relacionats. En canvi, en comparació amb el T. marinus IMCC1826TT informat, es redueix la proporció de C18:1ω7c i/o C18:1ω6c en ASxL5T. oleivorans MIL-1T i O. kriegii DSM 6294T, però no detectat a B. sanyensis KCTC 32220T. La comparació dels perfils d'àcids grassos d'ASxL5T i ASxLS va revelar diferències subtils en la quantitat d'àcids grassos individuals entre les dues soques, que són coherents amb la seqüència d'ADN genòmic de la mateixa espècie. No es van detectar partícules de poli-3-hidroxibutirat (PHB) mitjançant la prova del negre Sudan.
Es va estudiar l'activitat de depredació dels bacteris ASxL5T per determinar el rang de preses. Aquest bacteri pot formar plaques a les espècies de Campylobacter, com ara: Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T; Escherichia coli NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; C lari NCTC 11458 i C. upsaliensis NCTC 11541T. Utilitzeu els cultius que figuren a la secció de determinació del rang d'hostes del mètode per provar un rang més ampli de bacteris Gram-negatius i Gram-positius. Els resultats mostren que ASxL5T també es pot utilitzar a Escherichia coli NCTC 86 i Citrobacter freundii NCTC 9750T. Les plaques formades a Klebsiella oxytoca 11466. La interacció TEM amb E. coli NCTC 86 es mostra a la figura 4A-D, i la interacció amb Campylobacter jejuni PT14 i Campylobacter suis S12 es mostra a la figura 4E-H al mig. El mecanisme d'atac sembla ser diferent entre els tipus de preses provats, amb una o més cèl·lules d'E. coli unides a cada cèl·lula ASxL5T i posicionades lateralment al llarg de la cèl·lula estesa abans de l'adsorció. En canvi, ASxL5T sembla unir-se a Campylobacter mitjançant un únic punt de contacte, generalment en contacte amb l'àpex de la cèl·lula depredadora i prop de l'àpex de la cèl·lula Campylobacter (figura 4H).
TEM que mostra la interacció entre ASx5LT i la presa: (AD) i la presa d'E. coli; (EH) i C. jejuni presa. (A) Una cèl·lula ASx5LT típica connectada a una única cèl·lula d'E. coli (EC); (B) Un ASx5LT filamentós connectat a una única cèl·lula EC; (C) Una cèl·lula filamentosa ASx5LT connectada a múltiples cèl·lules EC; (D) Adhesió de cèl·lules ASx5LT més petites en una única cèl·lula d'E. coli (EC); (E) una única cèl·lula ASx5LT connectada a una cèl·lula Campylobacter jejuni (CJ); (F) ASx5LT ataca cèl·lules de C. hyointestinalis (CH); (G) dues cèl·lules One ASx5LT van atacar una cèl·lula CJ; (H) Una visió de primer pla del punt de connexió ASx5LT, a prop de l'àpex de la cèl·lula CJ (bar 0,2 μm). La barra representa 1 μm en (A–G).
Els bacteris depredadors han evolucionat per aprofitar abundants fonts de preses. Evidentment, són àmpliament presents en molts entorns diferents. A causa de la mida reduïda dels membres de la població, és possible aïllar els bacteris ASxL5T del purí mitjançant el mètode de separació de fags. La rellevància genòmica d'ASxL5T per als membres de la família de les oceanospirillàcies de bacteris marins és sorprenent, tot i que l'organisme és tolerant a la sal i pot créixer en un medi que conté un 5% de sal. L'anàlisi de la qualitat de l'aigua de la purina va mostrar que el contingut de clorur de sodi era inferior al 0,1%. Per tant, el fang està lluny del medi marí, tant geogràficament com químicament. La presència de tres aïllats relacionats però diferents de la mateixa font proporciona proves que aquests depredadors estan prosperant en aquest entorn no marí. A més, l'anàlisi del microbioma (fitxers de dades disponibles a https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990) va demostrar que la mateixa seqüència del gen 16S rRNA es troba als 50 tàxons operatius més abundants (OTU). ) En uns quants intervals de mostreig del fang. Es van trobar diversos bacteris no cultivats a la base de dades Genbank, que tenen seqüències de gens 16S rRNA similars als bacteris ASxL5T. Aquestes seqüències, juntament amb les seqüències d'ASxL5T, ASxS5 i ASxO5, semblen representar