Venatorbacter cucullus genyn. Nova, math newydd o ysglyfaethwr bacteriol

Cafodd math newydd o facteria Gram-negyddol, aerobig, sy'n gallu goddef halen, gweithredol, siâp gwialen, ac ysglyfaethus ASxL5T ei ynysu o bwll tail gwartheg yn Swydd Nottingham, Lloegr, a defnyddiodd Campylobacter fel ei ysglyfaeth. Yn dilyn hynny, darganfuwyd rhywogaethau Campylobacter eraill ac aelodau o'r teulu Enterobacteriaceae yn ysglyfaeth. Ar ôl isddiwylliant heb gelloedd gwesteiwr, cyflawnwyd twf aseptig gwan ar Agar Trwyth y Galon Brain. Yr amodau twf gorau posibl yw 37 °C a pH yw 7. Datgelodd microsgopeg trawsyrru electronau rai nodweddion morffolegol anarferol iawn yn ymwneud ag argaeledd ysglyfaeth. Dangosodd dadansoddiad ffylogenetig gan ddefnyddio dilyniant genynnau rRNA 16S fod yr unigyn yn perthyn i aelod o'r teulu Marine Spirulina, ond ni ellir ei ddosbarthu'n glir fel aelod o unrhyw genws hysbys. Cadarnhaodd dilyniant genom cyfan ASxL5T y berthynas ag aelodau'r spirochetes morol. Datgelodd chwiliad cronfa ddata fod sawl ASxL5Ts yn rhannu dilyniannau genynnau rRNA 16S â nifer o facteria heb eu meithrin o'r cefnfor, wyneb y tir a dŵr daear. Rydym yn awgrymu bod y straen ASxL5T yn cynrychioli rhywogaeth newydd mewn genws newydd. Rydym yn argymell yr enw Venatorbacter cucullus gen. Tachwedd, sp. Ym mis Tachwedd, defnyddiwyd ASxL5T fel y math o straen.
Mae bacteria ysglyfaethus yn facteria sy'n dangos y gallu i hela a lladd bacteria byw eraill i gael deunyddiau ac egni biosynthetig. Mae hyn yn wahanol i adferiad cyffredinol maetholion o ficro-organebau marw, ac mae hefyd yn wahanol i ryngweithiadau parasitig, lle mae bacteria yn ffurfio perthynas agos â'u gwesteiwr heb eu lladd. Mae bacteria ysglyfaethus wedi datblygu cylchoedd bywyd gwahanol i fanteisio ar ffynonellau bwyd helaeth yn y cilfachau lle maent i'w cael (fel cynefinoedd morol). Maent yn grŵp tacsonomaidd amrywiol, sydd ond yn cael eu cysylltu gan eu cylch bywyd sterileiddio unigryw1. Mae enghreifftiau o facteria rheibus wedi'u canfod mewn sawl ffyla gwahanol, gan gynnwys: Proteobacteria, Bacteroides, a Chlorella.3. Fodd bynnag, y bacteria ysglyfaethus sydd wedi'u hastudio fwyaf yw'r organebau Bdellovibrio a Bdellovibrio-a-thebyg (BALOs4). Mae bacteria ysglyfaethus yn ffynhonnell addawol o gyfansoddion newydd sy'n weithredol yn fiolegol ac asiantau gwrthfacterol5.
Credir bod bacteria ysglyfaethus yn gwella amrywiaeth microbaidd ac yn cael effaith gadarnhaol ar iechyd, cynhyrchiant a sefydlogrwydd ecosystemau6. Er gwaethaf y nodweddion cadarnhaol hyn, prin yw'r astudiaethau ar facteria ysglyfaethus newydd oherwydd yr anhawster o feithrin bacteria a'r angen i arsylwi'n ofalus ar ryngweithio celloedd i ddeall eu cylchoedd bywyd cymhleth. Nid yw'r wybodaeth hon yn hawdd i'w chael o ddadansoddiadau cyfrifiadurol.
Mewn oes o ymwrthedd gwrthficrobaidd cynyddol, mae strategaethau newydd ar gyfer targedu pathogenau bacteriol yn cael eu hastudio, megis defnyddio bacterioffagau a bacteria rheibus7,8. Cafodd bacteria ASxL5T eu hynysu yn 2019 gan ddefnyddio technoleg ynysu ffag o dail buwch a gasglwyd o Ganolfan Llaeth Prifysgol Nottingham, Swydd Nottingham. Pwrpas yr ymchwiliad yw ynysu organebau sydd â photensial fel cyfryngau rheoli biolegol. Mae campylobacter hyointestinalis yn bathogen milheintiol, sy'n cael ei gysylltu fwyfwy â chlefydau coluddol dynol10. Mae'n hollbresennol mewn serwm ac yn cael ei ddefnyddio fel gwesteiwr targed.
Roedd y bacteriwm ASxL5T wedi'i ynysu oddi wrth jeli cig eidion oherwydd gwelwyd bod y placiau a ffurfiwyd ganddo ar lawnt C. hyointestinalis yn debyg i'r rhai a gynhyrchwyd gan facteriaophages. Mae hwn yn ganfyddiad annisgwyl, oherwydd mae rhan o'r broses ynysu phage yn cynnwys hidlo trwy hidlydd 0.2 µm, sydd wedi'i gynllunio i gael gwared ar gelloedd bacteriol. Datgelodd archwiliad microsgopig o'r deunydd a echdynnwyd o'r plac nad oedd y bacteria bach siâp gwialen grwm gram-negyddol yn cronni polyhydroxybutyrate (PHB). Mae'r diwylliant aseptig sy'n annibynnol ar gelloedd ysglyfaethus yn cael ei wireddu ar gyfrwng solet cyfoethog (fel agar trwyth calon yr ymennydd (BHI) ac agar gwaed (BA)), ac mae ei dwf yn wan. Fe'i ceir ar ôl isddiwylliant gyda gwella inocwlwm trwm. Mae'n tyfu cystal o dan amodau microaerobig (7% v/v ocsigen) ac ocsigen atmosfferig, ond nid mewn awyrgylch anaerobig. Ar ôl 72 awr, roedd diamedr y gytref yn fach iawn, gan gyrraedd 2 mm, ac roedd yn llwydfelyn, yn dryloyw, yn grwn, yn amgrwm ac yn sgleiniog. Mae profion biocemegol safonol yn cael eu rhwystro oherwydd na ellir meithrin ASxL5T yn ddibynadwy mewn cyfryngau hylif, sy'n awgrymu y gallai ddibynnu ar gylch bywyd cymhleth ffurfio biofilm. Fodd bynnag, dangosodd yr ataliad plât fod ASxL5T yn aerobig, yn bositif ar gyfer ocsidas a chatalas, a gall oddef 5% NaCl. Mae ASxL5T yn gallu gwrthsefyll 10 µg streptomycin, ond mae'n sensitif i bob gwrthfiotig arall a brofir. Archwiliwyd celloedd bacteriol ASxL5T gan TEM (Ffigur 1). Pan gânt eu tyfu heb gelloedd ysglyfaethus ar y BA, mae celloedd ASxL5T yn Campylobacter bach, gyda hyd cyfartalog o 1.63 μm (± 0.4), lled o 0.37 μm (± 0.08), ac un polyn hir (hyd at 5 μm). flagella rhywiol. Mae'n ymddangos bod gan tua 1.6% o'r celloedd lled o lai na 0.2 μm, a fydd yn caniatáu iddynt fynd trwy'r ddyfais hidlo. Gwelwyd estyniad strwythurol anarferol ar frig rhai celloedd, yn debyg i fairing (cucullus Lladin) (gweler y saethau yn 1D, E, G). Mae'n ymddangos bod hyn yn cynnwys gormodedd o bilen allanol, a allai fod oherwydd y gostyngiad cyflym ym maint yr amlen periplasmig, tra bod y bilen allanol yn parhau'n gyfan, gan ddangos ymddangosiad "rhydd". Arweiniodd meithrin ASxL5T yn absenoldeb maetholion (yn PBS) am amser hir ar 4°C at y rhan fwyaf o gelloedd (ond nid pob un) yn dangos morffoleg coccal (Ffigur 1C). Pan fydd ASxL5T yn tyfu gyda Campylobacter jejuni yn ysglyfaeth am 48 awr, mae maint cyfartalog y gell yn sylweddol hirach ac yn gulach na chelloedd a dyfir heb lu (Tabl 1 a Ffigur 1E). Mewn cyferbyniad, pan fydd ASxL5T yn tyfu gydag E. coli yn ysglyfaeth am 48 awr, mae maint y gell ar gyfartaledd yn hirach ac yn ehangach na phan fydd yn tyfu heb ysglyfaeth (Tabl 1), ac mae hyd y gell yn amrywiol, fel arfer yn dangos ffilamentous (Ffigur 1F). Pan ddeorwyd â Campylobacter jejuni neu E. coli fel ysglyfaeth am 48 awr, ni ddangosodd celloedd ASxL5T unrhyw flagella o gwbl. Mae Tabl 1 yn crynhoi'r arsylwadau o newidiadau ym maint celloedd yn seiliedig ar bresenoldeb, absenoldeb, a math ysglyfaeth ASxL5T.
