Nový typ gramnegativních, aerobních, sůl tolerantních, aktivních, tyčinkovitých a dravých bakterií ASxL5T byl izolován z jezírka s kravským hnojem v Nottinghamshire v Anglii a jako svou kořist použil Campylobacter. Následně byly jako kořist objeveny další druhy Campylobacter a zástupci čeledi Enterobacteriaceae. Po subkultivaci bez hostitelských buněk bylo dosaženo slabého aseptického růstu na Brain Heart Infusion Agar. Optimální podmínky růstu jsou 37 °C a pH 7. Transmisní elektronová mikroskopie odhalila některé velmi neobvyklé morfologické rysy související s dostupností kořisti. Fylogenetická analýza s použitím sekvence genu 16S rRNA ukázala, že izolát je příbuzný s členem rodiny Marine Spirulina, ale nemůže být jasně klasifikován jako člen žádného známého rodu. Celogenomové sekvenování ASxL5T potvrdilo příbuznost se členy mořských spirochet. Vyhledávání v databázi odhalilo, že několik ASxL5T sdílí sekvence genu 16S rRNA s několika nekultivovanými bakteriemi z oceánu, zemského povrchu a podzemních vod. Navrhujeme, aby kmen ASxL5T představoval nový druh v novém rodu. Doporučujeme jméno Venatorbacter cucullus gen. listopad, sp. V listopadu byl jako typový kmen použit ASxL5T.
Dravé bakterie jsou bakterie, které vykazují schopnost lovit a zabíjet jiné živé bakterie, aby získaly biosyntetické materiály a energii. To se liší od obecného získávání živin z mrtvých mikroorganismů a také se liší od parazitických interakcí, při kterých si bakterie vytvářejí úzký vztah se svým hostitelem, aniž by je zabíjely. Dravé bakterie si vyvinuly různé životní cykly, aby využily bohatých zdrojů potravy ve výklencích, kde se nacházejí (jako jsou mořské biotopy). Jedná se o taxonomicky různorodou skupinu, kterou spojuje pouze jedinečný životní cyklus sterilizace1. Příklady predátorských bakterií byly nalezeny v několika různých kmenech, včetně: Proteobakterií, Bacteroides a Chlorella.3. Nejvíce dobře prozkoumanými predátorskými bakteriemi jsou však Bdellovibrio a Bdellovibrio-and-like organismy (BALOs4). Predátorské bakterie jsou slibným zdrojem nových biologicky aktivních sloučenin a antibakteriálních látek5.
Předpokládá se, že dravé bakterie zvyšují mikrobiální diverzitu a mají pozitivní dopad na zdraví, produktivitu a stabilitu ekosystému6. Navzdory těmto pozitivním vlastnostem existuje jen málo studií o nových predátorských bakteriích kvůli obtížnosti kultivace bakterií a nutnosti pečlivě sledovat buněčné interakce, abychom pochopili jejich složité životní cykly. Tyto informace není snadné získat z počítačové analýzy.
V éře rostoucí antimikrobiální rezistence se studují nové strategie cílení na bakteriální patogeny, jako je použití bakteriofágů a predátorských bakterií7,8. Bakterie ASxL5T byly izolovány v roce 2019 pomocí technologie fágové izolace z kravského trusu odebraného z Dairy Center na University of Nottingham, Nottinghamshire. Účelem výzkumu je izolovat organismy s potenciálem jako činitelé biologické kontroly. Campylobacter hyointestinalis je zoonotický patogen, který je stále častěji spojován s onemocněními lidských střev10. Je všudypřítomný v séru a používá se jako cílový hostitel.
Bakterie ASxL5T byla izolována z hovězího želé, protože bylo pozorováno, že plaky, které vytvořila na trávníku C. hyointestinalis, byly podobné těm, které produkovaly bakteriofágy. To je neočekávané zjištění, protože část procesu izolace fágů zahrnuje filtraci přes 0,2 µm filtr, který je navržený k odstranění bakteriálních buněk. Mikroskopické zkoumání materiálu extrahovaného z plaku odhalilo, že malé gramnegativní zakřivené tyčinkovité bakterie neakumulovaly polyhydroxybutyrát (PHB). Aseptická kultivace nezávislá na buňkách kořisti je realizována na bohatém pevném médiu (jako je mozko-srdcový infuzní agar (BHI) a krevní agar (BA)) a její růst je slabý. Získává se po zlepšení subkultury s těžkým inokulem. Roste stejně dobře za mikroaerobních (7 % obj. kyslíku) a atmosférického kyslíku, ale ne v anaerobní atmosféře. Po 72 hodinách byl průměr kolonie velmi malý, dosahoval 2 mm, a byl béžový, průsvitný, kulatý, konvexní a lesklý. Standardní biochemické testování je ztíženo, protože ASxL5T nelze spolehlivě kultivovat v tekutém médiu, což naznačuje, že se může spoléhat na složitý životní cyklus tvorby biofilmu. Suspenze destičky však ukázala, že ASxL5T je aerobní, pozitivní na oxidázu a katalázu a může tolerovat 5% NaCl. ASxL5T je odolný vůči 10 µg streptomycinu, ale je citlivý na všechna ostatní testovaná antibiotika. Bakteriální buňky ASxL5T byly zkoumány pomocí TEM (obrázek 1). Při pěstování bez buněk kořisti na BA jsou buňky ASxL5T malé Campylobacter s průměrnou délkou 1,63 μm (± 0,4), šířkou 0,37 μm (± 0,08) a jedním dlouhým (až 5 μm) pólem. Sexuální bičíky. Zdá se, že přibližně 1,6 % buněk má šířku menší než 0,2 μm, což umožní průchod přes filtrační zařízení. Na vrcholu některých buněk bylo pozorováno neobvyklé strukturální rozšíření, podobné kapotáži (latinsky cucullus) (viz šipky na 1D, E, G). Zdá se, že se skládá z přebytečné vnější membrány, což může být způsobeno rychlým zmenšením velikosti periplazmatického obalu, zatímco vnější membrána zůstává neporušená a vykazuje „volný“ vzhled. Kultivace ASxL5T v nepřítomnosti živin (v PBS) po dlouhou dobu při 4 °C vedla k tomu, že většina (ale ne všechny) buňky vykazovala kokální morfologii (obrázek 1C). Když ASxL5T roste s Campylobacter jejuni jako kořistí po dobu 48 hodin, průměrná velikost buněk je významně delší a užší než u buněk pěstovaných bez hostitele (tabulka 1 a obrázek 1E). Naproti tomu, když ASxL5T roste s E. coli jako kořistí po dobu 48 hodin, průměrná velikost buněk je delší a širší, než když roste bez kořisti (tabulka 1), a délka buněk je proměnná, obvykle vláknitá (obrázek 1F). Při inkubaci s Campylobacter jejuni nebo E. coli jako kořistí po dobu 48 hodin nevykazovaly buňky ASxL5T vůbec žádné bičíky. Tabulka 1 shrnuje pozorování změn velikosti buněk na základě přítomnosti, nepřítomnosti a typu kořisti ASxL5T.