diferents clades separats de Thalassolituus i Oceanobacter (figura 2). Tres tipus de bacteris no cultivats (GQ921362, GQ921357 i GQ921396) es van aïllar de l'aigua de la fissura a una profunditat d'1,3 quilòmetres a la mina d'or de Sud-àfrica el 2009, i els altres dos (DQ256320 i DQ337006) també eren d'aigües subterrànies (també). el 2005). La seqüència del gen 16S rRNA més relacionada amb ASxL5T forma part de la seqüència del gen 16S rRNA obtinguda a partir del cultiu d'enriquiment de sediments sorrencs obtinguts a les platges del nord de França l'any 2006 (número d'adhesió AM29240828). Una altra seqüència del gen 16S rRNA estretament relacionada del bacteri no cultivat HQ183822.1 es va obtenir d'un dipòsit de recollida lixiviat d'un abocador municipal a la Xina. Òbviament, els bacteris ASxL5T no són altament representatius a les bases de dades taxonòmices, però és probable que aquestes seqüències de bacteris no cultivats representin organismes similars a ASxL5T, que es distribueixen per tot el món, normalment en entorns difícils. De tota l'anàlisi filogenètica del genoma, el parent més proper a ASxL5T és Thalassolituus sp. C2-1, T. marinus, T. oleivorans. I O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus és un membre dels bacteris de fragmentació d'hidrocarburs obligats marins (OHCB), que està molt estès en ambients marins i terrestres, i normalment esdevé el dominant després dels incidents de contaminació d'hidrocarburs30,31. Els bacteris marins no són membres del grup OHCB, però estan aïllats del medi marí.
Les dades fenotípiques indiquen que ASxL5T és una espècie nova i membre d'un gènere no reconegut anteriorment de la família de les espirospiràcies marines. Actualment no hi ha un estàndard clar per classificar les soques recentment aïllades en un gènere nou. S'han intentat determinar els límits universals dels gèneres, per exemple, basant-se en el percentatge del genoma d'una proteïna conservadora (POCP), es recomana que el valor de tall sigui el 50% idèntic a la soca de referència33. Altres suggereixen utilitzar valors AAI, que tenen avantatges respecte a POCP perquè es poden obtenir a partir de genomes incomplets34. L'autor creu que si el valor AAI és inferior al 74% en comparació amb la soca model de l'espècie model, la soca és un representant d'un gènere diferent. El gènere model de les spirillaceae marines és spirillum marí, i la soca model és O. linum ATCC 11336T. El valor AAI entre ASxL5T i O. linum ATCC 11336T és del 54,34%, i el valor AAI entre ASxL5T i T. oleivorans MIL-1T (soques tipus gènere) és del 67,61%, la qual cosa indica que ASxL5T representa un nou gènere diferent de Thalassolituus. Utilitzant la seqüència del gen de l'ARNr 16S com a estàndard de classificació, el límit de delimitació del gènere suggerit és del 94,5%35. ASxL5T es pot col·locar al gènere Thalassolituus, mostrant un 95,03% d'identitat de seqüència d'ARNr 16S amb T. oleivorans MIL-1T i un 96,17%. marinus IMCC1826T. Tanmateix, també es col·locarà en el gènere Bacteroides que té un 94,64% d'identitat del gen 16S rRNA amb B. sanyensis NV9, la qual cosa indica que l'ús d'un sol gen com el gen 16S rRNA pot conduir a una classificació i assignació arbitràries. Un altre mètode suggerit utilitza ANI i Genome Alignment Score (AF) per examinar l'agrupació de punts de dades de tots els tipus i soques no tipus dels gèneres existents. L'autor recomana combinar el límit del gènere amb el punt d'inflexió del gènere estimat específic dels tàxons que s'analitza. Tanmateix, si no hi ha prou seqüències completes del genoma dels aïllats de Thalassolituus, és impossible determinar si ASxL5T pertany al gènere Thalassolituus mitjançant aquest mètode. A causa de la disponibilitat limitada de seqüències completes del genoma per a l'anàlisi, tot l'arbre filogenètic del genoma s'ha d'interpretar amb precaució. En segon lloc, els mètodes de comparació del genoma sencer no poden tenir en compte