Un novu tipu di batteri Gram-negativi, aerobichi, tolleranti à u sali, attivi, in forma di bastone è predatori ASxL5T hè statu isolatu da un stagnu di sterco di vacca in Nottinghamshire, Inghilterra, è hà utilizatu Campylobacter cum'è a so preda. In seguitu, altre spezie Campylobacter è membri di a famiglia Enterobacteriaceae sò stati scuperti cum'è preda. Dopu à a subcultura senza cellule d'ospiti, una crescita asettica debbule hè stata ottenuta in Brain Heart Infusion Agar. I cundizioni ottimali di crescita sò 37 ° C è u pH hè 7. A microscopia elettronica di trasmissione hà revelatu alcune caratteristiche morfologiche assai inusual relative à a dispunibilità di preda. L'analisi filogenetica utilizendu a sequenza di u gene 16S rRNA hà indicatu chì l'isolatu hè in relazione cù un membru di a famiglia Spirulina Marina, ma ùn pò esse chjaramente classificatu cum'è un membru di qualsiasi genus cunnisciutu. A sequenza di u genoma sanu di ASxL5T hà cunfirmatu a relazione cù i membri di i spirocheti marini. Una ricerca di basa di dati hà revelatu chì parechji ASxL5Ts sparte sequenze di geni 16S rRNA cù parechji batteri inculti da l'oceanu, a superficia di a terra è l'acqua di terra. Suggeremu chì a ceppa ASxL5T rapprisenta una nova spezia in un novu genus. Hè ricumandemu u nome Venatorbacter cucullus gen. nuvembre, sp. In u Novembre, ASxL5T hè stata utilizata cum'è u tipu di strain.
I batteri predatori sò battìri chì mostranu a capacità di caccià è tumbà altri batteri viventi per ottene materiali biosintetici è energia. Questu hè diversu da a ricuperazione generale di nutrienti da i microorganismi morti, è hè ancu sfarente di l'interazzione parasita, in quale i batteri formanu una relazione stretta cù u so òspite senza tumbà. I battìri predatori anu evolutu diversi ciculi di vita per prufittà di e fonti alimentari abbundanti in i nicchi induve si trovanu (cum'è l'abitati marini). Sò un gruppu tassonomicu diversu, chì sò cunnessi solu da u so ciclu di vita di sterilizazione unicu1. Esempii di battìri predatori sò stati truvati in parechji phyla diffirenti, cumprese: Proteobacteria, Bacteroides è Chlorella.3. Tuttavia, i batteri predatori più studiati sò i Bdellovibrio è Bdellovibrio-and-like organisms (BALOs4). I batteri predatori sò una fonte promettente di novi composti biologichi attivi è agenti antibacterial5.
Si crede chì i batteri predatori aumentenu a diversità microbica è anu un impattu pusitivu in a salute, a produtividade è a stabilità di l'ecosistema6. Malgradu questi attributi pusitivi, ci sò pocu studii nantu à novi batteri predatori per via di a difficultà di cultivà i batteri è a necessità di osservà attentamente l'interazzione cellulare per capiscenu i so cicli di vita cumplessi. Sta infurmazione ùn hè micca faciule d'ottene da l'analisi di l'urdinatore.
In una era di crescente resistenza antimicrobiana, novi strategie per indirizzà i patogeni batterichi sò studiati, cum'è l'usu di bacteriophages è batteri predatori7,8. I batteri ASxL5T sò stati isolati in 2019 aduprendu a tecnulugia di isolamentu di fagi da u sterco di vacca raccolti da u Dairy Center di l'Università di Nottingham, Nottinghamshire. U scopu di l'investigazione hè di isolà l'organisimi chì ponu esse agenti di cuntrollu biologicu. Campylobacter hyointestinalis hè un patogenu zoonoticu, chì hè sempre più assuciatu cù e malatie intestinali umane10. Hè omnipresente in u serum è utilizatu cum'è un host di destinazione.
U bacteriu ASxL5T hè statu isolatu da a gelatina di vacca perchè era osservatu chì i plaques chì si furmò nantu à u prato di C. hyointestinalis eranu simili à quelli pruduciutu da i bacteriophages. Il s'agit d'une découverte inattendue, car une partie du processus d'isolement du phage consiste à filtrer à travers un filtre de 0,2 µm, conçu pour éliminer les cellules bactériennes. L'esame microscòpicu di u materiale estratto da a placca hà revelatu chì i picculi batteri gram-negativi in ​​forma di bastone curve ùn anu micca accumulatu polyhydroxybutyrate (PHB). A cultura asettica indipendente da e cellule di preda hè realizata nantu à un mediu solidu riccu (cum'è l'agar infusione di u core di u core (BHI) è l'agar di sangue (BA)), è a so crescita hè debule. Hè ottinutu dopu à subcultura cù inoculum pisanti migliurà. Cresce ugualmente bè sottu microaerobi (7% v / v ossigenu) è cundizioni d'ossigenu atmosfericu, ma micca in una atmosfera anaerobica. Dopu à 72 ore, u diametru di a culunia era assai chjuca, righjunghji 2 mm, è era beige, trasluzente, tonda, cunvexa è brillanti. A prova biochimica standard hè ostacolata perchè l'ASxL5T ùn pò micca esse cultivatu in modu affidabile in media liquidu, chì suggerisce chì pò s'appoghjanu nantu à u cumplessu ciclu di vita di a furmazione di biofilm. In ogni casu, a sospensjoni di u platu hà dimustratu chì ASxL5T hè aerobicu, pusitivu per l'oxidase è catalase, è pò tollerà 5% NaCl. ASxL5T hè resistente à 10 µg di streptomicina, ma hè sensibile à tutti l'altri antibiotici testati. E cellule batteriche ASxL5T sò state esaminate da TEM (Figura 1). Lorsqu'elles sont cultivées sans cellules de proie sur le BA, les cellules ASxL5T sont des petits Campylobacter, avec une longueur moyenne de 1,63 μm (± 0,4), une