Zobrazení TEM ASx5LT: (A) ASx5LT ukazuje dlouhý bič; (B) typická baterie ASx5LT; (C) buňky ASx5LT koků po dlouhé inkubaci bez živin; (D) skupina buněk ASx5LT vykazuje abnormalitu (E) Skupina buněk ASx5LT inkubovaná s kořistí Campylobacter vykazovala zvýšenou buněčnou délku ve srovnání s buňkami bez růstu kořisti (D) také vykazovala apikální strukturu; (F) Velké vláknité bičíky, buňky ASx5LT, po inkubaci s kořistí E. coli; (G) Jedna buňka ASx5LT po inkubaci s E. coli, vykazující neobvyklou horní strukturu. Pruh představuje 1 μm.
Určení sekvence genu 16S rRNA (přístupové číslo MT636545.1) umožňuje prohledávání databáze za účelem stanovení sekvencí podobných těm ve třídě Gammaproteobacteria a jsou nejblíže mořským bakteriím z čeledi spirillum mořských (obrázek 2) a jsou členy rodu Thalassolituus Nejbližší příbuzný Marine Bacillus. Sekvence genu 16S rRNA se jasně liší od predátorských bakterií patřících do čeledi Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria). Párová srovnání B. bacteriovorus HD100T (typový kmen, DSM 50701) a B. bacteriovorus DM11A byla 48,4 % a 47,7 % a pro B. exovorus JSS to bylo 46,7 %. Bakterie ASxL5T mají 3 kopie genu 16S rRNA, z nichž dvě jsou navzájem identické a třetí je od sebe vzdálena 3 báze. Dva další predátorské bakteriální izoláty (ASx5S a ASx5O; přírůstková čísla genu 16S rRNA jsou MT636546.1 a MT636547.1, v tomto pořadí) s podobnými morfologickými a fenotypovými charakteristikami ze stejné lokality nejsou stejné, ale liší se od ASxL5T a nekultivovaných bakterií databázové sekvence jsou seskupeny společně s jinými rody v Oceanospirillaceae (Obrázek 2). Celá genomová sekvence ASxL5T byla určena a uložena v databázi NCBI a přístupové číslo je CP046056. Genom ASxL5T se skládá z kruhového chromozomu 2 831 152 bp s poměrem G + C 56,1 %. Sekvence genomu obsahuje 2653 CDS (celkem), z nichž se předpokládá, že 2567 kóduje proteiny, z nichž 1596 lze přiřadit jako domnělé funkce (60,2 %). Genom obsahuje 67 genů kódujících RNA, včetně 9 rRNA (3 každá pro 5S, 16S a 23S) a 57 tRNA. Genomické charakteristiky ASxL5T byly porovnány s dostupnými genomy kmenů nejbližšího relativního typu identifikovaných z genové sekvence 16S rRNA (tabulka 2). Použijte aminokyselinovou identitu (AAI) k porovnání všech dostupných genomů Thalassolituus s ASxL5T. Nejbližší dostupná (nekompletní) genomová sekvence určená AAI je Thalassolituus sp. C2-1 (přidat NZ_VNIL01000001). Tento kmen byl izolován z hlubokomořských sedimentů Marianského příkopu, ale v současné době neexistují žádné fenotypové informace o tomto kmeni pro srovnání. Ve srovnání s ASxL5T je 2,82 Mb, genom organismu je větší na 4,36 Mb. Průměrná velikost genomu mořských spirochet je asi 4,16 Mb (± 1,1; n = 92 kompletních referenčních genomů zkoumaných z https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), takže genom ASxL5T je v souladu s řádu Oproti ostatním členům je poměrně malý. Použijte GToTree 1.5.54 k vytvoření odhadovaného fylogenetického stromu maximální pravděpodobnosti založeného na genomu (obrázek 3A), pomocí zarovnaných a spojených aminokyselinových sekvencí 172 genů s jednou kopií specifických pro Gammaproteobacteria 11,12,13,14,15,16, 17,18. Analýza ukázala, že úzce souvisí s Thalassolituus, Bacterial Plane a Marine Bacterium. Tyto údaje však naznačují, že ASxL5T se liší od svých příbuzných v mořské Spirulině a jsou k dispozici údaje o jeho genomové sekvenci.
Fylogenetický strom využívající genovou sekvenci 16S rRNA zvýrazňuje pozici kmenů ASxL5T, ASxO5 a ASxS5 (se střevy) vzhledem k nekultivovaným a mořským bakteriálním kmenům v mořských spirulinaceae. Přírůstkové číslo Genbank následuje za názvem kmene v závorkách. Použijte ClustalW k seřazení sekvencí a použijte metodu maximální pravděpodobnosti a Tamura-Neiův model k odvození fylogenetických vztahů a proveďte 1000 řízených replikací v programu MEGA X. Číslo na větvi udává, že hodnota řízené kopie je větší než 50 %. Jako vnější skupina byla použita Escherichia coli U/541T.