diferències substancials en la mida dels genomes comparats. Van mesurar la similitud dels gens bàsics d'una còpia única conservats entre gèneres relacionats, però no van tenir en compte el gran nombre de gens que no estan presents al genoma molt més petit d'ASxL5T. Òbviament, ASxL5T i grups com Thalassolituus, Oceanobacter i Bacterioplanes tenen un avantpassat comú, però l'evolució ha pres un camí diferent, provocant una reducció del genoma, que pot ser l'adaptació a un estil de vida depredador. Això contrasta amb T. oleivorans MIL-1T, que és un 28% més gran i ha evolucionat sota diferents pressions ambientals per utilitzar hidrocarburs23,30. Es pot fer una comparació interessant amb paràsits intracel·lulars i simbionts obligats, com Rickettsia, Chlamydia i Buchnera. La mida del seu genoma és d'aproximadament 1 Mb. La capacitat d'utilitzar metabòlits de la cèl·lula hoste condueix a la pèrdua de gens, de manera que va patir una degradació genòmica evolutiva significativa. Els canvis evolutius d'organismes nutrients químics marins a estils de vida depredadors poden donar lloc a una reducció similar de la mida del genoma. L'anàlisi COG i KEGG destaca el nombre de gens utilitzats per a funcions específiques i les diferències globals en les vies genòmiques entre ASxL5T i T. oleivorans MIL-1T, que no es deuen a la disponibilitat generalitzada d'elements genètics mòbils. La diferència en la relació G + C de tot el genoma d'ASxL5T és del 56,1%, i la de T. oleivorans MIL-1T és del 46,6%, la qual cosa també indica que està segregada.
L'examen del contingut de codificació del genoma ASxL5T proporciona informació funcional sobre les característiques fenotípiques. La presència de gens que codifiquen fímbries de tipus IV (Tfp) és d'especial interès perquè afavoreixen el moviment cel·lular, anomenat desplaçament social o convulsions, sense flagels a la superfície. Segons els informes, el Tfp té altres funcions, com ara la depredació, la patogènesi, la formació de biofilms, l'absorció natural d'ADN, l'agregació automàtica i el desenvolupament de cèl·lules38. El genoma ASxL5T conté 18 gens que codifiquen la diguanylat ciclasa (un enzim que catalitza la conversió de 2 guanosina trifosfat en guanosina 2 fosfat i diGMP cíclic) i 6 gens que codifiquen el corresponent diguanylat ciclasa fosfat diguanylat. El gen de l'esterasa (que catalitza la degradació del di-GMP cíclic a monofosfat de guanosina) és interessant perquè el cycl-di-GMP és un segon missatger important implicat en el desenvolupament i la separació del biofilm, el moviment, la unió cel·lular i la virulència 39, 40 en el procés. També cal assenyalar que en Bdellovibrio bacteriovorus, s'ha demostrat que el doble GMP cíclic controla la transició entre la vida lliure i l'estil de vida depredador41.
La majoria de les investigacions sobre bacteris depredadors s'han centrat en Bdellovibrio, organismes semblants a Bdellovibrio i espècies de Myxococcus. Aquests i altres exemples coneguts de bacteris depredadors formen un grup divers. Malgrat aquesta diversitat, s'han identificat un conjunt de famílies de proteïnes característiques que reflecteixen els fenotips d'11 bacteris depredadors coneguts3,22. No obstant això, només s'han identificat gens que codifiquen O antigen lligasa (waaL), cosa que és particularment comú en bacteris Gram-negatius. Aquesta forma d'anàlisi no és útil per designar ASxL5T com a depredador, probablement perquè utilitza una nova estratègia d'atac. La disponibilitat de genomes bacterians depredadors més diversos ajudarà a desenvolupar anàlisis de resolució més fines que tinguin en compte les evidències de diferències funcionals i ambientals entre els membres del grup. Alguns exemples de bacteris depredadors no inclosos en aquesta anàlisi inclouen membres de Cupriavidus necator42 i Bradymonabacteria43, perquè a mesura que els investigadors investiguen diferents comunitats microbianes, s'estableixen més tàxons depredadors.