largeur de 0,37 μm (± 0,08), et un seul pôle long (jusqu'à 5 μm). Flagella sessuale. Circa 1,6% di e cellule parenu avè una larghezza di menu di 0,2 μm, chì permetterà u passaghju per u dispusitivu di filtru. Un allungamentu strutturale inusual hè statu osservatu nantu à a cima di alcune cellule, simile à un carenamentu (cucullus latinu) (vede e frecce in 1D, E, G). Questu pare esse cumpostu di l'excedente di a membrana esterna, chì pò esse duvuta à a riduzzione rapida di a dimensione di l'envelope periplasmaticu, mentri a membrana esterna ferma intacta, chì mostra un aspettu "loose". Culturing ASxL5T in assenza di nutrienti (in PBS) per un bellu pezzu à 4 ° C hà risultatu in a maiò parte (ma micca tutte) di e cellule chì mostranu una morfologia coccal (Figura 1C). Quandu ASxL5T cresce cù Campylobacter jejuni cum'è preda per 48 ore, a dimensione media di a cellula hè significativamente più longa è più stretta di e cellule cultivate senza un ospite (Table 1 è Figura 1E). In cuntrastu, quandu ASxL5T cresce cù E. coli cum'è preda per l'ora di 48, a dimensione di a cellula media hè più longa è più larga di quandu si sviluppa senza preda (Table 1), è a lunghezza di a cellula hè variabile, di solitu mostra filamentu (Figura 1F). Quandu incubate cù Campylobacter jejuni o E. coli cum'è preda per 48 ore, i celluli ASxL5T ùn anu mostratu micca flagelli in tuttu. A Tabella 1 riassume l'osservazioni di i cambiamenti in a dimensione di a cellula basatu nantu à a prisenza, l'assenza è u tipu di preda di ASxL5T.
Display TEM di ASx5LT: (A) ASx5LT mostra a frusta longa; (B) batteria tipica ASx5LT; (C) cocci ASx5LT cells after long incubation without nutrients; (D) un gruppu di cellula ASx5LT mostra anormalità (E) gruppu cellula ASx5LT incubated cù Campylobacter prey mustrò a lunghezza cellula aumentata paragunatu cù quelli senza crescita preda (D) mostra dinù struttura apicale; (F) Large filamentous flagella, ASx5LT cells, dopu à incubation with E. coli prey; (G) Una sola cellula ASx5LT dopu l'incubazione cù E. coli, chì mostra una struttura superiore inusual. A barra rapprisenta 1 μm.
A determinazione di a sequenza di u gene 16S rRNA (numeru d'accessione MT636545.1) permette e ricerche di basa di dati per stabilisce sequenze simili à quelli in a classe Gammaproteobacteria, è sò più vicinu à i batteri marini in a famiglia di spirillum marini (Figura 2), è sò membri di u genus Thalassolituus. U parente più vicinu à u Bacillus Marinu. A sequenza di u genu 16S rRNA hè chjaramente sfarente da i batteri predatori chì appartenenu à a famiglia Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria). I paraguni paru di B. bacteriovorus HD100T (tipo strain, DSM 50701) è B. bacteriovorus DM11A eranu 48.4% è 47.7%, è per B. exovorus JSS era 46.7%. I battìri ASxL5T anu 3 copie di u genu 16S rRNA, dui di quali sò identici l'un à l'altru, è u terzu hè 3 basi di distanza. Dui altri isolati di batteri predatori (ASx5S è ASx5O; i numeri d'accessu di u gene 16S rRNA sò MT636546.1 è MT636547.1, rispettivamente) cù caratteristiche morfologiche è fenotipiche simili da u stessu locu ùn sò micca listessi, ma sò diffirenti da ASxL5T è Bacterial inculti. e sequenze di basa di dati sò raggruppati cù altri generi in Oceanospirillaceae (Figura 2). A sequenza di u genoma tutale di ASxL5T hè stata determinata è salvata in a basa di dati NCBI, è u numeru d'accessu hè CP046056. U genoma di ASxL5T hè custituitu da un cromusomu circular di 2.831.152 bp cù un ratio G + C di 56.1%. A sequenza di u genoma cuntene 2653 CDS (totale), di quale 2567 sò previsti per codificà e prutezione, di quale 1596 ponu esse attribuiti cum'è funzioni putative (60,2%). U genoma cuntene 67 geni codificanti RNA, cumpresi 9 rRNA (3 ognunu per 5S, 16S è 23S) è 57 tRNA. E caratteristiche genomiche di ASxL5T sò state paragunate cù i genomi dispunibuli di ceppi di u tipu parente più vicinu identificatu da a sequenza di geni 16S rRNA (Table 2). Aduprate l'identità di l'aminoacidu (AAI) per paragunà tutti i genomi Thalassolituus dispunibili à ASxL5T. A sequenza di genoma disponibile (incompleta) più vicina determinata da AAI hè Thalassolituus sp. C2-1 (aghjunghje NZ_VNIL01000001). Questa cepa hè stata isolata da i sedimenti di u mare profondu di a Fossa di Mariana, ma ùn ci hè attualmente nisuna informazione fenotipica nantu à sta ceppa per paragunà. Comparatu cù 2,82 Mb di ASxL5T, u genoma di l'organismu hè più grande à 4,36 Mb. A dimensione media di u genoma di spirochete marine hè di circa 4,16 Mb (± 1,1; n = 92 genomi di riferimentu cumpleti investigati da https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), cusì u genoma di ASxL5T hè in linea cù u ordine Paragunatu à l'altri membri, hè abbastanza chjucu. Aduprate GToTree 1.5.54 per generà un arbulu filogeneticu di probabilità massima stimata in u genoma (Figura 3A), utilizendu e sequenze d'aminoacidi allineati è ligati di 172 geni di una sola copia specifica per Gammaproteobacteria 11,12,13,14,15,16, 17,18. L'analisi hà dimustratu chì hè strettamente ligata à Thalassolituus, Bacterial Plane è Marine Bacterium. Tuttavia, sti dati indicanu chì ASxL5T hè sfarente di i so parenti in Spirulina Marina è i so dati di sequenza di u genoma sò dispunibili.