(A) Fylogenetický strom založený na genomu, ukazující vztah mezi mořskou bakterií Spirospiraceae ASxL5T a jejími blízkými příbuznými, E. coli U 5/41T jako vnější skupinou. (B) Ve srovnání s T. oleivorans MIL-1T je distribuce funkčních kategorií genů predikována na základě shluku ortologních skupin (COG) proteinu ASx5LT. Obrázek vlevo ukazuje počet genů v každé funkční kategorii COG v každém genomu. Graf vpravo ukazuje procento genomů obsažených v každé funkční skupině COG. (C) Ve srovnání s T. oleiverans MIL-1T, analýza kompletní KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) modulární dráhy ASxL5T.
Použití databáze KEGG ke zkoumání komponentních genů přítomných v genomu ASxL5T odhalilo typickou metabolickou dráhu aerobního gama Proteus. ASxL5T obsahuje celkem 75 genů přiřazených bakteriálním motorickým proteinům, včetně genů zapojených do chemotaxe, sestavování bičíků a systému fimbrií typu IV. V poslední kategorii je 9 z 10 genů zodpovědných za škubavý pohyb řady dalších organismů. Genom ASxL5T obsahuje kompletní tetrahydropyrimidinovou biosyntetickou dráhu, která se účastní ochranné reakce na osmotický stres20, jak se očekává u halofilů. Genom také obsahuje mnoho kompletních drah pro kofaktory a vitamíny, včetně drah syntézy riboflavinu. Ačkoli je v ASxL5T přítomen gen alkan 1-monooxygenázy (alkB2), cesta využití uhlovodíků není úplná. V genomové sekvenci ASxL5T evidentně chybí homology genů identifikovaných jako hlavní odpovědné za degradaci uhlovodíků v T. oleiverans MIL-1T21, jako je TOL_2658 (alkB) a TOL_2772 (alkoholdehydrogenáza). Obrázek 3B ukazuje srovnání distribuce genů v kategorii COG mezi ASxL5T a olivovým olejem MIL-1T. Celkově menší genom ASxL5T obsahuje proporcionálně méně genů z každé kategorie COG ve srovnání s větším příbuzným genomem. Když je počet genů v každé funkční kategorii vyjádřen jako procento genomu, jsou zaznamenány rozdíly v procentu genů v kategoriích translace, ribozomální struktury a biogeneze a kategoriích funkcí produkce a konverze energie, které tvoří větší ASxL5T. genom Procento je porovnáno se stejnou skupinou přítomnou v T. oleiverans MIL-1T genomu. Naproti tomu ve srovnání s genomem ASxL5T má T. oleivorans MIL-1T vyšší procento genů v kategoriích replikace, rekombinace a opravy a transkripce. Je zajímavé, že největším rozdílem v obsahu každé funkční kategorie těchto dvou genomů je počet neznámých genů přítomných v ASxL5T (obrázek 3B). Byla provedena analýza obohacení modulů KEGG, kde každý modul KEGG představuje sadu ručně definovaných funkčních jednotek pro anotaci a biologickou interpretaci dat genomové sekvence. Porovnání distribuce genů v kompletní dráze KOG modulu ASxL5T a olivového MIL-1T je znázorněno na obrázku 3C. Tato analýza ukazuje, že ačkoli ASxL5T má kompletní metabolickou dráhu síry a dusíku, T. oleiverans MIL-1T nikoli. Naproti tomu T. oleiverans MIL-1T má kompletní metabolickou dráhu cysteinu a methioninu, ale u ASxL5T je neúplná. Proto má ASxL5T charakteristický modul pro asimilaci sulfátů (definovaný jako soubor genů, které lze použít jako fenotypové markery, jako je metabolická kapacita nebo patogenita; https://www.genome.jp/kegg/module.html) In T oleiverans MIL-1T. Srovnání genového obsahu ASxL5T se seznamem genů, které naznačují predátorský životní styl, je neprůkazné. Ačkoli gen waaL kódující ligázu asociovanou s polysacharidem O antigenu k jádru je přítomen v genomu ASxL5T (ale je běžný u mnoha gramnegativních bakterií), geny pro tryptofan 2,3-dioxygenázu (TDO ) mohou zahrnovat 60 aminoskupin. kyselé oblasti běžně se vyskytující u predátorských bakterií, které nejsou přítomny. V genomu ASxL5T nejsou žádné další predátorské charakteristické geny, včetně těch, které kódují enzymy zapojené do biosyntézy izoprenoidu v mevalonátové dráze. Všimněte si, že ve zkoumané skupině predátorů není žádný transkripční regulační gen gntR, ale v ASxL5T lze identifikovat tři geny podobné gntR.
Fenotypové charakteristiky ASxL5T jsou shrnuty v tabulce 3 a porovnány s fenotypovými charakteristikami příbuzných rodů 23, 24, 25, 26 a 27 uváděnými v literatuře. Izoláty z T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis a Oceanobacter kriegii jsou aktivní, sůl tolerantní, oxidáza-pozitivní tyčinkovitá tělíska, ale nemají téměř žádné jiné fenotypové charakteristiky s ASxL5T. Průměrné pH oceánu je 8,1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77), což se odráží u T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis a O. kriegii. ASxL5T je vhodný pro větší rozsah pH (4-9) typický pro nemořské druhy. Fenotypové charakteristiky Thalassolituus sp. C2-1. Neznámý. Rozsah růstových teplot ASxL5T je obecně širší než u mořských kmenů (4–42 °C), ačkoli některé, ale ne všechny izoláty T. marinus jsou odolné vůči teplu. Neschopnost růst ASxL5T v bujónovém médiu zabránila další fenotypové charakterizaci. Pomocí API 20E otestujte materiály seškrábané z BA destičky, ONPG, arginin dihydrolázu, lysin dekarboxylázu, ornitin dekarboxylázu, využití citrátu, ureázu, tryptofan deaminázu, enzym hydrolýzu želatiny, výsledky testu byly všechny negativní, ale žádný indol, acetoin a H2 byly vyrobeny. Mezi nefermentované sacharidy patří: glukóza, manóza, inositol, sorbitol, rhamnóza, sacharóza, melibióza, amygdalin a arabinóza. Ve srovnání s publikovanými souvisejícími referenčními kmeny je profil buněčných mastných kyselin kmene ASxL5T uveden v tabulce 4. Hlavními buněčnými mastnými kyselinami jsou C16:1co6c a/nebo C16:1co7c, C16:0 a C18:1co9. Existují také hydroxymastné kyseliny C12:0 3-OH a C10:0 3-OH. Poměr C16:0 u ASxL5T je vyšší než udávaná hodnota příbuzných rodů. Naproti tomu ve srovnání s hlášeným T. marinus IMCC1826TT je poměr C18:1ω7c a/nebo C18:1ω6c v ASxL5T snížen. oleivorans MIL-1T a O. kriegii DSM 6294T, ale nebyl detekován v B. sanyensis KCTC 32220T. Porovnání profilů mastných kyselin ASxL5T a ASxLS odhalilo jemné rozdíly v množství jednotlivých mastných kyselin mezi těmito dvěma kmeny, které jsou v souladu se sekvencí genomové DNA stejného druhu. Pomocí testu súdánskou černí nebyly detekovány žádné částice poly-3-hydroxybutyrátu (PHB).