La característica més notable dels bacteris ASxL5T capturats per la imatge TEM és la seva morfologia única i flexible, que pot promoure la interacció amb els bacteris de les preses. El tipus d'interacció observada és diferent d'altres bacteris depredadors i no s'ha descobert ni informat prèviament. El cicle de vida depredador ASxL5T proposat es mostra a la figura 5. Hi ha pocs exemples a la literatura amb estructures apicals similars a les que informem aquí, però aquests exemples inclouen Terasakiispira papahanaumokuakeensis, un bacteri marí spirillum amb augment ocasional de l'àpex 44, i Alphaproteobacteria, Terasakiella pusilla. , antigament pertanyent al gènere Oceanospirillum, exhibint L'anomenat "pel·lícula polar" 45. Sovint s'observen formes de cocci en cultius més antics, especialment per a bacteris amb formes corbes, com Vibrio, Campylobacter i Helicobacter 46, 47, 48, que poden representar un estat degradat. Es necessita més treball per aclarir el cicle de vida precís dels bacteris ASxL5T. Determinar com captura i presa, i si el seu genoma codifica compostos biològicament actius que es poden utilitzar amb finalitats mèdiques o biotecnològiques.
Descripció de Venatorbacter gen. November Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. està compost per venators de L. n. venator, 'caçador' i Gr. n. bacter, 'una vara'. Venatorbacter, 'una vara de caça'). Les cèl·lules són aeròbies, tolerants a la sal, tinció de Gram negativa, l'activitat de la catalasa i l'oxidasa no s'acumula en el rang de temperatura 42 °C El rang de pH de 4-9 és inusual. En els caragols marins, la majoria són intolerants al pH àcid :0 3-OH i C10:0 3-OH es troben com a àcids grassos hidroxi No creixen El contingut d'ADN G + C és del 56,1% en mol. Els membres d'aquest gènere mostren resistència a Campylobacter I el comportament de depredació dels membres de la família Enterobacteriaceae.
Descripció de Venatorbacter cucullus sp. Novembre Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus significa carenat).
A més, la característica descriptiva d'aquest gènere és que quan es cultiven a BA o BHI, les cèl·lules fan 1,63 µm de llarg i 0,37 µm d'amplada. Les colònies de l'agar BHI són molt petites, arribant als 2 mm de diàmetre després de 72 hores. Són beix, translúcids, rodons, convexes i brillants. Els membres d'aquesta espècie poden utilitzar Escherichia coli i Klebsiella. Campylobacter i diversos altres bacteris gramnegatius serveixen de presa.
La soca típica ASxL5T es va aïllar de la llet de vedella a Nottinghamshire, Regne Unit, i es va dipositar a la National Type Culture Collection (Regne Unit): número d'adhesió NCTC 14397 i la col·lecció de cultiu bacterian dels Països Baixos (NCCB) número d'accés NCCB 100775. La seqüència completa del genoma d'ASxL5T s'ha dipositat a Genbank segons l'addició de CP046056.
Els bacteris ASxL5T es van aïllar de la llet de vedella mitjançant la tecnologia d'aïllament de fags9,49. La suspensió es va diluir 1:9 (p/v) en tampó SM (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,1 M NaCl, 8 mM MgSO4.7H2O i 0,01% de gelatina; Sigma Aldrich, Gillingham, Regne Unit), a continuació, incubar a 4 °C durant 24 hores, girant lentament per eluir els depredadors al tampó. La suspensió es va centrifugar a 3000 g durant 3 minuts. El sobrenedant es va recollir i es va centrifugar a 13.000 g per segona vegada durant 5 minuts. A continuació, el sobrenedant es va passar per un filtre de membrana de 0,45 µm (Minisart; Sartorius, Göttingen, Alemanya) i un filtre de membrana de 0,2 µm (Minisart) per eliminar les cèl·lules bacterianes restants. ASxL5T pot passar aquests filtres. Es va preparar una gespa d'agar suau de Campylobacter enterosus S12 (número d'adhesió NCBI CP040464) del mateix purín mitjançant tècniques estàndard. La suspensió filtrada es va distribuir a cadascuna d'aquestes plaques de cèl·lules hoste en gotes de 10 µl per triplicat i es va deixar assecar. La placa es va incubar en un dipòsit microaeròfil a 37 °C durant 48 hores en condicions microaeròbiques (5% O2, 5% H2, 10% CO2 i 80% N2). La placa visible obtinguda es va extreure al tampó SM i es va transferir a la gespa fresca de C. hyointestinalis S12 per propagar encara més els organismes lisats. Un cop s'ha determinat que els bacteris són la causa de la placa lítica i no el fag, s'intenta fer créixer l'organisme independentment