Arddangosfa TEM o ASx5LT: (A) ASx5LT yn dangos chwipiad hir; (B) batri ASx5LT nodweddiadol; (C) cocci ASx5LT celloedd ar ôl deori hir heb faetholion; (D) grŵp o gelloedd ASx5LT yn dangos annormaledd (E) Dangosodd grŵp celloedd ASx5LT a ddeorwyd ag ysglyfaeth Campylobacter hyd celloedd uwch o gymharu â'r rhai heb dwf ysglyfaeth (D) hefyd yn dangos strwythur apical; (F) flagella ffilamentous mawr, celloedd ASx5LT, ar ôl deori gyda ysglyfaeth E. coli; (G) Cell ASx5LT sengl ar ôl deor ag E. coli, yn dangos strwythur brig anarferol. Mae'r bar yn cynrychioli 1 μm.
Mae pennu dilyniant genynnau rRNA 16S (rhif derbyn MT636545.1) yn galluogi chwiliadau cronfa ddata i sefydlu dilyniannau tebyg i'r rhai yn y dosbarth Gammaproteobacteria, ac sydd agosaf at facteria morol yn y teulu spirillum morol (Ffigur 2), ac maent yn aelodau o'r genws Thalassolituus Y perthynas agosaf i Marine Bacillus. Mae'r dilyniant genynnau rRNA 16S yn amlwg yn wahanol i'r bacteria rheibus sy'n perthyn i'r teulu Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria). Roedd y cymariaethau pairwise o B. bacteriovorus HD100T (straen math, DSM 50701) a B. bacteriovorus DM11A yn 48.4% a 47.7%, ac ar gyfer B. exovorus JSS roedd yn 46.7%. Mae gan facteria ASxL5T 3 chopi o'r genyn rRNA 16S, dau ohonynt yn union yr un fath â'i gilydd, a'r trydydd yw 3 bas ar wahân. Nid yw dau ynysiad bacteriol rheibus arall (ASx5S ac ASx5O; niferoedd derbyn genynnau rRNA 16S yw MT636546.1 a MT636547.1, yn y drefn honno) gyda nodweddion morffolegol a ffenoteipaidd tebyg o'r un lleoliad yr un peth, ond maent yn wahanol i ASxL5T a Bacterial heb ei feithrin. mae dilyniannau cronfa ddata wedi'u clystyru ynghyd â genera eraill yn Oceanospirillaceae (Ffigur 2). Mae'r dilyniant genom cyfan o ASxL5T wedi'i bennu a'i gadw yng nghronfa ddata NCBI, a'r rhif derbyn yw CP046056. Mae genom ASxL5T yn cynnwys cromosom cylchol o 2,831,152 bp gyda chymhareb G + C o 56.1%. Mae'r dilyniant genom yn cynnwys 2653 CDS (cyfanswm), a rhagwelir y bydd 2567 ohonynt yn amgodio proteinau, a gellir neilltuo 1596 ohonynt fel ffwythiannau tybiedig (60.2%). Mae'r genom yn cynnwys 67 o enynnau codio RNA, gan gynnwys 9 rRNAs (3 yr un ar gyfer 5S, 16S, a 23S) a 57 tRNAs. Cymharwyd nodweddion genomig ASxL5T â'r genomau sydd ar gael o straen o'r math cymharol agosaf a nodwyd o ddilyniant genynnau rRNA 16S (Tabl 2). Defnyddiwch hunaniaeth asid amino (AAI) i gymharu'r holl genomau Thalassolituus sydd ar gael ag ASxL5T. Y dilyniant genom agosaf (anghyflawn) a bennir gan AAI yw Thalassolituus sp. C2-1 (ychwanegu NZ_VNIL01000001). Cafodd y straen hwn ei ynysu oddi wrth waddodion môr dwfn Ffos Mariana, ond ar hyn o bryd nid oes unrhyw wybodaeth ffenoteipaidd am y straen hwn i'w gymharu. O'i gymharu â 2.82 Mb ASxL5T, mae genom yr organeb yn fwy ar 4.36 Mb. Mae maint genom cyfartalog spirochetes morol tua 4.16 Mb (± 1.1; n = 92 genom cyfeirio cyflawn yr ymchwiliwyd iddynt o https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), felly mae genom ASxL5T yn unol â'r gorchymyn O'i gymharu â'r aelodau eraill, mae'n eithaf bach. Defnyddiwch GToTree 1.5.54 i gynhyrchu coeden ffylogenetig tebygolrwydd uchaf amcangyfrifedig yn seiliedig ar genom (Ffigur 3A), gan ddefnyddio'r dilyniannau asid amino wedi'u halinio a'u cysylltu o 172 o enynnau un copi sy'n benodol i Gammaproteobacteria 11,12,13,14,15,16, 17 ,18. Dangosodd y dadansoddiad ei fod yn perthyn yn agos i Thalassolituus, Plane Bacterial, a Bacteriwm Morol. Fodd bynnag, mae'r data hyn yn nodi bod ASxL5T yn wahanol i'w berthnasau yn Marine Spirulina ac mae ei ddata dilyniant genom ar gael.
Mae'r goeden ffylogenetig sy'n defnyddio'r dilyniant genynnau rRNA 16S yn amlygu lleoliad y straenau ASxL5T, ASxO5, ac ASxS5 (gyda'r coluddion) o'u cymharu â'r straenau bacteria morol heb eu trin yn y Marine Spirulinaceae. Mae rhif derbyn Genbank yn dilyn enw'r straen mewn cromfachau. Defnyddio ClustalW i alinio dilyniannau, a defnyddio dull tebygolrwydd mwyaf a model Tamura-Nei i gasglu perthnasoedd ffylogenetig, a pherfformio 1000 o ddyblygiadau dan arweiniad yn rhaglen MEGA X. Mae'r nifer ar y gangen yn nodi bod gwerth y copi dan arweiniad yn fwy na 50%. Defnyddiwyd Escherichia coli U/541T fel grŵp allanol.