L'arbulu filogeneticu chì utilizeghja a sequenza di u gene 16S rRNA mette in risaltu a pusizione di i ceppi ASxL5T, ASxO5 è ASxS5 (cù l'intestini) relative à i ceppi di batteri inculti è marini in Spirulinaceae Marine. U numeru d'accessu Genbank seguita u nome di a razza in parentesi. Aduprate ClustalW per allineà e sequenze, è aduprà u metudu di probabilità massima è u mudellu Tamura-Nei per inferisce relazioni filogenetiche, è eseguisce 1000 replicazioni guidate in u prugramma MEGA X. U numeru nantu à u ramu indica chì u valore di copia guidata hè più grande di 50%. Escherichia coli U/541T hè stata utilizata cum'è un outgroup.
(A) Un arbulu filogeneticu basatu annantu à u genoma, chì mostra a relazione trà u bacteriu marinu Spirospiraceae ASxL5T è i so parenti stretti, E. coli U 5/41T cum'è un outgroup. (B) Comparatu cù T. oleivorans MIL-1T, a distribuzione di categuria funziunale di i geni hè prevista nantu à u gruppu orthologu (COG) di a proteina ASx5LT. A figura à a manca mostra u numeru di geni in ogni categuria COG funzionale in ogni genoma. U graficu à a diritta mostra a percentuale di genomi cuntenuti in ogni gruppu COG funziunale. (C) Comparatu cù T. oleiverans MIL-1T, l'analisi di u KEGG cumpletu (Enciclopedia di Kyoto di Genes and Genomes) modular via di ASxL5T.
Utilizà a basa di dati KEGG per esaminà i geni cumpunenti prisenti in u genoma ASxL5T hà revelatu a via metabolica tipica di a gamma aerobica Proteus. ASxL5T cuntene un totale di 75 geni assignati à e proteini di u mutore bacteriale, cumprese i geni implicati in a chemotaxis, l'assemblea di flagelli è u sistema di fimbriae di tipu IV. In l'ultima categuria, 9 di 10 genesi sò rispunsevuli di u muvimentu di cunversione di una varietà di altri organismi. U genoma di ASxL5T cuntene una via biosintetica completa di tetrahydropyrimidine chì participa à a risposta protettiva à u stress osmoticu20, cum'è previstu per l'alofili. U genomu cuntene ancu assai percorsi cumpleti per cofactors è vitamini, cumprese i percorsi di sintesi di riboflavina. Ancu se u genu alkane 1-monooxygenase (alkB2) hè presente in ASxL5T, a via di l'utilizazione di l'idrocarburi ùn hè micca cumpleta. In a sequenza di genomu di ASxL5T, l'omologi di geni identificati cum'è rispunsevuli principalmente di a degradazione di l'idrocarburi in T. oleiverans MIL-1T21, cum'è TOL_2658 (alkB) è TOL_2772 (alcohol dehydrogenase) sò ovviamente assenti. A Figura 3B mostra a comparazione di a distribuzione di geni in a categuria COG trà ASxL5T è Oliu d'oliu MIL-1T. In generale, u genoma ASxL5T più chjucu cuntene proporzionalmente menu geni da ogni categuria COG cumparatu cù u genoma più grande. Quandu u numaru di geni in ogni categuria funziunale hè spressu cum'è un percentinu di u genoma, i differenzi sò nutati in u percentualità di geni in a traduzzione, a struttura ribosomiale è e categurie di biogenesi, è a categuria di funzione di produzzione energetica è di cunversione, chì custituiscenu u ASxL5T più grande. genomu U pircintuali hè paragunatu cù u listessu gruppu prisenti in u genomu T. oleiverans MIL-1T. In cuntrastu, cumparatu cù u genomu ASxL5T, T. oleivorans MIL-1T hà un percentinu più altu di geni in e categurie di replicazione, recombinazione è riparazione, è trascrizzione. Curiosamente, a più grande diferenza in u cuntenutu di ogni categuria funziunale di i dui genomi hè u numeru di geni scunnisciuti prisenti in ASxL5T (Figura 3B). Un'analisi di arricchimentu di i moduli KEGG hè stata realizata, induve ogni modulu KEGG rapprisenta un inseme di unità funzionali definite manualmente per l'annotazione è l'interpretazione biologica di e dati di sequenza di genoma. A paraguni di a distribuzione di geni in a via completa di u modulu KOG di ASxL5T è l'oliva MIL-1T hè mostrata in Figura 3C. Stu analisi mostra chì ancu chì ASxL5T hà una via metabolica cumpleta di sulphur è nitrogenu, T. oleiverans MIL-1T ùn hè micca. In cuntrastu, T. oleiverans MIL-1T hà una via metabolica cumpleta di cisteina è metionina, ma hè incompleta in ASxL5T. Dunque, ASxL5T hà un modulu caratteristicu per l'assimilazione di sulfate (definitu cum'è un inseme di geni chì ponu esse usatu cum'è marcatori fenotipichi, cum'è a capacità metabolica o patogenicità; https://www.genome.jp/kegg/module.html) In T . olivirani MIL-1T. A paragunà u cuntenutu di u genu di ASxL5T cù a lista di geni chì suggerenu un stilu di vita predatori ùn hè micca cunclusu. Ancu se u genu waaL chì codifica a ligase assuciata cù l'antigenu O polisaccharide à u core hè presente in u genoma ASxL5T (ma hè cumuni in parechji batteri Gram-negativi), i geni di triptofanu 2,3-dioxygenase (TDO) ponu include 60 amino. regioni acidi cumunimenti truvati in i batteri predatori chì ùn sò micca prisenti. Ùn ci hè micca altri geni caratteristici predatori in u genoma ASxL5T, cumprese quelli chì codificanu l'enzimi implicati in a biosintesi isoprenoide in a via di mevalonate. Innota chì ùn ci hè micca un gene regulatore di transcriptional gntR in u gruppu di predatori esaminatu, ma trè geni simili à gntR ponu esse identificati in ASxL5T.