de l'hoste i caracteritzar-lo encara més. El cultiu aeròbic es va realitzar a 37 ° C amb sang de cavall desfibrinada al 5% v/v (TCS Biosciences Lt, Buckingham, Regne Unit, suplement). Segons les directrius del National Clinical Standards Committee, el mètode de difusió del disc s'utilitza per a les proves de susceptibilitat antibacteriana. L'agar BHI es va cultivar a 37 °C mitjançant un disc que contenia els següents antibiòtics (Oxoid) per al cultiu aeròbic: amoxicil·lina i àcid clavulànic 30 µg; cefotaxima 30 µg; estreptomicina 10 µg; ciprofloxacina 5 µg; Ceftazidima 30 µg Àcid nalidíxic 30 µg; Imipenem 10 µg; Azitromicina 15 µg; Cloranfenicol 30 µg; Cefoxitina 30 µg; tetraciclina 30 µg; Nitrofurantoïna 300 µg; Aztreonam 30 µg; Ampicil·lina 10 µg; Cefpodoxima 10 µg; Trimetoprim-sulfametoxazol 25 µg. La tolerància a la sal es va establir per incubació aeròbica en plaques d'agar BHI a 37 ° C. Es va afegir NaCl addicional a les plaques d'agar BHI per proporcionar un rang de concentració de fins a un 10% p/v. El rang de pH es determina mitjançant cultiu aeròbic en plaques d'agar BHI a 37 ° C, on el rang de pH s'ha ajustat entre 4 i 9 amb HCl estèril o NaOH estèril, i el valor de pH objectiu es verifica abans d'abocar la placa. Per a l'anàlisi d'àcids grassos cel·lulars, es va cultivar ASxL5T en agar BHI durant 3 dies i aeròbic a 37 ° C. Segons el protocol estàndard MIDI (Sherlock Microbial Identification System, versió 6.10) de FERA Science Ltd, (York, Regne Unit), es van extreure, preparar i analitzar els àcids grassos cel·lulars.
Per a TEM, ASxL5T es va cultivar aeròbic estenent-se uniformement a BA a 37 ° C durant 24 hores, i després es va recollir en 1 ml de glutaraldehid al 3% (v/v) en tampó de cacodilat 0,1 M a temperatura ambient Fixar durant 1 hora i després centrifugar-lo. a 10.000 g durant 3 minuts. A continuació, resuspengueu suaument el pellet en 600 μl de tampó de cacodilat 0,1 M. Transferiu la suspensió ASxL5T fixa a la pel·lícula Formvar/carboni en una graella de coure de 200 malles. Els bacteris es van tacar amb acetat d'uranil al 0, 5% (p/v) durant 1 minut i es van examinar per TEM mitjançant un microscopi TEI Tecnai G2 12 Biotwin. Com s'ha esmentat anteriorment, combineu el mateix nombre de preses i depredadors al brou NZCYM (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) i incubeu durant 48 hores en condicions microaeròbiques de Campylobacter o Campylobacter a 37 °C, La interacció del depredador i la presa. també va ser examinat per TEM. Condicions aeròbiques per a Escherichia coli. Examineu de manera independent les preses i els bacteris depredadors per determinar qualsevol canvi en la morfologia cel·lular a causa de la depredació. El mètode negre de Sudan es va utilitzar per a la microscòpia òptica de l'acumulació de PHB.
Creixeu cultius ASxL5T durant la nit untant el creixement a les plaques BHI o BA amb un hisop estèril. Recolliu cèl·lules ASxL5T i suspengueu-les a MRD (CM0733, Oxoid) i després col·loqueu-les a 4 ° C durant 7 dies per morir de fam les cèl·lules. El cultiu bacterian de referència NCTC o de laboratori es va inocular en brou BHI o brou de nutrients núm. 2 (CM007, Oxoid), es va incubar durant la nit, es va centrifugar a 13.000 g i es va tornar a suspendre en MRD fins que la DO600 va ser de 0,4. Cultiu: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, Klebsiella oxytoca, Lebsiella oxytoca, Lebsiella oxytoca Listeria Special bacteris NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, Rhodococcus submarine hamburguesa NCTC 1621T, Salmonella intestinal bacteri Mondeville NCTC 5786TC, Stalococcus 5786710 aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. L'hoste Campylobacter es va incubar microaeròbicament en plaques BA a 37 °C i es va suspendre en brou NZCYM. Els hostes de Campylobacter provats són: C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11458, C.1 lari5NCTC . PT14, C... Recollir cèl·lules en MRD, centrifugar a 13.000 g i tornar a suspendre en MRD fins que OD600 sigui 0,4. Afegiu una alíquota de 0,5 ml de suspensió a 5 ml d'agar superior NZCYM fos (agar 0,6%) i aboqueu-lo a una placa inferior de NZCYM a l'1,2%. Després de curar i assecar, l'ASxL5T diluït en sèrie es va distribuir com a gotes de 20 µl a cada tauler de gespa per triplicat. La temperatura i l'atmosfera del cultiu depenen dels requisits dels bacteris de prova.