(A) Coeden ffylogenetig yn seiliedig ar y genom, sy'n dangos y berthynas rhwng y bacteriwm Spirospiraceae morol ASxL5T a'i berthnasau agos, E. coli U 5/41T fel grŵp allanol. (B) O'i gymharu â T. oleivorans MIL-1T, rhagwelir dosbarthiad categori swyddogaethol genynnau yn seiliedig ar y clwstwr orthologous grŵp (COG) o brotein ASx5LT. Mae'r ffigur ar y chwith yn dangos nifer y genynnau ym mhob categori COG swyddogaethol ym mhob genom. Mae'r graff ar y dde yn dangos canran y genomau sydd ym mhob grŵp COG swyddogaethol. (C) O'i gymharu â T. oleiverans MIL-1T, dadansoddiad o lwybr modiwlaidd cyflawn KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genoms) ASxL5T.
Datgelodd defnyddio cronfa ddata KEGG i archwilio’r genynnau cydrannol sy’n bresennol yn y genom ASxL5T lwybr metabolaidd nodweddiadol gama aerobig Proteus. Mae ASxL5T yn cynnwys cyfanswm o 75 o enynnau a neilltuwyd i broteinau modur bacteriol, gan gynnwys genynnau sy'n ymwneud â chemotaxis, cynulliad flagella, a system fimbriae math IV. Yn y categori olaf, mae 9 o bob 10 genyn yn gyfrifol am symudiadau plycio ystod o organebau eraill. Mae genom ASxL5T yn cynnwys llwybr biosynthetig tetrahydropyrimidine cyflawn sy'n cymryd rhan yn yr ymateb amddiffynnol i straen osmotig20, yn ôl y disgwyl ar gyfer haloffiliau. Mae'r genom hefyd yn cynnwys llawer o lwybrau cyflawn ar gyfer cofactors a fitaminau, gan gynnwys llwybrau synthesis ribofflafin. Er bod y genyn alcan 1-monooxygenase (alkB2) yn bresennol yn ASxL5T, nid yw'r llwybr defnyddio hydrocarbon yn gyflawn. Yn y dilyniant genom o ASxL5T, mae homologau genynnau a nodwyd yn bennaf gyfrifol am ddiraddio hydrocarbonau yn T. oleiverans MIL-1T21, megis TOL_2658 (alkB) a TOL_2772 (dehydrogenase alcohol) yn amlwg yn absennol. Mae Ffigur 3B yn dangos cymhariaeth dosbarthiad genynnau yn y categori COG rhwng ASxL5T ac olew olewydd MIL-1T. Yn gyffredinol, mae'r genom ASxL5T llai yn cynnwys llai o enynnau o bob categori COG o gymharu â'r genom cysylltiedig mwy. Pan fynegir nifer y genynnau ym mhob categori swyddogaethol fel canran o'r genom, nodir gwahaniaethau yng nghanran y genynnau yn y categorïau cyfieithu, strwythur ribosomaidd a biogenesis, a'r categorïau swyddogaeth cynhyrchu a thrawsnewid ynni, sy'n ffurfio'r ASxL5T mwy. genom Mae'r ganran yn cael ei gymharu â'r un grŵp sy'n bresennol yn y genom T. oleiverans MIL-1T. Mewn cyferbyniad, o'i gymharu â genom ASxL5T, mae gan T. oleivorans MIL-1T ganran uwch o enynnau yn y categorïau atgynhyrchu, ailgyfuno ac atgyweirio, a thrawsgrifio. Yn ddiddorol, y gwahaniaeth mwyaf yng nghynnwys pob categori swyddogaethol o'r ddau genom yw nifer y genynnau anhysbys sy'n bresennol yn ASxL5T (Ffigur 3B). Perfformiwyd dadansoddiad cyfoethogi o fodiwlau KEGG, lle mae pob modiwl KEGG yn cynrychioli set o unedau swyddogaethol wedi'u diffinio â llaw ar gyfer anodi a dehongliad biolegol o ddata dilyniant genomau. Dangosir cymhariaeth dosbarthiad genynnau yn llwybr modiwl KOG cyflawn ASxL5T ac olewydd MIL-1T yn Ffigur 3C. Mae'r dadansoddiad hwn yn dangos, er bod gan ASxL5T lwybr metabolig sylffwr a nitrogen cyflawn, nid oes gan T. oleiverans MIL-1T. Mewn cyferbyniad, mae gan T. oleiverans MIL-1T lwybr metabolig cystein a methionine cyflawn, ond mae'n anghyflawn yn ASxL5T. Felly, mae gan ASxL5T fodiwl nodweddiadol ar gyfer cymathu sylffad (a ddiffinnir fel set o enynnau y gellir eu defnyddio fel marcwyr ffenoteipaidd, megis cynhwysedd metabolaidd neu bathogenedd; https://www.genome.jp/kegg/module.html) Yn T . Mae cymharu cynnwys genynnau ASxL5T â'r rhestr o enynnau sy'n awgrymu ffordd o fyw ysglyfaethus yn amhendant. Er bod y genyn waaL sy'n amgodio'r ligas sy'n gysylltiedig â'r antigen polysacarid O i'r craidd yn bresennol yn y genom ASxL5T (ond mae'n gyffredin mewn llawer o facteria Gram-negyddol), gall genynnau tryptoffan 2,3-dioxygenase (TDO) gynnwys y 60 amino rhanbarthau asid a geir yn gyffredin mewn bacteria rheibus nad ydynt yn bresennol. Nid oes unrhyw enynnau nodweddiadol rheibus eraill yn y genom ASxL5T, gan gynnwys y rhai amgodio ensymau sy'n ymwneud â biosynthesis isoprenoid yn y llwybr mevalonate. Sylwch nad oes gntR genyn rheoleiddio trawsgrifiadol yn y grŵp ysglyfaethwyr a archwiliwyd, ond gellir nodi tri genyn tebyg i gntR yn ASxL5T.