E caratteristiche fenotipiche di ASxL5T sò riassunte in a Tabella 3 è paragunate cù e caratteristiche fenotipiche di i generi rilativi 23, 24, 25, 26 è 27 riportati in a literatura. L'isolati da T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis è Oceanobacter kriegii sò corpi attivi, tolleranti à u salinu, oxidasi pusitivi in ​​forma di bastone, ma ùn anu quasi micca altre caratteristiche fenotipiche cù ASxL5T. U pH mediu di l'oceanu hè 8,1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77), chì si riflette in T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis è O. kriegii. ASxL5T hè adattatu per a gamma più larga di pH (4-9) tipica di e spezie non marine. Caratteristiche fenotipiche di Thalassolituus sp. C2-1. Inconnu. U intervallu di a temperatura di crescita di ASxL5T hè in generale più largu di quellu di i ceppi marini (4-42 ° C), ancu s'ellu alcuni, ma micca tutti, l'isolati di T. marinus sò resistenti à u calore. L'incapacità di cultivà ASxL5T in i media di brodo impeditu più carattarizazione fenotipica. Aduprate API 20E per pruvà i materiali raschiati da a piastra BA, ONPG, arginina diidrolasi, lisina decarbossilasi, ornitina decarbossilasi, utilizzazione di citrati, ureasi, triptofano deaminasi, idrolisi di gelatina Enzyme, i risultati di a prova eranu tutti negativi, ma senza indole, acetoina è H2S. sò stati pruduciuti. I carbuidrati micca fermentati includenu: glucose, mannose, inositol, sorbitol, ramnose, saccharose, melibiose, amygdalin è arabinose. Comparatu cù i ceppi di riferimentu publicati, u prufilu di l'acidu grassu cellulare di a ceppa ASxL5T hè indicatu in a Tabella 4. L'acidi grassi cellulari principali sò C16: 1ω6c è / o C16: 1ω7c, C16: 0 è C18: 1ω9. Ci sò ancu l'acidi grassi idrossi C12: 0 3-OH è C10: 0 3-OH. U rapportu di C16: 0 in ASxL5T hè più altu ch'è u valore rapportatu di i generi rilativi. In cuntrastu, cumparatu cù u T. marinus IMCC1826TT riportatu, u rapportu di C18: 1ω7c è / o C18: 1ω6c in ASxL5T hè ridutta. oleivorans MIL-1T è O. kriegii DSM 6294T, ma micca detecatu in B. sanyensis KCTC 32220T. Paragunendu i profili di l'acidu grassu di ASxL5T è ASxLS hà revelatu sferenti sottili in a quantità di acidi grassi individuali trà e duie ceppi, chì sò coerenti cù a sequenza di DNA genomicu di a listessa spezia. Nisuna particella di poli-3-hydroxybutyrate (PHB) hè stata rilevata cù a prova nera di Sudan.
L'attività di predazione di a bacteria ASxL5T hè stata studiata per determinà a varietà di preda. Stu bacteriu pò furmà plaques nantu à e spezie Campylobacter, cumprese: Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T; Escherichia coli NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; C lari NCTC 11458 è C. upsaliensis NCTC 11541T. Aduprate i culturi elencati in a sezione di determinazione di l'ospiti di u metudu per pruvà una gamma più larga di batteri Gram-negativi è Gram-positivi. I risultati mostranu chì ASxL5T pò ancu esse usatu in Escherichia coli NCTC 86 è Citrobacter freundii NCTC 9750T. Plaques formate nantu à Klebsiella oxytoca 11466. L'interazzione TEM cù E. coli NCTC 86 hè mostrata in Figura 4A-D, è l'interazzione cù Campylobacter jejuni PT14 è Campylobacter suis S12 hè mostrata in Figura 4E-H middle. U mecanismu di l'attaccu pare esse diversu trà i tipi di preda pruvati, cù una o più cellule di E. coli attaccati à ogni cellula ASxL5T è posizionati lateralmente longu a cellula estesa prima di l'adsorption. In cuntrastu, ASxL5T pare attache à Campylobacter attraversu un puntu unicu di cuntattu, generalmente in cuntattu cù l'apex di a cellula predatore è vicinu à l'apex di a cellula Campylobacter (Figura 4H).
TEM chì mostra l'interazzione trà ASx5LT è preda: (AD) è E. coli prey; (EH) è C. jejuni preda. (A) Una cellula ASx5LT tipica cunnessa à una sola cellula E. coli (EC); (B) Un filamentoso ASx5LT attaccatu à una sola cellula EC; (C) Una cellula ASx5LT filamentosa cunnessa à parechje cellule EC; (D) Attachment Smaller ASx5LT cells on a single E. coli (EC) cell; (E) una sola cellula ASx5LT cunnessa à una cellula Campylobacter jejuni (CJ); (F) ASx5LT attacca C. hyointestinalis (CH) cells; (G) dui One ASx5LT cell anu attaccatu una cellula CJ; (H) Una vista ravvicinata di u puntu di attache ASx5LT, vicinu à l'apex di a cellula CJ (bar 0.2 μm). A barra rapprisenta 1 μm in (A-G).