Byla studována predační aktivita bakterií ASxL5T za účelem stanovení rozsahu kořisti. Tato bakterie může tvořit plaky na druzích Campylobacter, včetně: Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T; Escherichia coli NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; Clari NCTC 11458 a C. uppsaliensis NCTC 11541T. K testování širšího spektra gramnegativních a grampozitivních bakterií použijte kultury uvedené v části stanovení hostitelského rozsahu metody. Výsledky ukazují, že ASxL5T lze použít také u Escherichia coli NCTC 86 a Citrobacter freundii NCTC 9750T. Plaky vytvořené na Klebsiella oxytoca 11466. Interakce TEM s E. coli NCTC 86 je znázorněna na obrázku 4A-D a interakce s Campylobacter jejuni PT14 a Campylobacter suis S12 je znázorněna na obrázku 4E-H uprostřed. Mechanismus útoku se zdá být u testovaných typů kořisti odlišný, s jednou nebo více buňkami E. coli připojenými ke každé buňce ASxL5T a umístěnými laterálně podél rozšířené buňky před adsorpcí. Na rozdíl od toho se zdá, že ASxL5T se váže na Campylobacter prostřednictvím jediného kontaktního bodu, obvykle v kontaktu s vrcholem buňky predátora a blízko vrcholu buňky Campylobacter (obrázek 4H).
TEM ukazující interakci mezi ASx5LT a kořistí: (AD) a E. coli kořistí; (EH) a C. jejuni kořist. (A) Typická buňka ASx5LT připojená k jedné buňce E. coli (EC); (B) Vláknitý ASx5LT připojený k jedinému EC článku; (C) Vláknitý článek ASx5LT spojený s více EC články; (D) Připojení menších buněk ASx5LT na jednu buňku E. coli (EC); (E) jediná buňka ASx5LT spojená s buňkou Campylobacter jejuni (CJ); (F) ASx5LT napadá buňky C. hyointestinalis (CH); (G) dvě Jedna buňka ASx5LT napadla CJ buňku; (H) Detailní pohled na bod připojení ASx5LT poblíž vrcholu CJ buňky (sloupec 0,2 μm). Sloupec představuje 1 μm in (A–G).
Dravé bakterie se vyvinuly, aby využívaly hojné zdroje kořisti. Je zřejmé, že jsou široce přítomny v mnoha různých prostředích. Vzhledem k úzké velikosti členů populace je možné izolovat bakterie ASxL5T ze suspenze pomocí metody fágové separace. Genomický význam ASxL5T pro členy čeledi mořských bakterií oceanospirillaceae je překvapující, ačkoli organismus je odolný vůči soli a může růst na médiu obsahujícím 5 % soli. Analýza kvality vody v suspenzi ukázala, že obsah chloridu sodného byl nižší než 0,1 %. Proto je bahno daleko od mořského prostředí – geograficky i chemicky. Přítomnost tří příbuzných, ale odlišných izolátů ze stejného zdroje poskytuje důkaz, že těmto predátorům se v tomto nemořském prostředí daří. Kromě toho analýza mikrobiomu (soubory dat dostupné na https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990) ukázala, že stejná sekvence genu 16S rRNA se nachází v top 50 nejhojnějších provozních taxonech (OTU ) V několika intervalech odběru bahna. V databázi Genbank bylo nalezeno několik nekultivovaných bakterií, které mají genové sekvence 16S rRNA podobné bakteriím ASxL5T. Zdá se, že tyto sekvence spolu se sekvencemi ASxL5T, ASxS5 a ASxO5 představují různé klady oddělené od Thalassolituus a Oceanobacter (obrázek 2). Tři druhy nekultivovaných bakterií (GQ921362, GQ921357 a GQ921396) byly izolovány z puklinové vody v hloubce 1,3 kilometru v jihoafrickém zlatém dole v roce 2009 a další dva (DQ256320 a DQ337006) byly z podzemní vody (také v roce 2005). Sekvence genu 16S rRNA nejblíže související s ASxL5T je součástí sekvence genu 16S rRNA získané z obohacené kultury písčitých sedimentů získaných z pláží severní Francie v roce 2006 (přístupové číslo AM29240828). Další blízce příbuzná genová sekvence 16S rRNA z nekultivované bakterie HQ183822.1 byla získána ze sběrné nádrže vyluhované z komunální skládky v Číně. Je zřejmé, že bakterie ASxL5T nejsou v taxonomických databázích vysoce reprezentativní, ale tyto sekvence z nekultivovaných bakterií pravděpodobně představují organismy podobné ASxL5T, které jsou distribuovány po celém světě, obvykle v náročných prostředích. Z celogenomové fylogenetické analýzy je ASxL5T nejbližší příbuzný Thalassolituus sp. C2-1, T. marinus, T. oleivorans. A O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus je členem mořských obligátních uhlovodíkových fragmentačních bakterií (OHCB), které jsou rozšířené v mořském a suchozemském prostředí a obvykle se stávají dominantními po incidentech znečištění uhlovodíky30,31. Mořské bakterie nejsou členy skupiny OHCB, ale jsou izolovány z mořského prostředí.