Crynhoir nodweddion ffenoteipaidd ASxL5T yn Nhabl 3 a'u cymharu â nodweddion ffenoteipaidd genera cysylltiedig 23, 24, 25, 26, a 27 a adroddwyd yn y llenyddiaeth. Mae ynysyddion o T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis, ac Oceanobacter kriegii yn gyrff siâp gwialen gweithredol, sy'n goddef halen, yn ocsidas-bositif, ond nid oes ganddynt bron unrhyw nodweddion ffenoteipaidd eraill ag ASxL5T. pH cyfartalog y cefnfor yw 8.1 ( https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77 ), a adlewyrchir yn T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis ac O. kriegii. Mae ASxL5T yn addas ar gyfer yr ystod pH fwy (4-9) sy'n nodweddiadol o rywogaethau anforol. Nodweddion ffenotypig Thalassolituus sp. C2-1. Anhysbys. Yn gyffredinol, mae amrediad tymheredd twf ASxL5T yn ehangach nag un straen morol (4-42 °C), er bod rhai ond nid pob un o unigion T. marinus yn gallu gwrthsefyll gwres. Roedd yr anallu i dyfu ASxL5T mewn cyfryngau cawl yn atal nodweddu ffenoteipaidd pellach. Defnyddiwch API 20E i brofi'r deunyddiau sydd wedi'u crafu o'r plât BA, ONPG, dihydrolase arginine, decarboxylase lysin, decarboxylase ornithine, defnydd sitrad, urease, tryptoffan deaminase, hydrolysis gelatin Enzyme, roedd canlyniadau'r profion i gyd yn negyddol, ond dim indole, acetoin a H2S eu cynhyrchu. Mae carbohydradau heb ei eplesu yn cynnwys: glwcos, mannose, inositol, sorbitol, rhamnose, swcros, melibiose, amygdalin ac arabinose. O'i gymharu â'r straeniau cyfeirio cysylltiedig cyhoeddedig, dangosir proffil asid brasterog cellog y straen ASxL5T yn Nhabl 4. Y prif asidau brasterog cellog yw C16:1ω6c a/neu C16:1ω7c, C16:0 a C18:1ω9. Mae asidau brasterog hydroxy C12:0 3-OH a C10:0 3-OH hefyd yn bodoli. Mae'r gymhareb C16:0 yn ASxL5T yn uwch na'r gwerth a adroddwyd ar gyfer genera cysylltiedig. Mewn cyferbyniad, o gymharu â'r T. marinus IMCC1826TT a adroddwyd, mae'r gymhareb C18:1ω7c a/neu C18:1ω6c yn ASxL5T yn cael ei leihau. oleivorans MIL-1T ac O. kriegii DSM 6294T, ond heb ei ganfod yn B. sanyensis KCTC 32220T. Wrth gymharu proffiliau asid brasterog ASxL5T ac ASxLS datgelwyd gwahaniaethau cynnil yn y swm o asidau brasterog unigol rhwng y ddau straen, sy'n gyson â dilyniant DNA genomig yr un rhywogaeth. Ni chanfuwyd unrhyw ronynnau poly-3-hydroxybutyrate (PHB) gan ddefnyddio prawf du Sudan.
Astudiwyd gweithgaredd ysglyfaethu bacteria ASxL5T i bennu ystod yr ysglyfaeth. Gall y bacteriwm hwn ffurfio placiau ar rywogaethau Campylobacter, gan gynnwys: Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T; Escherichia coli NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; Clari NCTC 11458 a C. upsaliensis NCTC 11541T. Defnyddiwch y diwylliannau a restrir yn adran pennu amrediad gwesteiwr y dull i brofi ystod ehangach o facteria Gram-negyddol a Gram-positif. Mae'r canlyniadau'n dangos y gellir defnyddio ASxL5T hefyd yn Escherichia coli NCTC 86 a Citrobacter freundii NCTC 9750T. Placiau a ffurfiwyd ar Klebsiella oxytoca 11466. Dangosir y rhyngweithiad TEM ag E. coli NCTC 86 yn Ffigur 4A-D, a dangosir y rhyngweithio â Campylobacter jejuni PT14 a Campylobacter suis S12 yn Ffigur 4E-H canol. Mae'n ymddangos bod y mecanwaith ymosodiad yn wahanol rhwng y mathau ysglyfaethus a brofwyd, gydag un neu fwy o gelloedd E. coli ynghlwm wrth bob cell ASxL5T ac wedi'u lleoli'n ochrol ar hyd y gell estynedig cyn arsugniad. Mewn cyferbyniad, mae'n ymddangos bod ASxL5T yn cysylltu â Campylobacter trwy un pwynt cyswllt, fel arfer mewn cysylltiad â brig y gell ysglyfaethwr ac yn agos at frig cell Campylobacter (Ffigur 4H).
TEM yn dangos y rhyngweithio rhwng ASx5LT ac ysglyfaeth: (AD) ac E. coli ysglyfaeth; (EH) a C. jejuni ysglyfaethus. (A) Cell ASx5LT nodweddiadol sy'n gysylltiedig ag un gell E. coli (EC); (B) ASx5LT ffilamentaidd ynghlwm wrth un gell EC; (C) Cell ASx5LT ffilamentaidd sy'n gysylltiedig â chelloedd CE lluosog; (D) Ymlyniad Celloedd ASx5LT llai ar un gell E. coli (EC); (E) cell ASx5LT sengl sy'n gysylltiedig â chell Campylobacter jejuni (CJ); (F) ASx5LT yn ymosod ar gelloedd C. hyointestinalis (CH); (G) ymosododd dau gell un ASx5LT ar gell CJ; (H) Golygfa agos o'r pwynt atodiad ASx5LT, ger brig y gell CJ (bar 0.2 μm). Mae'r bar yn cynrychioli 1 μm mewn (AG-G).
Mae bacteria ysglyfaethus wedi esblygu i fanteisio ar ffynonellau helaeth o ysglyfaeth. Yn amlwg, maent yn bresennol yn eang mewn llawer o wahanol amgylcheddau. Oherwydd maint cul aelodau'r boblogaeth, mae'n bosibl ynysu bacteria ASxL5T o'r slyri gan ddefnyddio'r dull gwahanu phage. Mae perthnasedd genomig ASxL5T i aelodau o'r teulu oceanospirillaceae o facteria morol yn syndod, er bod yr organeb yn gallu goddef halen a gall dyfu ar gyfrwng sy'n cynnwys 5% o halen. Dangosodd dadansoddiad o ansawdd dŵr y slyri fod y cynnwys sodiwm clorid yn llai na 0.1%. Felly, mae mwd ymhell o'r amgylchedd morol - yn ddaearyddol ac yn gemegol. Mae presenoldeb tri ynysiad cysylltiedig ond gwahanol o'r un ffynhonnell yn darparu tystiolaeth bod yr ysglyfaethwyr hyn yn ffynnu yn yr amgylchedd anforol hwn. Yn ogystal, dangosodd dadansoddiad microbiome (ffeiliau data sydd ar gael o https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990) fod yr un dilyniant genynnau rRNA 16S wedi’i leoli yn y 50 tacsa gweithredol mwyaf niferus (OTU). ) Mewn ychydig o gyfnodau samplu o'r mwd. Canfuwyd nifer o facteria heb eu meithrin yng nghronfa ddata Genbank, sydd â dilyniannau genynnau rRNA 16S tebyg i facteria ASxL5T. Mae'n ymddangos bod y dilyniannau hyn, ynghyd â dilyniannau ASxL5T, ASxS5, ac ASxO5, yn cynrychioli cladau gwahanol wedi'u gwahanu oddi wrth Thalassolituus ac Oceanobacter (Ffigur 2). Cafodd tri math o facteria heb eu meithrin (GQ921362, GQ921357 a GQ921396) eu hynysu o'r dŵr hollt ar ddyfnder o 1.3 cilometr ym mwynglawdd aur De Affrica yn 2009, ac roedd y ddau arall (DQ256320 a DQ337006) o ddŵr daear (hefyd yn Ne Affrica). yn 2005). Mae'r dilyniant genynnau rRNA 16S sydd â'r cysylltiad agosaf ag ASxL5T yn rhan o'r dilyniant genynnau rRNA 16S a gafwyd o ddiwylliant cyfoethogi gwaddodion tywodlyd a gafwyd o draethau gogledd Ffrainc yn 2006 (rhif derbyn AM29240828). Cafwyd dilyniant genynnau rRNA 16S arall o'r bacteriwm heb ei feithrin HQ183822.1 o danc casglu a drwytholchwyd o safle tirlenwi dinesig yn Tsieina. Yn amlwg, nid yw bacteria ASxL5T yn gynrychioliadol iawn mewn cronfeydd data tacsonomig, ond mae'r dilyniannau hyn o facteria heb eu meithrin yn debygol o gynrychioli organebau tebyg i ASxL5T, sy'n cael eu dosbarthu ledled y byd, fel arfer mewn amgylcheddau heriol. O'r dadansoddiad ffylogenetig genom cyfan, yr agosaf o'i gymharu ag ASxL5T yw Thalassolituus sp. C2-1, T. marinus, T. oleivorans. Ac O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Mae Thalassolituus yn aelod o facteria darnio hydrocarbon morol gorfodol (OHCB), sy'n gyffredin mewn amgylcheddau morol a daearol, ac fel arfer yn dod yn flaenllaw ar ôl digwyddiadau llygredd hydrocarbon30,31. Nid yw bacteria morol yn aelodau o'r grŵp OHCB, ond maent wedi'u hynysu o'r amgylchedd morol.