I batteri predatori anu evolutu per prufittà di e fonti abbundanti di preda. Ovviamente, sò largamente presenti in parechji ambienti diffirenti. A causa di a dimensione stretta di i membri di a pupulazione, hè pussibule isolà i batteri ASxL5T da u slurry usendu u metudu di separazione di fagi. A rilevanza genomica di ASxL5T à i membri di a famiglia di l'oceanospirillaceae di battìri marini hè surprisante, ancu s'è l'organismu hè tolerante à u salinu è pò cultivà nantu à un mediu chì cuntene 5% di sal. L'analisi di a qualità di l'acqua di u slurry hà dimustratu chì u cuntenutu di clorur di sodiu era menu di 0,1%. Per quessa, u fangu hè luntanu da l'ambiente marinu, sia geograficamente sia chimicamente. A prisenza di trè isolati cunnessi ma diffirenti da a listessa fonte furnisce evidenza chì questi predatori prosperanu in questu ambiente non marinu. Inoltre, l'analisi di u microbioma (fichi di dati dispunibuli da https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990) hà dimustratu chì a stessa sequenza di geni 16S rRNA si trova in i top 50 taxoni operativi più abbundanti (OTU). ) In uni pochi intervalli di campionamentu di u fangu. Diversi batteri incolti sò stati truvati in a basa di dati Genbank, chì anu sequenze di geni 16S rRNA simili à i batteri ASxL5T. Queste sequenze, inseme cù e sequenze di ASxL5T, ASxS5 è ASxO5, parenu rapprisentanu diversi cladi separati da Thalassolituus è Oceanobacter (Figura 2). Trè tipi di batteri inculti (GQ921362, GQ921357 è GQ921396) sò stati isolati da l'acqua di fissura à una prufundità di 1,3 chilometri in a minera d'oru sudafricana in u 2009, è l'altri dui (DQ256320 è DQ337006) sò stati in l'acqua di u Sudafrica (also). in 2005). A sequenza di geni 16S rRNA più strettamente ligata à ASxL5T face parte di a sequenza di geni 16S rRNA ottenuta da a cultura di arricchimentu di sedimenti sabbiosi ottenuti da e spiagge di u Nordu di Francia in u 2006 (numeru d'accessu AM29240828). Un'altra sequenza di geni 16S rRNA strettamente ligata da u bacteriu incultu HQ183822.1 hè stata ottenuta da una cisterna di raccolta lisciata da una discarica municipale in Cina. Ovviamente, i battìri ASxL5T ùn sò micca assai rapprisentanti in basa di dati tassonomichi, ma queste sequenze di batteri inculti sò prubabilmente rapprisentanu organismi simili à ASxL5T, chì sò distribuiti in tuttu u mondu, di solitu in ambienti sfida. Da tutta l'analisi filogenetica di u genoma, u parente più vicinu à ASxL5T hè Thalassolituus sp. C2-1, T. marinus, T. oleivorans. E O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus hè un membru di i batteri di frammentazione di l'idrocarburi obligati marini (OHCB), chì hè spargugliatu in l'ambienti marini è terrestri, è di solitu diventa u dominante dopu à incidenti di contaminazione di l'idrocarburi30,31. I batteri marini ùn sò micca membri di u gruppu OHCB, ma sò isolati da l'ambiente marinu.
I dati fenotipichi indicanu chì ASxL5T hè una nova spezia è un membru di un genus prima micca ricunnisciutu in a famiglia di spirospiraceae marine. Attualmente ùn ci hè micca un standard chjaru per classificà e ceppi recentemente isolati in un novu genus. Tentativi sò stati fatti per determinà i limiti di i generi universali, per esempiu, basatu annantu à u percentualità di u genoma di una proteina conservativa (POCP), hè cunsigliatu chì u valore cut-off hè 50% identicu à a ceppa di riferimentu33. Altri suggerenu di utilizà i valori AAI, chì anu vantaghji annantu à POCP perchè ponu esse ottenuti da genomi incompleti34. L'autore crede chì se u valore di l'AAI hè menu di 74% cumparatu cù a razza di mudellu di l'spezie mudellu, a razza hè un rapprisentante di un generu diversu. U modellu genus in u spirillaceae marini hè spirillu marinu, è u mudellu hè O. linum ATCC 11336T. U valore AAI trà ASxL5T è O. linum ATCC 11336T hè 54,34%, è u valore AAI trà ASxL5T è T. oleivorans MIL-1T (genus type strains) hè 67,61%, chì indica chì ASxL5T rapprisenta un novu genus differente da Thalassolituus. Utilizendu a sequenza di geni 16S rRNA cum'è standard di classificazione, u cunfini di delimitazione di u genus suggeritu hè 94,5%35. ASxL5T pò esse postu in u genus Thalassolituus, chì mostra 95.03% 16S rRNA sequence identity cù T. oleivorans MIL-1T è 96.17%. marinus IMCC1826T. In ogni casu, serà ancu postu in u genus Bacteroides chì hà 94.64% 16S rRNA gene identity cù B. sanyensis NV9, chì indicanu chì l'usu di un genu unicu cum'è u genu 16S rRNA pò purtà à classificazione è assignazione arbitraria. Un altru mètudu suggeritu usa ANI è Genome Alignment Score (AF) per esaminà u clustering di punti di dati da tutti i tipi è ceppi non-tipu di generi esistenti. L'autore ricumanda di cumminà u cunfini di u genus cù u puntu d'inflessione di u genus stimatu specificu à i taxa chì sò analizati. Tuttavia, s'ellu ùn ci hè micca abbastanza sequenze di genoma cumpletu da l'isolati Thalassolituus, hè impussibile di determinà se ASxL5T appartene à u genus Thalassolituus per questu metudu. A causa di a dispunibilità limitata di sequenze di genoma cumpletu per l'analisi, l'arbulu filogeneticu tutale di u genoma deve esse interpretatu cun prudenza. In siconda, i metudi di paraguni di genoma sanu ùn ponu micca cuntà differenze sustanziali in a dimensione di i genomi paragunati. Hanu misuratu a similitudine di i geni cunservati in una copia unica trà i generi rilativi, ma ùn anu micca cunsideratu u gran numaru di geni chì ùn sò micca prisenti in u genoma assai più chjucu di ASxL5T. Ovviamente, ASxL5T è gruppi cumpresi Thalassolituus, Oceanobacter è Bacterioplanes anu un antenatu cumunu, ma l'evoluzione hà pigliatu un percorsu sfarente, chì porta à una riduzzione di u genoma, chì pò esse adattatu à un modu di vita predatori. Questu hè in cuntrastu à T. oleivorans MIL-1T, chì hè 28% più grande è hà evolutu sottu diverse pressioni ambientali per utilizà hydrocarbons23,30. Una comparazione interessante pò esse fatta cù parassiti intracellulari obligati è simbionti, cum'è Rickettsia, Chlamydia è Buchnera. U so genoma hè di circa 1 Mb. A capacità d'utilizà metaboliti di e cellule d'ospiti porta à a perdita di geni, per quessa, hà subitu una degradazione genomica evolutiva significativa. I cambiamenti evolutivi da l'organismi di nutrienti chimichi marini à i stili di vita predatori ponu risultatu in una reduczione simile in a dimensione di u genoma. L'analisi COG è KEGG mette in risaltu u nùmeru di genes utilizati per funzioni specifiche è e differenzi globale in i camini genomici trà ASxL5T è T. oleivorans MIL-1T, chì ùn sò micca dovutu à a dispunibilità generalizata di elementi genetichi mobili. A diferenza in u rapportu G + C di tuttu u genomu di ASxL5T hè 56,1%, è quellu di T. oleivorans MIL-1T hè 46,6%, chì indica ancu chì hè segregatu.