Utilitzeu GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma Aldridge) per preparar ADN a partir d'aïllats bacterians. Es van utilitzar mètodes estàndard per a l'amplificació per PCR del gen de l'ARNr 16S i la determinació de la seqüència del producte mitjançant la química de terminació del colorant (Eurofins Value Read Service, Alemanya). Utilitzeu el programa BLAST-N per comparar aquestes seqüències amb altres seqüències de gens d'ARNr 16S per identificar i recollir espècies estretament relacionades. S'alineen amb ClustalW al programa MEGA X. L'arbre filogenètic es va reconstruir mitjançant MEGA X mitjançant el mètode de màxima versemblança basat en el model Tamura-Nei, amb 1000 còpies guiades54. Utilitzeu PureLink™ Genomic DNA Kit (Fisher Scientific, Loughborough, Regne Unit) per extreure ADN per a la seqüenciació del genoma sencer. La seqüència del genoma d'ASxL5T es va determinar mitjançant la combinació Illumina MiSeq, que consta de lectures de doble extrem de 250 pb compostes per una biblioteca preparada amb el kit d'etiquetatge Nextera i lectures de 2 a 20 kb de llargada de la plataforma PacBio. Instal·lació d'investigació de seqüenciació d'ADN de genòmica a la Universitat de Sembia. El genoma es va muntar mitjançant CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen, Aarhus, Dinamarca). Els cultius ASxL5T es dipositen a la National Type Culture Collection (Regne Unit) i a la Netherlands Bacterial Culture Collection (NCCB). Els genomes d'organismes relacionats utilitzats per a la comparació són: Thalassolituus oleivorans MIL-1T (número d'adhesió HF680312, complet); Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (número d'adhesió BMYY01000001, incomplet); Oceanobacter kriegii DSM 6294T (número d'adhesió NZ_AUGV00000000, incomplet); Marinamonas community DSM 5604T (afegit ASM436330v1, incomplet), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (afegit MTSD02000001, incomplet) i Thalassolituus sp. C2-1 (afegiu NZ_VNIL01000001, incomplet). Utilitzeu JGI Genome Portal36 a https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page= per determinar la puntuació d'alineació (AF) i la identitat mitjana d'àcid nucleic (ANI). En parelles. Es va utilitzar el mètode de Rodriguez-R & Konstantinidis55 per determinar la identitat dels aminoàcids (AAI). Utilitzeu GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 per generar un arbre filogenètic de màxima probabilitat estimat. El genoma d'entrada que representa el genoma de referència disponible es selecciona dels gèneres de referència identificats com a relacionats amb ASxL5T de la filogènia de l'ARNr 16S. Anotat l'arbre mitjançant l'eina en línia interactiva de l'arbre de la vida (https://itol.embl.de/). L'anotació funcional i l'anàlisi del genoma ASxL5T es realitza mitjançant l'eina en línia BlastKOALA KEGG mitjançant la distribució d'enriquiment del mòdul KEGG (Enciclopèdia de Kyoto de gens i genomes). La distribució de les categories COG (grups ortòlegs) es determina mitjançant l'eina en línia eggNOG-mapper.
Pérez, J., Moraleda-Muñoz, A., Marcos-Torres, FJ i Muñoz-Dorado, J. Depredació bacteriana: 75 anys i continua! . medi ambient. microorganisme. 18, 766–779 (2016).
Linares-Otoya, L. etc. Diversitat i potencial antibacterià de bacteris depredadors a la costa peruana. Drogues de març. 15. E308. https://doi.org/10.3390/md15100308 (2017).
Pasternak, Z. et al. A través dels seus gens, els entendràs: les característiques genòmiques dels bacteris depredadors. ISME J. 7, 756–769 (2013).
Sockett, RE L'estil de vida depredador del bacteriòfag Bdellovibrio. instal·lar. Pastor microbis. 63, 523–539 (2009).