Mae data ffenoteipig yn dangos bod ASxL5T yn rhywogaeth newydd ac yn aelod o genws nas cydnabyddir o'r blaen yn y teulu spirospiracae morol. Ar hyn o bryd nid oes safon glir i ddosbarthu rhywogaethau sydd newydd eu hynysu yn genws newydd. Mae ymdrechion wedi'u gwneud i bennu ffiniau genera cyffredinol, er enghraifft, yn seiliedig ar ganran genom protein ceidwadol (POCP), argymhellir bod gwerth y torbwynt 50% yn union yr un fath â'r straen cyfeirio33. Mae eraill yn awgrymu defnyddio gwerthoedd AAI, sydd â manteision dros POCP oherwydd gellir eu cael o genomau anghyflawn34. Mae'r awdur yn credu, os yw'r gwerth AAI yn llai na 74% o'i gymharu â straen enghreifftiol y rhywogaeth enghreifftiol, mae'r straen yn gynrychioliadol o genera gwahanol. Y genws model yn y spirillaceae morol yw spirillum morol, a straen y model yw O. linum ATCC 11336T. Y gwerth AAI rhwng ASxL5T ac O. linum ATCC 11336T yw 54.34%, a'r gwerth AAI rhwng ASxL5T a T. oleivorans MIL-1T (straen math genws) yw 67.61%, sy'n nodi bod ASxL5T yn cynrychioli genws newydd sy'n wahanol i Thalassolituus. Gan ddefnyddio'r dilyniant genynnau rRNA 16S fel y safon ddosbarthu, ffin amffiniad y genws a awgrymir yw 94.5%35. Gellir gosod ASxL5T yn y genws Thalassolituus, gan ddangos hunaniaeth dilyniant rRNA 95.03% 16S gyda T. oleivorans MIL-1T a 96.17%. marinws IMCC1826T. Fodd bynnag, bydd hefyd yn cael ei roi yn y genws Bacteroides sydd â hunaniaeth genyn rRNA 94.64% 16S gyda B. sanyensis NV9, sy'n nodi y gall defnyddio genyn unigol fel y genyn rRNA 16S arwain at ddosbarthu ac aseinio mympwyol. Mae dull arall a awgrymir yn defnyddio ANI a Sgôr Aliniad Genom (AF) i archwilio clystyru pwyntiau data o bob math a straen di-fath o genera presennol. Mae'r awdur yn argymell cyfuno ffin y genws â phwynt ffurfdro'r genws amcangyfrifedig sy'n benodol i'r tacsa sy'n cael ei ddadansoddi. Fodd bynnag, os nad oes digon o ddilyniannau genom cyflawn o ynysiadau Thalassolituus, mae'n amhosibl pennu a yw ASxL5T yn perthyn i'r genws Thalassolituus trwy'r dull hwn. Oherwydd argaeledd cyfyngedig dilyniannau genom cyflawn i'w dadansoddi, dylid bod yn ofalus wrth ddehongli'r goeden genom ffylogenetig gyfan. Yn ail, ni all dulliau cymharu genomau cyfan gyfrif am wahaniaethau sylweddol ym maint y genomau a gymharir. Fe wnaethon nhw fesur tebygrwydd genynnau un copi craidd cadw rhwng genera cysylltiedig, ond nid oeddent yn ystyried y nifer fawr o enynnau nad ydynt yn bresennol yn y genom llawer llai ASxL5T. Yn amlwg, mae gan ASxL5T a grwpiau gan gynnwys Thalassolituus, Oceanobacter, a Bacterioplanes hynafiad cyffredin, ond mae esblygiad wedi cymryd llwybr gwahanol, gan arwain at ostyngiad yn y genom, a allai fod i addasu i ffordd o fyw rheibus. Mae hyn yn wahanol i T. oleivorans MIL-1T, sydd 28% yn fwy ac sydd wedi esblygu o dan bwysau amgylcheddol gwahanol i ddefnyddio hydrocarbonau23,30. Gellir gwneud cymhariaeth ddiddorol â pharasitiaid mewngellol a symbiontau gorfodol, megis Rickettsia, Chlamydia, a Buchnera. Mae eu maint genom tua 1 Mb. Mae'r gallu i ddefnyddio metabolion celloedd cynnal yn arwain at golli genynnau, felly Wedi dioddef dirywiad genomig esblygiadol sylweddol. Gall newidiadau esblygiadol o organebau maethol cemegol morol i ffyrdd ysglyfaethus o fyw arwain at ostyngiad tebyg ym maint y genom. Mae dadansoddiad COG a KEGG yn amlygu nifer y genynnau a ddefnyddir ar gyfer swyddogaethau penodol a'r gwahaniaethau byd-eang yn y llwybrau genomig rhwng ASxL5T a T. oleivorans MIL-1T, nad ydynt oherwydd argaeledd eang elfennau genetig symudol. Y gwahaniaeth yng nghymhareb G + C genom cyfan ASxL5T yw 56.1%, ac un T. oleivorans MIL-1T yw 46.6%, sydd hefyd yn nodi ei fod wedi'i wahanu.
Mae archwilio cynnwys codio'r genom ASxL5T yn rhoi mewnwelediad swyddogaethol i nodweddion ffenotypig. Mae presenoldeb genynnau sy'n amgodio math IV fimbriae (Tfp) o ddiddordeb arbennig oherwydd eu bod yn hyrwyddo symudiad celloedd, a elwir yn gleidio cymdeithasol neu gonfylsiynau, heb flagella ar yr wyneb. Yn ôl adroddiadau, mae gan Tfp swyddogaethau eraill, gan gynnwys ysglyfaethu, pathogenesis, ffurfio biofilm, cymeriant DNA naturiol, cydgrynhoi a datblygu celloedd yn awtomatig38. Mae genom ASxL5T yn cynnwys 18 genyn sy'n amgodio diguanylate cyclase (ensym sy'n cataleiddio trosi 2 guanosine triphosphate yn guanosine 2 ffosffad a diGMP cylchol) a 6 genyn yn amgodio'r diguanylate cyclase phosphate diguanylate cyfatebol. Mae'r genyn ar gyfer esterase (cataleiddio diraddiad di-GMP cylchol i monoffosffad guanosine) yn ddiddorol oherwydd bod cyc-di-GMP yn ail negesydd pwysig sy'n ymwneud â datblygu a gwahanu biofilm, symudiad, ymlyniad celloedd a ffyrnigrwydd 39, 40 yn y broses. Dylid nodi hefyd y dangoswyd bod GMP dwbl cylchol mewn Bdellovibrio bacteriovorus yn rheoli'r pontio rhwng bywyd rhydd a ffordd o fyw rheibus41.