L'esame di u cuntenutu di codificazione di u genoma ASxL5T furnisce una visione funziunale di e caratteristiche fenotipiche. A prisenza di geni chì codificanu u tipu IV fimbriae (Tfp) hè d'interessu particulari perchè prumove u muvimentu di e cellule, chjamatu gliding sociale o convulsioni, senza flagelli in a superficia. Sicondu i rapporti, Tfp hà altre funzioni, cumprese a predazione, a patogenesi, a furmazione di biofilm, l'assunzione di DNA naturali, l'agregazione automatica di e cellule è u sviluppu38. U genoma ASxL5T cuntene 18 geni chì codificanu diguanylate cyclase (un enzima chì catalizeghja a cunversione di 2 guanosina trifosfatu in guanosina 2 fosfatu è diGMP ciclicu) è 6 geni chì codificanu u currispundente diguanylate cyclase phosphate diguanylate. U genu per l'esterase (catalyzing the degradation of cyclic di-GMP to guanosine monophosphate) hè interessante perchè u cycl-di-GMP hè un impurtante second messager implicatu in u sviluppu di biofilm è a separazione, u muvimentu, l'attaccamentu cellulare è a virulenza 39, 40 in u prucessu. Hè ancu esse nutatu chì in Bdellovibrio bacteriovorus, u GMP ciclicu doppia hè statu dimustratu per cuntrullà a transizione trà a vita libera è u stilu di vita predatori41.
A maiò parte di a ricerca nantu à i battìri predatori hè stata focalizata nantu à Bdellovibrio, organismi simili à Bdellovibrio è spezie Myxococcus. Questi è altri esempi cunnisciuti di battìri predatori formanu un gruppu diversu. Malgradu sta diversità, un inseme di famiglie di proteine ​​​​caratteristiche chì riflettenu i fenotipi di 11 batteri predatori cunnisciuti sò stati identificati3,22. Tuttavia, solu i geni chì codificanu O antigen ligase (waaL) sò stati identificati, chì hè particularmente cumuni in i batteri Gram-negativi. Questa forma d'analisi ùn hè micca utile à designà ASxL5T cum'è predatore, probabilmente perchè usa una nova strategia d'attaccu. A dispunibilità di genomi batterichi predatori più diversi aiutarà à sviluppà analisi di risoluzione più fine chì piglianu in contu l'evidenza di differenze funziunali è ambientali trà i membri di u gruppu. Esempii di battìri predatori chì ùn sò micca inclusi in questa analisi includenu membri di Cupriavidus necator42 è Bradymonabacteria43, perchè cum'è i circadori investiganu e diverse comunità microbiche, più taxoni predatori sò stabiliti.
A caratteristica più notevuli di i batteri ASxL5T catturati da l'imaghjini TEM hè a so morfologia unica è flessibile, chì pò prumove l'interazzione cù i batteri di preda. U tipu d'interazzione osservatu hè diversu da l'altri batteri predatori è ùn hè micca statu scupertu o rappurtatu prima. U ciculu di vita predatori ASxL5T prupostu hè mostratu in a Figura 5. Ci sò pochi esempi in a literatura cù strutture apicale simili cum'è avemu infurmatu quì, ma questi esempi include Terasakiispira papahanaumokuakeensis, un bacterium spirillum marinu cù l'allargamentu di l'apex occasionale 44, è Alphaproteobacteria, Terasakiella pusilla. , autrefois appartenant au genre Oceanospirillum, exhibant le soi-disant "film polar" 45. Forme di Cocci sò spessu osservati in i culturi più vechji, in particulare per i battìri cù forme curve, cum'è Vibrio, Campylobacter è Helicobacter 46, 47, 48, chì ponu rapprisintà un statu degradatu. Ulteriore travagliu hè necessariu per chjarificà u ciculu di vita precisu di i batteri ASxL5T. Per determinà cumu cattura è prede, è se u so genoma codifica composti biologicamente attivi chì ponu esse aduprati per scopi medichi o biotecnologici.