Fenotypová data naznačují, že ASxL5T je nový druh a člen dříve nerozpoznaného rodu v čeledi mořských spirospiraceae. V současnosti neexistuje jasný standard pro klasifikaci nově izolovaných kmenů do nového rodu. Byly učiněny pokusy o stanovení hranic univerzálních rodů, například na základě procenta genomu konzervativního proteinu (POCP) se doporučuje, aby hraniční hodnota byla z 50 % identická s referenčním kmenem33. Jiní navrhují použít hodnoty AAI, které mají oproti POCP výhody, protože je lze získat z neúplných genomů34. Autor se domnívá, že pokud je hodnota AAI nižší než 74 % ve srovnání s modelovým kmenem modelového druhu, kmen je zástupcem jiných rodů. Modelový rod v mořských spirillaceae je spirillum mořský a modelový kmen je O. linum ATCC 11336T. Hodnota AAI mezi ASxL5T a O. linum ATCC 11336T je 54,34 % a hodnota AAI mezi ASxL5T a T. oleivorans MIL-1T (kmeny rodového typu) je 67,61 %, což ukazuje, že ASxL5T představuje nový rod odlišný od Thalassolituus. Při použití sekvence genu 16S rRNA jako klasifikačního standardu je navrhovaná hranice vymezení rodu 94,5 %35. ASxL5T může být umístěn do rodu Thalassolituus, vykazující 95,03% identitu sekvence 16S rRNA s T. oleivorans MIL-1T a 96,17%. marinus IMCC1826T. Bude však také umístěn do rodu Bacteroides, který má 94,64% identitu genu 16S rRNA s B. sanyensis NV9, což naznačuje, že použití jediného genu, jako je gen 16S rRNA, může vést k libovolné klasifikaci a přiřazení. Další navrhovaná metoda využívá ANI a skóre zarovnání genomu (AF) ke zkoumání shlukování datových bodů ze všech typů a netypových kmenů existujících rodů. Autor doporučuje kombinovat hranici rodu s inflexním bodem odhadovaného rodu specifického pro analyzované taxony. Pokud však není dostatek kompletních genomových sekvencí z izolátů Thalassolituus, není možné touto metodou určit, zda ASxL5T patří do rodu Thalassolituus. Vzhledem k omezené dostupnosti kompletních sekvencí genomu pro analýzu by měl být celý fylogenetický strom genomu interpretován opatrně. Za druhé, celogenomové srovnávací metody nemohou vysvětlit podstatné rozdíly ve velikosti porovnávaných genomů. Měřili podobnost konzervovaných základních jednokopiových genů mezi příbuznými rody, ale nebrali v úvahu velký počet genů, které nejsou přítomny v mnohem menším genomu ASxL5T. Je zřejmé, že ASxL5T a skupiny včetně Thalassolituus, Oceanobacter a Bacterioplanes mají společného předka, ale evoluce se vydala jinou cestou, což vede k redukci genomu, což může být přizpůsobení se predátorskému životnímu stylu. To je na rozdíl od T. oleivorans MIL-1T, který je o 28 % větší a vyvinul se pod různými tlaky prostředí, aby využil uhlovodíky23,30. Zajímavé srovnání lze provést s obligátními intracelulárními parazity a symbionty, jako jsou Rickettsia, Chlamydia a Buchnera. Velikost jejich genomu je asi 1 Mb. Schopnost využívat metabolity hostitelské buňky vede ke ztrátě genu, takže prošla významnou evoluční genomickou degradací. Evoluční změny od mořských chemických živinových organismů k predátorskému životnímu stylu mohou vést k podobnému snížení velikosti genomu. Analýza COG a KEGG zdůrazňuje počet genů používaných pro specifické funkce a globální rozdíly v genomových drahách mezi ASxL5T a T. oleivorans MIL-1T, které nejsou způsobeny širokou dostupností mobilních genetických elementů. Rozdíl v poměru G + C celého genomu ASxL5T je 56,1 % a rozdílu T. oleivorans MIL-1T je 46,6 %, což také naznačuje, že je segregovaný.
Zkoumání obsahu kódování genomu ASxL5T poskytuje funkční vhled do fenotypových charakteristik. Přítomnost genů kódujících fimbrie typu IV (Tfp) je zvláště zajímavá, protože podporují buněčný pohyb, nazývaný sociální klouzání nebo křeče, bez bičíků na povrchu. Podle zpráv má Tfp další funkce, včetně predace, patogeneze, tvorby biofilmu, přirozeného příjmu DNA, automatické agregace a vývoje buněk38. Genom ASxL5T obsahuje 18 genů kódujících diguanylátcyklázu (enzym, který katalyzuje přeměnu 2 guanosintrifosfátu na guanosin 2 fosfát a cyklický diGMP) a 6 genů kódujících odpovídající diguanylát cykláza fosfát diguanylát. Gen pro esterázu (katalyzující degradaci cyklického di-GMP na guanosinmonofosfát) je zajímavý, protože cykl-di-GMP je důležitým druhým poslem zapojeným do vývoje a separace biofilmu, pohybu, přichycení buněk a virulence 39, 40 v tomto procesu. Je třeba také poznamenat, že u Bdellovibrio bacteriovorus bylo prokázáno, že cyklický dvojitý GMP řídí přechod mezi svobodným životem a predátorským životním stylem41.