Mae'r rhan fwyaf o ymchwil ar facteria rheibus wedi canolbwyntio ar rywogaethau Bdellovibrio, Bdellovibrio, a Myxococcus. Mae'r rhain ac enghreifftiau hysbys eraill o facteria rheibus yn ffurfio grŵp amrywiol. Er gwaethaf yr amrywiaeth hwn, mae set o deuluoedd protein nodweddiadol sy'n adlewyrchu ffenoteipiau 11 o facteria rheibus hysbys wedi'u nodi3,22. Fodd bynnag, dim ond genynnau amgodio O antigen ligase (waaL) sydd wedi'u nodi, sy'n arbennig o gyffredin mewn bacteria Gram-negyddol. Nid yw'r math hwn o ddadansoddiad yn ddefnyddiol wrth ddynodi ASxL5T fel ysglyfaethwr, yn ôl pob tebyg oherwydd ei fod yn defnyddio strategaeth ymosod newydd. Bydd argaeledd genomau bacteriol rheibus mwy amrywiol yn helpu i ddatblygu dadansoddiadau cydraniad manylach sy'n ystyried tystiolaeth o wahaniaethau swyddogaethol ac amgylcheddol rhwng aelodau'r grŵp. Mae enghreifftiau o facteria ysglyfaethus nad ydynt wedi'u cynnwys yn y dadansoddiad hwn yn cynnwys aelodau o Cupriavidus necator42 a Bradymonabacteria43, oherwydd wrth i ymchwilwyr ymchwilio i gymunedau microbaidd gwahanol, sefydlir tacsa mwy rheibus.
Nodwedd fwyaf nodedig bacteria ASxL5T a ddaliwyd gan ddelwedd TEM yw ei morffoleg unigryw a hyblyg, a all hyrwyddo rhyngweithio â bacteria ysglyfaethus. Mae'r math o ryngweithio a welir yn wahanol i facteria rheibus eraill ac nid yw wedi'i ddarganfod na'i adrodd o'r blaen. Dangosir y cylch bywyd rheibus ASxL5T arfaethedig yn Ffigur 5. Prin yw'r enghreifftiau yn y llenyddiaeth sydd â strwythurau apical tebyg fel yr adroddwn yma, ond mae'r enghreifftiau hyn yn cynnwys Terasakiispira papahanaumokuakeensis, bacteriwm spirillum morol gydag ehangiad apex achlysurol 44, ac Alphaproteobacteria, Terasakiella pusilla , gynt yn perthyn i'r genws Oceanospirillum, arddangos Yr hyn a elwir "ffilm begynol" 45. Mae ffurfiau cocci i'w gweld yn aml mewn diwylliannau hŷn, yn enwedig ar gyfer bacteria â ffurfiau crwm, megis Vibrio, Campylobacter, a Helicobacter 46, 47, 48, a all gynrychioli cyflwr diraddiol. Mae angen gwneud rhagor o waith i egluro union gylchred oes bacteria ASxL5T. Penderfynu sut mae'n dal ac ysglyfaethu, ac a yw ei genom yn amgodio cyfansoddion sy'n weithredol yn fiolegol y gellir eu defnyddio at ddibenion meddygol neu fiotechnolegol.
Disgrifiad o Venatorbacter gen. Mae Tachwedd Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. yn cynnwys awyryddion o L. n. venator,'hunter' a Gr. n. bacter,'a rod'. Venatorbacter,'a hunting Rod' . Celloedd yn aerobig, halen-goddefgar, crwm staen Gram negyddol, nid yw gweithgaredd Catalase a oxidase yn cronni Yn yr ystod tymheredd o 4 i 42 ° C Wedi'i fewngronio. Mae'r ystod pH o 4-9 yn anarferol Mae :0 3-OH a C10:0 3-OH i'w cael fel asidau brasterog hydroxy. Nid ydynt yn tyfu mewn cyfrwng cawl. Mae'r cynnwys DNA G + C yn 56.1 mol%.
Disgrifiad o Venatorbacter cucullus sp. Tachwedd Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus yn golygu fairing).
Yn ogystal, nodwedd ddisgrifiadol y genws hwn yw bod y celloedd, pan gânt eu tyfu ar BA neu BHI, yn 1.63 µm o hyd a 0.37 µm o led. Mae'r cytrefi ar BHI agar yn fach iawn, gan gyrraedd 2 mm mewn diamedr ar ôl 72 awr. Maent yn llwydfelyn, tryloyw, crwn, amgrwm a sgleiniog. Gall aelodau'r rhywogaeth hon ddefnyddio Escherichia coli a Klebsiella. Mae Campylobacter a nifer o facteria Gram-negyddol eraill yn ysglyfaeth.
Cafodd y straen nodweddiadol ASxL5T ei ynysu o laeth cig eidion yn Swydd Nottingham, y DU, a'i adneuo yn y Casgliad Diwylliant Math Cenedlaethol (DU): rhif derbyn NCTC 14397 a rhif derbyn Casgliad Diwylliant Bacteraidd yr Iseldiroedd (NCCB) NCCB 100775. Dilyniant genom cyflawn ASxL5T wedi'i adneuo yn Genbank yn ôl ychwanegu CP046056.
Cafodd bacteria ASxL5T eu hynysu oddi wrth laeth cig eidion gan ddefnyddio technoleg ynysu phage9,49. Gwanhawyd y slyri 1:9 (w/v) mewn byffer SM (50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 0.1 M NaCl, 8 mM MgSO4.7H2O a 0.01% gelatin; Sigma Aldrich, Gillingham, DU), Yna deor ar 4°C am 24 awr, gan gylchdroi'n araf i eliwtio'r ysglyfaethwyr i'r byffer. Cafodd yr ataliad ei allgyrchu ar 3000g am 3 munud. Casglwyd y supernatant a'i allgyrchu ar 13,000g am yr eildro am 5 munud. Yna cafodd yr uwchnatant ei basio trwy hidlydd pilen 0.45 µm (Minisart; Sartorius, Gottingen, yr Almaen) a hidlydd pilen 0.2 µm (Minisart) i gael gwared ar unrhyw gelloedd bacteriol oedd ar ôl. Gall ASxL5T basio'r hidlwyr hyn. Paratowyd lawnt agar meddal o Campylobacter enterosus S12 (rhif derbyn NCBI CP040464) o'r un slyri gan ddefnyddio technegau safonol. Dosbarthwyd y slyri wedi'i hidlo ar bob un o'r cellblatiau cynnal hyn mewn defnynnau 10 µl mewn triphlyg a'u gadael i sychu. Deorwyd y plât mewn tanc microaeroffilig ar 37 ° C am 48 awr o dan amodau microaerobig (5% O2, 5% H2, 10% CO2, ac 80% N2). Cafodd y plac gweladwy a gafwyd ei dynnu i mewn i glustogfa SM a'i drosglwyddo i lawnt ffres C. hyointestinalis S12 i ledaenu'r organebau lysed ymhellach. Unwaith y penderfynir mai'r bacteria yw achos y plac lytig ac nid y phage, ceisiwch dyfu'r organeb yn annibynnol ar y gwesteiwr a'i nodweddu ymhellach. Perfformiwyd y diwylliant aerobig ar 37 °C gyda 5% v/v gwaed ceffyl wedi'i ddiffibrineiddio (TCS Biosciences Lt, Buckingham, UK, atodiad). Yn ôl canllawiau'r Pwyllgor Safonau Clinigol Cenedlaethol, defnyddir y dull tryledu disg ar gyfer profi tueddiad gwrthfacterol. Cafodd agar BHI ei feithrin ar 37 °C gan ddefnyddio disg yn cynnwys y gwrthfiotigau canlynol (Oxoid) ar gyfer meithriniad aerobig: amoxicillin ac asid clavulanig 30 µg; cefotaxime 30 µg; streptomycin 10 µg; ciprofloxacin 5 µg; Ceftazidime 30 µg Asid nalidixig 30 µg; Imipenem 10 µg; Azithromycin 15 µg; Cloramphenicol 30 µg; Cefoxitin 30 µg; Tetracycline 30 µg; Nitrofurantoin 300 µg; Aztreonam 30 µg; Ampicillin 10 µg; Cefpodoxime 10 µg; Trimethoprim-Sulfamethoxazole 25 µg. Sefydlwyd y goddefgarwch halen trwy ddeor aerobig ar blatiau agar BHI ar 37 ° C. Ychwanegwyd NaCl ychwanegol at y platiau agar BHI i ddarparu ystod crynodiad o hyd at 10% w/v. Mae'r ystod pH yn cael ei bennu gan ddiwylliant aerobig ar blatiau agar BHI ar 37 ° C, lle mae'r ystod pH wedi'i addasu i rhwng 4 a 9 gyda HCl di-haint neu NaOH di-haint, a bod y gwerth pH targed yn cael ei wirio cyn arllwys y plât. Ar gyfer dadansoddiad asid brasterog cellog, cafodd ASxL5T ei feithrin ar BHI agar am 3 diwrnod ac aerobig ar 37 ° C. Yn ôl protocol safonol MIDI (System Adnabod Microbaidd Sherlock, fersiwn 6.10) o FERA Science Ltd, (Efrog, DU), echdynnwyd, paratowyd a dadansoddwyd asidau brasterog celloedd.