Descrizzione di Venatorbacter gen. Novembre Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. hè cumpostu di venators da L. n. venator,'hunter' è Gr. n. bacter,'a rod'. Venatorbacter,'a hunting Rod'). Cells sò aerobichi, tolleranti à u salinu, curved Gram stain negativu, l'attività di l'eserciziu di l'ossidasi ùn sò micca accumule in a temperatura di 4 à 42 ° C Ingrown. U intervallu di pH di 4-9 hè inusual in i carabinii marini, a maiò parte di l'acidi grassi sò C16: 1ω6c è / o C16: 1ω9 : 0 3-OH è C10: 0 3-OH si trovanu cum'è l'acidi grassi idrossichi broth media. U cuntenutu di l'ADN G + C hè 56,1 % di u mole I membri di stu genus mostranu resistenza à Campylobacter E u cumpurtamentu di a predazione di i membri di a famiglia Enterobacteriaceae hè in a famiglia.
Description de Venatorbacter cucullus sp. Novembre Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus significa carenatura).
De plus, la caractéristique descriptive de ce genre est que lorsqu'elles sont cultivées sur BA ou BHI, les cellules mesurent 1,63 µm de long et 0,37 µm de large. I culunii nantu à l'agar BHI sò assai chjuchi, righjunghjendu 2 mm di diametru dopu à 72 ore. Sò beige, trasluzenti, tondi, cunvessi è brillanti. I membri di sta spezia ponu utilizà Escherichia coli è Klebsiella. Campylobacter è parechji altri batteri Gram-negativi servenu cum'è preda.
A ceppa tipica ASxL5T hè stata isolata da u latte di vacca in Nottinghamshire, u Regnu Unitu, è dipositu in a National Type Culture Collection (UK): u numeru di adesione NCTC 14397 è u numeru d'accessu di a Collezione Bacteriana di i Paesi Bassi (NCCB) NCCB 100775. A sequenza completa di u genoma di ASxL5T. hè statu dipositu in Genbank secondu l'aghjuntu di CP046056.
I batteri ASxL5T sò stati isolati da u latte di carne cù a tecnulugia di isolamentu di fagi9,49. A slurry hè stata diluita 1: 9 (w / v) in SM buffer (50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 0.1 M NaCl, 8 mM MgSO4.7H2O è 0.01% gelatina; Sigma Aldrich, Gillingham, UK), Poi incubate. à 4 ° C per 24 ore, rotendu lentamente per eluzione di i predatori in u buffer. A sospensjoni hè stata centrifugata à 3000 g per 3 minuti. U supernatant hè stata cullata è centrifugata à 13.000 g per una seconda volta per 5 minuti. Le surnatant a ensuite été passé à travers un filtre à membrane de 0,45 µm (Minisart; Sartorius, Göttingen, Allemagne) et un filtre à membrane de 0,2 µm (Minisart) pour éliminer toutes les cellules bactériennes restantes. ASxL5T pò passà sti filtri. Un gazon d'agar molle de Campylobacter enterosus S12 (numéro d'accession NCBI CP040464) à partir de la même suspension a été préparé à l'aide de techniques standard. La suspension filtrée a été distribuée sur chacune de ces plaques de cellules hôtes en gouttelettes de 10 µl en triple et laissé sécher. A piastra hè stata incubata in un tank microaerophilic à 37 ° C per 48 ore in cundizioni microaerobiche (5% O2, 5% H2, 10% CO2 è 80% N2). A placca visibile ottenuta hè stata estratta in u buffer SM è trasfiruta à u prato frescu di C. hyointestinalis S12 per propagate più l'organisimi lisi. Quandu hè determinatu chì i battìri sò a causa di a placca litica è micca u fage, pruvate à cultivà l'organismu indipindentamente di l'ospiti è più carattarizà. A cultura aerobica hè stata eseguita à 37 ° C cù sangue di cavallu defibrinatu 5% v/v (TCS Biosciences Lt, Buckingham, UK, supplementu). Sicondu a guida di u Cunsigliu Naziunale di Norme Cliniche, u metudu di diffusione di discu hè utilizatu per a prova di suscettibilità antibacteriana. L'agar BHI hè stata cultivata à 37 ° C cù un discu chì cuntene i seguenti antibiotici (Oxoid) per a cultura aerobica: amoxicillina è l'acidu clavulanic 30 µg; cefotaxima 30 µg; streptomicina 10 µg; ciprofloxacina 5 µg; Ceftazidime 30 µg Acidu Nalidixic 30 µg; Imipenem 10 µg; azitromicina 15 µg; Chloramphenicol 30 µg; Cefoxitin 30 µg; Tetraciclina 30 µg; Nitrofurantoina 300 µg; Aztreonam 30 µg; Ampicilline 10 µg; Cefpodoxime 10 µg; Triméthoprim-Sulfamethoxazole 25 µg. A tolleranza di u sali hè stata stabilita da incubazione aerobica nantu à piastre di agar BHI à 37 ° C. NaCl supplementu hè statu aghjuntu à i piatti di agar BHI per furnisce un intervallu di cuncentrazione finu à u 10% p/v. L'intervallo di pH hè determinatu da a cultura aerobica nantu à i platti di agar BHI à 37 ° C, induve a gamma di pH hè stata aghjustata trà 4 è 9 cù HCl sterile o NaOH sterile, è u valore di pH target hè verificatu prima di versà a piastra. Per l'analisi di l'acidu grassu cellulare, ASxL5T hè stata cultivata nantu à agar BHI per 3 ghjorni è aerobica à 37 ° C. Sicondu u protocolu standard MIDI (Sherlock Microbial Identification System, versione 6.10) di FERA Science Ltd, (York, UK), l'acidi grassi di e cellule sò stati estratti, preparati è analizati.