Většina výzkumu predátorských bakterií se zaměřila na Bdellovibrio, organismy podobné Bdellovibriu a druhy Myxococcus. Tyto a další známé příklady predátorských bakterií tvoří různorodou skupinu. Navzdory této rozmanitosti byl identifikován soubor charakteristických proteinových rodin, které odrážejí fenotypy 11 známých predátorských bakterií3,22. Byly však identifikovány pouze geny kódující O antigen ligázu (waaL), což je zvláště běžné u gramnegativních bakterií. Tato forma analýzy není užitečná při označení ASxL5T jako predátora, pravděpodobně proto, že používá novou strategii útoku. Dostupnost rozmanitějších predátorských bakteriálních genomů pomůže vyvinout jemnější analýzy rozlišení, které berou v úvahu důkazy o funkčních a environmentálních rozdílech mezi členy skupiny. Příklady predátorských bakterií, které nejsou zahrnuty v této analýze, zahrnují členy Cupriavidus necator42 a Bradymonabacteria43, protože jak výzkumníci zkoumají různá mikrobiální společenství, vzniká více predátorských taxonů.
Nejpozoruhodnějším rysem bakterií ASxL5T zachycených snímkem TEM je jeho jedinečná a flexibilní morfologie, která může podporovat interakci s bakteriemi kořisti. Typ pozorované interakce se liší od ostatních predátorských bakterií a nebyl dříve objeven ani hlášen. Navrhovaný predátorský životní cyklus ASxL5T je znázorněn na obrázku 5. V literatuře je jen málo příkladů s podobnými apikálními strukturami, jaké zde uvádíme, ale mezi tyto příklady patří Terasakiispira papahanaumokuakeensis, mořská bakterie spirillum s občasným zvětšením vrcholu 44, a Alphaproteobacteria, Terasakiella pusilla , dříve patřící do rodu Oceanospirillum, vystavující Tzv "polární film" 45. Formy koků jsou často pozorovány ve starších kulturách, zejména u bakterií se zakřivenými formami, jako jsou Vibrio, Campylobacter a Helicobacter 46, 47, 48, které mohou představovat degradovaný stav. Je zapotřebí další práce k objasnění přesného životního cyklu bakterií ASxL5T. Zjistit, jak loví a loví a zda jeho genom kóduje biologicky aktivní sloučeniny, které lze použít pro lékařské nebo biotechnologické účely.
Popis Venatorbacter gen. Listopad Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. se skládá z venatorů z L. n. venator,'hunter' a Gr. n.bacter,'a prut'. Venatorbacter,'a lovecký Rod' Buňky jsou aerobní, zakřivené barvy, cvičební tyč a oxidázová aktivita. Rozmezí pH 4-9 je neobvyklé u mořských plžů, většina z nich netoleruje kyselé pH -OH a C10:0 3-OH se nacházejí jako hydroxymastné kyseliny Nerostou v živném prostředí. Obsah DNA G + C je 56,1 mol %. Zástupci tohoto rodu vykazují rezistenci vůči Campylobacter A predační chování zástupců čeledi Enterobacteriaceae Fylogenetické postavení tohoto rodu je v čeledi.
Popis Venatorbacter cucullus sp. listopad Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus znamená kapotáž).
Kromě toho je popisným rysem tohoto rodu to, že při pěstování na BA nebo BHI jsou buňky 1,63 um dlouhé a 0,37 um široké. Kolonie na BHI agaru jsou velmi malé, po 72 hodinách dosahují průměru 2 mm. Jsou béžové, průsvitné, kulaté, vypouklé a lesklé. Zástupci tohoto druhu mohou používat Escherichia coli a Klebsiella. Campylobacter a několik dalších gramnegativních bakterií slouží jako kořist.
Typický kmen ASxL5T byl izolován z hovězího mléka v Nottinghamshire ve Spojeném království a uložen v National Type Culture Collection (UK): přístupové číslo NCTC 14397 a Nizozemská sbírka bakteriálních kultur (NCCB) přístupové číslo NCCB 100775. Kompletní sekvence genomu ASxL5T byl uložen v Genbank podle přidání CP046056.
Bakterie ASxL5T byly izolovány z hovězího mléka pomocí technologie fágové izolace9,49. Suspenze byla zředěna 1:9 (w/v) v SM pufru (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,1 M NaCl, 8 mM MgS04.7H20 a 0,01 % želatina; Sigma Aldrich, Gillingham, UK), poté inkubovat při 4 °C po dobu 24 hodin, pomalu se otáčejí, aby se predátoři eluovali do pufru. Suspenze byla centrifugována při 3000 g po dobu 3 minut. Supernatant byl shromážděn a centrifugován při 13 000 g podruhé po dobu 5 minut. Supernatant pak prošel přes 0,45 um membránový filtr (Minisart; Sartorius, Gottingen, Německo) a 0,2 um membránový filtr (Minisart), aby se odstranily veškeré zbývající bakteriální buňky. ASxL5T může projít těmito filtry. Měkký agarový trávník Campylobacter enterosus S12 (přístupové číslo NCBI CP040464) ze stejné suspenze byl připraven za použití standardních technik. Filtrovaná kaše byla rozdělena na každou z těchto destiček s hostitelskými buňkami v 10 ul kapičkách v triplikátech a ponechána zaschnout. Destička byla inkubována v mikroaerofilní nádrži při 37 °C po dobu 48 hodin za mikroaerobních podmínek (5 % 02, 5 % H2, 10 % C02 a 80 % N2). Získaný viditelný plak byl extrahován do SM pufru a přenesen na čerstvý trávník C. hyointestinalis S12 k další propagaci lyžovaných organismů. Jakmile se zjistí, že příčinou lytického plaku jsou bakterie a ne fág, pokuste se vypěstovat organismus nezávisle na hostiteli a dále jej charakterizovat. Aerobní kultivace byla prováděna při 37 °C s 5 % v/v defibrinované koňské krve (TCS Biosciences Lt, Buckingham, UK, doplněk). Podle pokynů Národního výboru pro klinické standardy se pro testování antibakteriální citlivosti používá metoda diskové difúze. BHI agar byl kultivován při 37 °C za použití disku obsahujícího následující antibiotika (Oxoid) pro aerobní kultivaci: amoxicilin a kyselina klavulanová 30 ug; cefotaxim 30 ug; streptomycin 10 ug; ciprofloxacin 5 ug; ceftazidim 30 ug Kyselina nalidixová 30 ug; Imipenem 10 ug; azithromycin 15 ug; chloramfenikol 30 ug; Cefoxitin 30 ug; tetracyklin 30 ug; nitrofurantoin 300 ug; Aztreonam 30 ug; Ampicilin 10 ug; Cefpodoxim 10 ug; Trimethoprim-sulfamethoxazol 25 µg. Tolerance soli byla stanovena aerobní inkubací na BHI agarových plotnách při 37 °C. Do BHI agarových ploten byl přidán další NaCl, aby se dosáhlo koncentračního rozmezí až 10 % w/v. Rozsah pH je určen aerobní kultivací na BHI agarových plotnách při 37 °C, kde byl rozsah pH upraven na hodnotu mezi 4 a 9 pomocí sterilní HCl nebo sterilního NaOH a cílová hodnota pH je ověřena před nalitím plotny. Pro analýzu buněčných mastných kyselin byl ASxL5T kultivován na BHI agaru po dobu 3 dnů a aerobně při 37 °C. Podle standardního protokolu MIDI (Sherlock Microbial Identification System, verze 6.10) společnosti FERA Science Ltd, (York, UK) byly extrahovány, připraveny a analyzovány buněčné mastné kyseliny.