Ar gyfer TEM, cafodd ASxL5T ei feithrin yn aerobig trwy wasgaru'n unffurf ar BA ar 37 ° C am 24 awr, ac yna ei gynaeafu i 1 ml o glutaraldehyde 3% (v/v) mewn byffer cacodylate 0.1 M ar dymheredd ystafell Atgyweiria am 1 awr, yna centrifuge ar 10,000 g am 3 munud. Yna ailddechrau'r belen yn ysgafn mewn byffer cacodylate 600 μl 0.1 M. Trosglwyddwch yr ataliad ASxL5T sefydlog i'r ffilm Formvar/carbon ar grid copr 200 rhwyll. Cafodd y bacteria eu staenio â 0.5% (w/v) asetad wranyl am 1 munud a'u harchwilio gan TEM gan ddefnyddio microsgop TEI Tecnai G2 12 Biotwin. Fel y soniwyd uchod, cyfunwch yr un nifer o ysglyfaeth ac ysglyfaethwyr mewn cawl NZCYM (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) a deorwch am 48 awr o dan amodau microaerobig Campylobacter neu Campylobacter ar 37°C , Rhyngweithiad ysglyfaethwr ac ysglyfaeth archwiliwyd hefyd gan TEM. Amodau aerobig ar gyfer Escherichia coli. Archwilio bacteria ysglyfaethus a rheibus yn annibynnol i ganfod unrhyw newidiadau ym morffoleg celloedd oherwydd ysglyfaethu. Defnyddiwyd dull du Sudan ar gyfer microsgopeg optegol o groniad PHB.
Tyfu diwylliannau ASxL5T dros nos trwy daenu twf ar blatiau BHI neu BA gyda swab di-haint. Casglwch gelloedd ASxL5T a'u hatal mewn MRD (CM0733, Oxoid), ac yna eu gosod ar 4 ° C am 7 diwrnod i newynu'r celloedd. Cafodd diwylliant bacterol stoc cyfeirio NCTC neu labordy ei frechu i broth BHI neu broth maethol Rhif 2 (CM007, Oxoid), ei ddeor dros nos, ei allgyrchu ar 13,000g a'i ail-ddarparu yn MRD nes bod OD600 yn 0.4. Diwylliant: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter Aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus Faecalis NCTC 775T, Escherichia coli nctc 86, Kleba 10 ocsitocala, Lexiela, Kleba 116, Kleba Listeria Bacteria arbennig NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, Rhodococcus llong danfor hamburger NCTC 1621T, Salmonella bacteria berfeddol Mondeville NCTC 5747 NC, Stalococws NCTC 5741, NCTC 5741 NC aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. Deorwyd y gwesteiwr Campylobacter yn ficroaerobig ar blatiau BA ar 37°C a'i atal mewn cawl NZCYM. Y gwesteiwyr Campylobacter a brofwyd yw: C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11458, C. NC. PT14, C... Casglu celloedd mewn MRD, centrifuge ar 13,000g ac ailddechrau yn MRD nes bod OD600 yn 0.4. Ychwanegwch aliquot o ataliad o 0.5 ml at agar uchaf NZCYM wedi'i doddi 5 ml (0.6% agar) a'i arllwys ar blât gwaelod NZCYM 1.2%. Ar ôl halltu a sychu, dosbarthwyd yr ASxL5T wedi'i wanhau'n gyfresol fel defnynnau 20 µl ar bob bwrdd lawnt yn driphlyg. Mae'r diwylliant tymheredd ac awyrgylch yn dibynnu ar ofynion y bacteria prawf.
Defnyddiwch Becyn DNA Genomig Bacteraidd GenElute™ (Sigma Aldridge) i baratoi DNA o unigion bacteriol. Defnyddiwyd dulliau safonol ar gyfer ymhelaethu PCR o genynnau rRNA 16S a phenderfynu dilyniant cynnyrch gan ddefnyddio cemeg terfynu llifyn (Gwasanaeth Darllen Gwerth Eurofins, yr Almaen). Defnyddiwch y rhaglen BLAST-N i gymharu'r dilyniannau hyn â dilyniannau genynnau rRNA 16S eraill i nodi a chasglu rhywogaethau sy'n perthyn yn agos. Mae'r rhain wedi'u halinio gan ddefnyddio ClustalW yn rhaglen MEGA X. Ail-luniwyd y goeden ffylogenetig gan ddefnyddio MEGA X gan ddefnyddio'r dull tebygolrwydd mwyaf yn seiliedig ar fodel Tamura-Nei, gyda 1000 o gopïau tywys54. Defnyddiwch PureLink™ Genomic DNA Kit (Fisher Scientific, Loughborough, UK) i echdynnu DNA ar gyfer dilyniannu genom cyfan. Penderfynwyd ar ddilyniant genom ASxL5T gan ddefnyddio cyfuniad Illumina MiSeq, sy'n cynnwys 250 bp o ddarlleniadau pen dwbl yn cynnwys llyfrgell a baratowyd gan ddefnyddio pecyn labelu Nextera a darlleniadau 2 i 20 kb hir o blatfform PacBio. Cyfleuster Ymchwil Dilyniannu DNA Genomeg ym Mhrifysgol Sembia. Cafodd y genom ei ymgynnull gan ddefnyddio Mainc Waith Genomeg CLC 12.0.3 (Qiagen, Aarhus, Denmarc). Mae diwylliannau ASxL5T yn cael eu hadneuo yn y Casgliad Diwylliant Math Cenedlaethol (DU) a Chasgliad Diwylliant Bacteraidd yr Iseldiroedd (NCCB). Genomau organebau cysylltiedig a ddefnyddir ar gyfer cymharu yw: Thalassolituus oleivorans MIL-1T (rhif derbyn HF680312, cyflawn); Bacteroplanes sanyensis KCTC 32220T (rhif derbyn BMYY01000001, anghyflawn); Oceanobacter kriegii DSM 6294T (rhif derbyn NZ_AUGV00000000, anghyflawn); Cymuned Marinamonas DSM 5604T (ychwanegwyd ASM436330v1, anghyflawn), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (ychwanegwyd MTSD02000001, anghyflawn) a Thalassolituus sp. C2-1 (ychwanegu NZ_VNIL01000001, anghyflawn). Defnyddiwch JGI Genom Portal36 yn https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page= i bennu'r sgôr aliniad (AF) a'r hunaniaeth asid niwclëig ar gyfartaledd (ANI). Mewn parau. Defnyddiwyd y dull o Rodriguez-R & Konstantinidis55 i bennu hunaniaeth asid amino (AAI). Defnyddiwch GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 i gynhyrchu amcangyfrif o goeden ffylogenetig tebygolrwydd uchaf. Mae'r genom mewnbwn sy'n cynrychioli'r genom cyfeirio sydd ar gael yn cael ei ddewis o'r genera cyfeirio a nodwyd fel rhai sy'n gysylltiedig ag ASxL5T o ffylogeni rRNA 16S. Wedi anodi'r goeden gan ddefnyddio'r offeryn rhyngweithiol coeden bywyd ar-lein ( https://itol.embl.de/ ). Mae anodi a dadansoddi swyddogaethol y genom ASxL5T yn cael ei wneud gan ddefnyddio offeryn ar-lein BlastKOALA KEGG gan ddefnyddio dosbarthiad cyfoethogi modiwl KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genoms). Mae dosbarthiad categorïau COG (grwpiau ortholog) yn cael ei bennu gan ddefnyddio offeryn ar-lein mapiwr eggNOG.