Per TEM, ASxL5T hè stata cultivata aerobica sparghjendu uniformemente nantu à BA à 37 ° C per 24 ore, è poi raccolte in 1 ml di glutaraldeide 3% (v / v) in tampone cacodylate 0,1 M à temperatura ambiente Fix per 1 ora, dopu centrifuga. à 10.000 g per 3 minuti. Allora resuspende delicatamente u pellet in 600 μl 0,1 M tampon cacodylate. Trasferisce a sospensione ASxL5T fissa à a film Formvar / carbone nantu à una griglia di cobre di 200 mesh. I batteri sò stati macchiati cù 0.5% (w / v) acetate di uranilu per 1 minutu è esaminati da TEM cù un microscopiu TEI Tecnai G2 12 Biotwin. Cum'è menzionatu sopra, combina u listessu numeru di preda è predatore in u brodu NZCYM (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) è incubate per 48 ore in cundizioni microaerobiche di Campylobacter o Campylobacter à 37 ° C, L'interazione di predatore è preda. hè statu ancu esaminatu da TEM. Condizioni aerobiche per Escherichia coli. Esaminà indipindentamente a preda è i batteri predatori per determinà qualsiasi cambiamenti in a morfologia cellulare per via di a predazione. U metudu neru di u Sudan hè stata utilizata per a microscopia ottica di l'accumulazione di PHB.
Cultivate i culturi ASxL5T durante a notte spallandu a crescita nantu à i piatti BHI o BA cù un tampone sterile. Raccoglie e cellule ASxL5T è suspende in MRD (CM0733, Oxoid), è poi mette à 4 ° C per 7 ghjorni per fame e cellule. A cultura bacteriana di riferimentu NCTC o di u laboratoriu di u laboratoriu hè stata inoculata in brou BHI o caldo nutriente N ° 2 (CM007, Oxoid), incubata durante a notte, centrifugata à 13,000g è resuspended in MRD finu à OD600 era 0,4. Coltura: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, Klebsiella oxytoca, Lebsiella oxytoca, Lebsiella oxytoca NCTC1146c6, Listeria Special bacteria NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, Rhodococcus submarine hamburger NCTC 1621T, Salmonella intestinal bacteria Mondeville NCTC 5786NCTC, Stalocophy 57867 aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. L'ospiti Campylobacter hè statu incubatu microaerobically nantu à i platti BA à 37 ° C è suspesi in brodu NZCYM. L'ospiti di Campylobacter testati sò: C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11458, C. lari NCTC 11458, C1. PT14, C... Raccoglie e cellule in MRD, centrifuga a 13 000 g è risuspende in MRD finu à chì OD600 hè 0,4. Aghjunghjite una aliquota di 0,5 ml di sospensione à 5 ml di agar top NZCYM fondu (0,6% agar) è versà nantu à una piastra di fondu NZCYM 1,2%. Dopu a cure è l'asciugatura, l'ASxL5T diluita in serie hè stata distribuita cum'è 20 µl di gocce nantu à ogni tavola di prato in triplicatu. A temperatura di a cultura è l'atmosfera dipendenu da e esigenze di a bacteria di prova.
Aduprate GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma Aldridge) per preparà l'ADN da isolati batterichi. I metudi standard sò stati utilizati per l'amplificazione PCR di u genu 16S rRNA è a determinazione di a sequenza di u produttu utilizendu a chimica di terminazione di tintura (Eurofins Value Read Service, Germania). Aduprate u prugramma BLAST-N per paragunà queste sequenze cù altre sequenze di geni 16S rRNA per identificà è cullà spezie strettamente ligati. Questi sò allinati cù ClustalW in u prugramma MEGA X. L'arbre filogeneticu hè statu ricustruitu cù MEGA X cù u metudu di probabilità massima basatu annantu à u mudellu Tamura-Nei, cù 1000 copie guidate54. Aduprate PureLink™ Genomic DNA Kit (Fisher Scientific, Loughborough, UK) per estrarre l'ADN per a sequenza di u genoma interu. A sequenza di u genoma di ASxL5T hè stata determinata utilizendu a cumminazzioni Illumina MiSeq, chì hè custituita da 250 bp letture duppie cumposti da una biblioteca preparata cù u kit di etichettatura Nextera è 2 à 20 kb long reads da a piattaforma PacBio. Facilità di Ricerca di Sequenza di DNA Genomica à l'Università Sembia. U genoma hè statu assemblatu cù CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen, Aarhus, Danimarca). I culturi ASxL5T sò dipositati in a National Type Culture Collection (UK) è a Netherlands Bacterial Culture Collection (NCCB). I genomi di l'urganismi rilativi utilizati per a paraguni sò: Thalassolituus oleivorans MIL-1T (numeru d'accessu HF680312, cumpletu); Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (numeru d'accessu BMYY01000001, incomplete); Oceanobacter kriegii DSM 6294T (numeru d'accessu NZ_AUGV00000000, incomplete); Marinamonas community DSM 5604T (aghjunghje ASM436330v1, incomplete), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (aghjunghje MTSD02000001, incomplete) è Thalassolituus sp. C2-1 (aghjunghje NZ_VNIL01000001, incomplete). Aduprate JGI Genome Portal36 à https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page= per determinà u puntu di allineamentu (AF) è l'identità media di l'acidu nucleicu (ANI). In coppie. U metudu di Rodriguez-R & Konstantinidis55 hè stata utilizata per determinà l'identità di l'aminoacidu (AAI). Aduprate GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 per generà un arbulu filogeneticu di probabilità massima stimata. U genoma di input chì rapprisenta u genoma di riferimentu dispunibule hè sceltu da i generi di riferimentu identificati cum'è in relazione cù ASxL5T da a filogenesi di rRNA 16S. Annotated l'arbulu utilizendu l'arburu interattivu di a vita in linea (https://itol.embl.de/). L'annotazione funzionale è l'analisi di u genoma ASxL5T sò realizati cù l'utile in linea BlastKOALA KEGG utilizendu a distribuzione di arricchimentu di moduli KEGG (Enciclopedia di Kyoto di Genes and Genomes). A distribuzione di categurie COG (gruppi ortologhi) hè determinata cù l'uttellu in linea eggNOG-mapper.
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