Pro TEM byl ASxL5T kultivován aerobně rozprostřením na BA při 37 °C po dobu 24 hodin a poté sklizen do 1 ml 3% (obj./obj.) glutaraldehydu v 0,1 M kakodylátovém pufru při pokojové teplotě Fixace po dobu 1 hodiny, poté centrifugace při 10 000 g po dobu 3 minut. Poté peletu jemně resuspendujte v 600 μl 0,1 M kakodylátového pufru. Přeneste fixovanou suspenzi ASxL5T na formvar/uhlíkový film na měděné mřížce 200 mesh. Bakterie byly barveny 0,5% (hmotn./obj.) uranylacetátem po dobu 1 minuty a zkoumány pomocí TEM s použitím mikroskopu TEI Tecnai G2 12 Biotwin. Jak bylo uvedeno výše, zkombinujte stejný počet kořisti a predátora v bujónu NZCYM (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) a inkubujte po dobu 48 hodin v mikroaerobních podmínkách Campylobacter nebo Campylobacter při 37 °C. Interakce predátora a kořisti byl také zkoumán TEM. Aerobní podmínky pro Escherichia coli. Nezávisle zkoumat kořist a predátorské bakterie, abyste určili jakékoli změny v morfologii buněk v důsledku predace. Pro optickou mikroskopii akumulace PHB byla použita metoda Sudan black.
Pěstujte kultury ASxL5T přes noc rozmazáním růstu na BHI nebo BA destičky sterilním tamponem. Odeberte buňky ASxL5T a suspendujte je v MRD (CM0733, Oxoid) a poté je umístěte na 7 dní do 4 °C, aby se buňky vyhladověly. Referenční NCTC nebo laboratorní zásobní bakteriální kultura byla naočkována do BHI bujónu nebo živného bujónu č. 2 (CM007, Oxoid), inkubována přes noc, centrifugována při 13 000 g a resuspendována v MRD, dokud OD600 nebylo 0,4. Kultura: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, Klebsiella oxytoca,8ocnosta oxytoca,17TC 114 Listeria Special bakterie NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, Rhodococcus podmořský hamburger NCTC 1621T, Salmonella střevní bakterie Mondeville NCTC, NCTC 50oc8cus Staphylage1074cus aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. Hostitel Campylobacter byl mikroaerobně inkubován na BA plotnách při 37 °C a suspendován v NZCYM bujónu. Testovanými hostiteli Campylobacter jsou: C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11458.11TC5 NC58, C. PT14, C... Odeberte buňky v MRD, centrifugujte při 13 000 g a resuspendujte v MRD, dokud OD600 není 0,4. Přidejte alikvot 0,5 ml suspenze k 5 ml roztaveného horního agaru NZCYM (0,6% agar) a nalijte na spodní misku 1,2% NZCYM. Po vytvrzení a vysušení byl sériově zředěný ASxL5T distribuován jako 20 ul kapky na každou desku trávníku v triplikátech. Teplota a atmosféra kultivace závisí na požadavcích testovacích bakterií.
K přípravě DNA z bakteriálních izolátů použijte GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma Aldridge). Pro PCR amplifikaci genu 16S rRNA a stanovení sekvence produktu byly použity standardní metody pomocí chemie terminace barvivem (Eurofins Value Read Service, Německo). Pomocí programu BLAST-N porovnejte tyto sekvence s jinými sekvencemi genu 16S rRNA, abyste identifikovali a shromáždili blízce příbuzné druhy. Ty jsou zarovnány pomocí ClustalW v programu MEGA X. Fylogenetický strom byl rekonstruován pomocí MEGA X pomocí metody maximální věrohodnosti založené na modelu Tamura-Nei s 1000 řízenými kopiemi54. Použijte PureLink™ Genomic DNA Kit (Fisher Scientific, Loughborough, UK) k extrakci DNA pro sekvenování celého genomu. Sekvence genomu ASxL5T byla stanovena pomocí kombinace Illumina MiSeq, která se skládá z 250 bp dvoukoncových čtení složených z knihovny připravené pomocí značící sady Nextera a 2 až 20 kb dlouhých čtení z platformy PacBio. Výzkumné zařízení genomického sekvenování DNA na univerzitě v Sembii. Genom byl sestaven pomocí CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen, Aarhus, Dánsko). Kultury ASxL5T jsou uloženy ve sbírce národních typových kultur (UK) a Nizozemské sbírce bakteriálních kultur (NCCB). Genomy příbuzných organismů použité pro srovnání jsou: Thalassolituus oleivorans MIL-1T (přístupové číslo HF680312, kompletní); Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (přístupové číslo BMYY01000001, neúplné); Oceanobacter kriegii DSM 6294T (přístupové číslo NZ_AUGV00000000, neúplné); Marinamonas community DSM 5604T (přidáno ASM436330v1, neúplné), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (přidáno MTSD02000001, neúplné) a Thalassolituus sp. C2-1 (doplňte NZ_VNIL01000001, neúplné). Použijte JGI Genome Portal36 na https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page= k určení skóre zarovnání (AF) a průměrné identity nukleové kyseliny (ANI). Ve dvojicích. Ke stanovení identity aminokyselin (AAI) byla použita metoda Rodriguez-R & Konstantinidis55. Použijte GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 k vytvoření odhadovaného fylogenetického stromu s maximální pravděpodobností. Vstupní genom představující dostupný referenční genom je vybrán z referenčních rodů identifikovaných jako příbuzné s ASxL5T z fylogeneze 16S rRNA. Anotoval strom pomocí interaktivního online nástroje strom života (https://itol.embl.de/). Funkční anotace a analýza genomu ASxL5T se provádí pomocí online nástroje BlastKOALA KEGG s využitím distribuce obohacení modulu KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Rozdělení kategorií COG (ortologních skupin) se určuje pomocí online nástroje eggNOG-mapper.