Korp, J., Vela Gurovic, MS & Nett, M. Antibiòtics de bacteris depredadors. Beilstein J. Histochemistry 12, 594–607 (2016).
Johnke, J., Fraune, S., Bosch, TCG, Hentschel, U. i Schulenburg, H. Bdellovibrio i organismes similars són predictors de la diversitat del microbioma en diferents poblacions hostes. microorganisme. Ecologia. 79, 252–257 (2020).
Vila, J., Moreno-Morales, J. i Ballesté-Delpierre, C. Discover the current status of new antibacterial agents. clínica. microorganisme. Infectar. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2019.09.015 (2019).
Hobley, L. et al. La doble depredació del fag i el fag pot eradicar les preses d'E. coli sense una sola depredació. J. Bacteris. 202, e00629-19. https://doi.org/10.1128/JB.00629-19 (2020).
El-Shibiny, A., Connerton, PL i Connerton, IF El recompte i la diversitat de Campylobacter i bacteriòfags aïllats durant el cicle d'alimentació de pollastres de corral i orgànics. Entorn d'aplicació. microorganisme. 71, 1259–1266 (2005).
Wilkinson, DA etc. Actualització de la taxonomia i epidemiologia genòmica del porcí Campylobacter. ciència. Representant 8, 2393. https://doi.org/10.1038/s41598-018-20889-x (2018).
Lee, MD GToTree: flux de treball fàcil d'utilitzar per a la genòmica de sistemes. Bioinformàtica 35, 4162–4164 (2019).
Edgar, RC MUSCLE: Un mètode d'alineació de seqüències múltiple que redueix la complexitat de temps i espai. Informació biològica BMC. 5, 113 (2004).
Capella-Gutiérrez, S., Silla-Martínez, JM & Gabaldón, T. TrimAl: A tool for automatic alignment and trimming in large-scale phylogentic analysis. Bioinformàtica 25, 1972–1973 (2009).
Hyatt, D., LoCascio, PF, Hauser, LJ i Uberbacher, el gen EC i la traducció de la seqüència metagenòmica inicien la predicció del lloc. Bioinformàtica 28, 2223-2230 (2012).
Shen, W. & Xiong, J. TaxonKit: conjunt d'eines de classificació NCBI multiplataforma i eficient. Bio Rxiv. (Consultat l'1 de juny de 2021); https://www.biorxiv.org/content/10.1101/513523v1 (2019).
Price, MN, Dehal, PS i Arkin, AP FastTree 2-arbre de màxima probabilitat aproximat amb una alineació gran. PLoS One 5, e9490 (2010).
Tange, O. GNU Paral·lel. (Consultat l'1 de juny de 2021); https://zenodo.org/record/1146014#.YOHaiJhKiUk (2018).
Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Recerca d'àcids nucleics. 28, 27-30 (2000).
República Txeca, L. etc. El paper dels extremòlits ectoïna i hidroxiectoïna com a protectors de l'estrès i nutrients: genètica, genòmica del sistema, bioquímica i anàlisi estructural. Gen (Basilea). 9. E177. https://doi.org/10.3390/genes9040177 (2018).
Gregson, BH, Metodieva, G., Metodiev, MV, Golyshin, PN i McKew, BA Expressió diferencial de proteïnes durant el creixement del bacteri obligat que degrada els hidrocarburs marins Thalassolituus oleivorans MIL-1 durant el creixement d'alcans de cadena mitjana i llarga. davant. microorganisme. 9, 3130 (2018).
Pasternak, Z., Ben Sasson, T., Cohen, Y., Segev, E. i Jurkevitch, E. Un nou mètode de genòmica comparativa per definir indicadors fenotípics específics revela una herència específica en la marca de bacteris depredadors. Biblioteca Pública de Ciències 1. 10. e0142933. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142933 (2015).
Yakimov, MM, etc. Gen Thalassolituus oleivorans. novembre, sp. nov., un nou tipus de bacteris marins especialitzats en l'ús d'hidrocarburs. internacionalitat. J. Sistema. evolució. microorganisme. 54, 141–148 (2004).
Wang, Y., Yu, M., Liu, Y., Yang, X. i Zhang, XH Bacterioplanoides pacificum gen. novembre, sp. Al novembre, es va separar de l'aigua de mar que circulava pel Pacífic Sud. internacionalitat. J. Sistema. evolució. microorganisme. 66, 5010–5015 (2016).