Pérez, J., Moraleda-Muñoz, A., Marcos-Torres, FJ a Muñoz-Dorado, J. Ysglyfaethu bacteriol: 75 mlynedd ac mae'n parhau! . amgylchedd. micro-organeb. 18, 766–779 (2016).
Linares-Otoya, L. ac ati Amrywiaeth a photensial gwrthfacterol bacteria rheibus ar arfordir Periw. Cyffuriau Mawrth. 15. E308. https://doi.org/10.3390/md15100308 (2017).
Pasternak, Z. et al. Trwy eu genynnau, byddwch chi'n eu deall: nodweddion genomig bacteria rheibus. ISME J. 7, 756–769 (2013).
Sockett, AG Ffordd o fyw rheibus y bacterioffag Bdellovibrio. gosod. Bugeiliaid microbau. 63, 523–539 (2009).
Korp, J., Vela Gurovic, MS & Nett, M. Gwrthfiotigau rhag bacteria rheibus. Beilstein J. Histochemistry 12, 594–607 (2016).
Mae Johnke, J., Fraune, S., Bosch, TCG, Hentschel, U. & Schulenburg, H. Bdellovibrio ac organebau tebyg yn rhagfynegwyr amrywiaeth microbiomau mewn gwahanol boblogaethau cynnal. micro-organeb. Ecoleg. 79, 252–257 (2020).
Vila, J., Moreno-Morales, J. a Ballesté-Delpierre, C. Darganfod statws presennol asiantau gwrthfacterol newydd. clinigol. micro-organeb. Heintio. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2019.09.015 (2019).
Hobley, L. et al. Gall ysglyfaethu deuol phage a phage ddileu ysglyfaeth E. coli heb un ysglyfaethu. J. Bacteria. 202, e00629-19. https://doi.org/10.1128/JB.00629-19 (2020).
El-Shibiny, A., Connerton, PL & Connerton, IF Cyfrif ac amrywiaeth Campylobacter a bacterioffagau a ynysu yn ystod cylch bwydo ieir buarth ac organig. Amgylchedd cais. micro-organeb. 71, 1259–1266 (2005).
Wilkinson, DA ac ati. Diweddaru tacsonomeg genomig ac epidemioleg moch Campylobacter. gwyddoniaeth. Cynrychiolydd 8, 2393. https://doi.org/10.1038/s41598-018-20889-x (2018).
Lee, MD GToTree: Llif gwaith hawdd ei ddefnyddio ar gyfer genomeg systemau. Biowybodeg 35, 4162–4164 (2019).
Edgar, RC MUSCLE: Dull alinio dilyniant lluosog sy'n lleihau cymhlethdod amser a gofod. Gwybodaeth fiolegol BMC. 5, 113 (2004).
Capella-Gutiérrez, S., Silla-Martínez, JM & Gabaldón, T. TrimAl: Offeryn ar gyfer aliniad awtomatig a thocio mewn dadansoddiad ffylogenetig ar raddfa fawr. Biowybodeg 25, 1972–1973 (2009).
Hyatt, D., LoCascio, PF, Hauser, LJ & Uberbacher, genyn EC a chyfieithu dilyniant metagenomig dechrau rhagfynegiad safle. Biowybodeg 28, 2223-2230 (2012).
Shen, W. & Xiong, J. TaxonKit: Pecyn cymorth dosbarthu NCBI traws-lwyfan ac effeithlon. Bio Rxiv. (Cyrchwyd ar 1 Mehefin, 2021); https://www.biorxiv.org/content/10.1101/513523v1 (2019).
Pris, MN, Dehal, PS & Arkin, AP FastTree 2-goeden tebygolrwydd uchafswm bras gydag aliniad mawr. PLoS Un 5, e9490 (2010).
Tange, O. GNU Cyfochrog. (Cyrchwyd ar 1 Mehefin, 2021); https://zenodo.org/record/1146014#.YOHaiJhKiUk (2018).
Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: Gwyddoniadur Genynnau a Genomau Kyoto. Ymchwil asid niwcleig. 28, 27-30 (2000).
Gweriniaeth Tsiec, L. ac ati Rôl extremolytes ectoine a hydroxyectoine fel amddiffynwyr straen a maetholion: geneteg, genomeg system, biocemeg, a dadansoddi strwythurol. Genyn (Basel). 9. E177. https://doi.org/10.3390/genes9040177 (2018).
Gregson, BH, Metodieva, G., Metodiev, MV, Golyshin, PN & McKew, BA Mynegiant protein gwahaniaethol yn ystod twf y bacteriwm hydrocarbon-ddiraddiol morol gorfodol Thalassolituus oleivorans MIL-1 yn ystod twf alcanau cadwyn canolig a hir. blaen. micro-organeb. 9, 3130 (2018).
Pasternak, Z., Ben Sasson, T., Cohen, Y., Segev, E., a Jurkevitch, E. Mae dull genomeg gymharol newydd ar gyfer diffinio dangosyddion ffenotypig-benodol yn datgelu etifeddiaeth benodol mewn marc bacteria rheibus. Llyfrgell Gwyddoniaeth Gyhoeddus Un. 10. e0142933. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142933 (2015).
Yakimov, MM, ac ati genyn Thalassolituus oleivorans. Tachwedd, sp. nov., math newydd o facteria morol sy'n arbenigo mewn defnyddio hydrocarbonau. rhyngwladoldeb. J. System. esblygiad. micro-organeb. 54, 141–148 (2004).
Wang, Y., Yu, M., Liu, Y., Yang, X. & Zhang, XH Bacteroplanoides pacificum gen. Tachwedd, sp. Ym mis Tachwedd, gwahanodd oddi wrth y dŵr môr sy'n cylchredeg yn Ne'r Môr Tawel. rhyngwladoldeb. J. System. esblygiad. micro-organeb. 66, 5010–5015 (2016).


Amser postio: Tachwedd-05-2021