Pérez, J., Moraleda-Muñoz, A., Marcos-Torres, FJ a Muñoz-Dorado, J. Bakteriální predace: 75 let a pokračuje! . prostředí. mikroorganismus. 18, 766–779 (2016).
Linares-Otoya, L. atd. Diverzita a antibakteriální potenciál predátorských bakterií na peruánském pobřeží. Březnové drogy. 15. E308. https://doi.org/10.3390/md15100308 (2017).
Pasternak, Z. a kol. Prostřednictvím jejich genů jim porozumíte: genomové vlastnosti predátorských bakterií. ISME J. 7, 756–769 (2013).
Sockett, RE Predátorský životní styl bakteriofága Bdellovibrio. instalovat. Pastorští mikrobi. 63, 523–539 (2009).
Korp, J., Vela Gurovic, MS & Nett, M. Antibiotika z predátorských bakterií. Beilstein J. Histochemistry 12, 594–607 (2016).
Johnke, J., Fraune, S., Bosch, TCG, Hentschel, U. & Schulenburg, H. Bdellovibrio a podobné organismy jsou prediktory diverzity mikrobiomů v různých hostitelských populacích. mikroorganismus. Ekologie. 79, 252–257 (2020).
Vila, J., Moreno-Morales, J. a Ballesté-Delpierre, C. Objevte současný stav nových antibakteriálních látek. klinický. mikroorganismus. Infikovat. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2019.09.015 (2019).
Hobley, L. a kol. Dvojí predace fága a fága může vymýtit kořist E. coli bez jediné predace. J. Bakterie. 202, e00629-19. https://doi.org/10.1128/JB.00629-19 (2020).
El-Shibiny, A., Connerton, PL & Connerton, IF Počet a diverzita Campylobacter a bakteriofágů izolovaných během krmného cyklu volně chovaných a ekologických kuřat. Prostředí aplikace. mikroorganismus. 71, 1259-1266 (2005).
Wilkinson, DA atd. Aktualizujte genomickou taxonomii a epidemiologii prasat Campylobacter. věda. Zástupce 8, 2393. https://doi.org/10.1038/s41598-018-20889-x (2018).
Lee, MD GToTree: Uživatelsky přívětivý pracovní postup pro systémovou genomiku. Bioinformatika 35, 4162–4164 (2019).
Edgar, RC MUSCLE: Metoda zarovnání více sekvencí, která snižuje časovou a prostorovou složitost. BMC biologické informace. 5, 113 (2004).
Capella-Gutiérrez, S., Silla-Martínez, JM & Gabaldón, T. TrimAl: Nástroj pro automatické zarovnání a oříznutí ve velké fylogenetické analýze. Bioinformatika 25, 1972–1973 (2009).
Hyatt, D., LoCascio, PF, Hauser, LJ & Uberbacher, predikce počátečního místa translace EC genu a metagenomické sekvence. Bioinformatika 28, 2223-2230 (2012).
Shen, W. & Xiong, J. TaxonKit: Multiplatformní a efektivní sada nástrojů pro klasifikaci NCBI. Bio Rxiv. (Přístup 1. června 2021); https://www.biorxiv.org/content/10.1101/513523v1 (2019).
Price, MN, Dehal, PS & Arkin, AP FastTree 2 – přibližný strom maximální pravděpodobnosti s velkým zarovnáním. PLoS One 5, e9490 (2010).
Tange, O. GNU Parallel. (Přístup 1. června 2021); https://zenodo.org/record/1146014#.YOHaiJhKiUk (2018).
Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Výzkum nukleových kyselin. 28, 27-30 (2000).
Česká republika, L. aj. Úloha extremolytů ektoinu a hydroxyektoinu jako stresových protektorů a živin: genetika, systémová genomika, biochemie a strukturální analýza. Gene (Basilej). 9. E177. https://doi.org/10.3390/genes9040177 (2018).
Gregson, BH, Metodieva, G., Metodiev, MV, Golyshin, PN & McKew, BA Diferenciální exprese proteinů během růstu obligátní bakterie Thalassolituus oleivorans MIL-1 degradující mořské uhlovodíky během růstu alkanů se středním a dlouhým řetězcem. přední. mikroorganismus. 9, 3130 (2018).
Pasternak, Z., Ben Sasson, T., Cohen, Y., Segev, E. a Jurkevitch, E. Nová komparativní genomická metoda pro definování fenotypově specifických indikátorů odhaluje specifickou dědičnost ve známce predátorských bakterií. Veřejná vědecká knihovna jedna. 10. e0142933. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142933 (2015).
Yakimov, MM aj. gen Thalassolituus oleivorans. listopad, sp. nov., nový typ mořských bakterií, který se specializuje na využití uhlovodíků. mezinárodnost. J. System. vývoj. mikroorganismus. 54, 141-148 (2004).
Wang, Y., Yu, M., Liu, Y., Yang, X. & Zhang, XH Bacterioplanoides pacificum gen. listopad, sp. V listopadu se oddělila od mořské vody cirkulující v jižním Pacifiku. mezinárodnost. J. System. vývoj. mikroorganismus. 66, 5010–5015 (2016).