En ny type gramnegative, aerobe, salttolerante, aktive, stavformede og rovbakterier ASxL5T blev isoleret fra en komøgdam i Nottinghamshire, England, og brugte Campylobacter som sit bytte. Efterfølgende blev andre Campylobacter-arter og medlemmer af Enterobacteriaceae-familien opdaget som bytte. Efter subkultur uden værtsceller blev der opnået svag aseptisk vækst på Brain Heart Infusion Agar. De optimale vækstbetingelser er 37 °C og pH er 7. Transmissionselektronmikroskopi afslørede nogle meget usædvanlige morfologiske træk relateret til tilgængeligheden af ​​bytte. Fylogenetisk analyse under anvendelse af 16S rRNA-gensekvensen indikerede, at isolatet er relateret til et medlem af Marine Spirulina-familien, men kan ikke klart klassificeres som et medlem af nogen kendt slægt. Helgenomsekventering af ASxL5T bekræftede forholdet til medlemmer af de marine spirocheter. En databasesøgning afslørede, at adskillige ASxL5T'er deler 16S rRNA-gensekvenser med adskillige udyrkede bakterier fra havet, landoverfladen og grundvandet. Vi foreslår, at stammen ASxL5T repræsenterer en ny art i en ny slægt. Vi anbefaler navnet Venatorbacter cucullus gen. november, sp. I november blev ASxL5T brugt som typestamme.
Rovbakterier er bakterier, der udviser evnen til at jage og dræbe andre levende bakterier for at opnå biosyntetiske materialer og energi. Dette er forskelligt fra den generelle genvinding af næringsstoffer fra døde mikroorganismer, og det er også forskellig fra parasitiske interaktioner, hvor bakterier danner et tæt forhold til deres vært uden at dræbe dem. Rovbakterier har udviklet forskellige livscyklusser for at drage fordel af rigelige fødekilder i de nicher, hvor de findes (såsom marine habitater). De er en taksonomisk forskelligartet gruppe, som kun er forbundet med deres unikke steriliseringslivscyklus1. Eksempler på rovbakterier er fundet i flere forskellige phyla, herunder: Proteobakterier, Bacteroides og Chlorella.3. De mest velundersøgte rovbakterier er imidlertid Bdellovibrio og Bdellovibrio-og-lignende organismer (BALOs4). Rovbakterier er en lovende kilde til nye biologisk aktive forbindelser og antibakterielle midler5.
Rovbakterier menes at øge den mikrobielle mangfoldighed og have en positiv indvirkning på økosystemernes sundhed, produktivitet og stabilitet6. På trods af disse positive egenskaber er der få undersøgelser af nye rovbakterier på grund af vanskeligheden ved at dyrke bakterier og behovet for nøje at observere celleinteraktioner for at forstå deres komplekse livscyklusser. Denne information er ikke let at få fra computeranalyse.
I en tid med stigende antimikrobiel resistens studeres nye strategier til at målrette mod bakterielle patogener, såsom brugen af ​​bakteriofager og rovbakterier7,8. ASxL5T-bakterier blev isoleret i 2019 ved hjælp af fagisoleringsteknologi fra komøg indsamlet fra Dairy Centre ved University of Nottingham, Nottinghamshire. Formålet med undersøgelsen er at isolere organismer med potentiale som biologiske bekæmpelsesmidler. Campylobacter hyointestinalis er et zoonotisk patogen, som i stigende grad forbindes med menneskelige tarmsygdomme10. Det er allestedsnærværende i serum og bruges som målvært.
ASxL5T-bakterien blev isoleret fra oksekødsgele, fordi det blev observeret, at de plaques, den dannede på græsplænen af ​​C. hyointestinalis, lignede dem, der blev produceret af bakteriofager. Dette er et uventet fund, fordi en del af fagisoleringsprocessen involverer filtrering gennem et 0,2 µm filter, som er designet til at fjerne bakterieceller. Mikroskopisk undersøgelse af materialet ekstraheret fra pladen viste, at de små gramnegative buede stavformede bakterier ikke akkumulerede polyhydroxybutyrat (PHB). Den aseptiske kultur uafhængig af bytteceller realiseres på rigt fast medium (såsom hjernehjerteinfusionsagar (BHI) og blodagar (BA)), og dens vækst er svag. Det opnås efter subkultur med kraftig inokulum forbedre. Den vokser lige godt under mikroaerobe (7 % v/v oxygen) og atmosfæriske oxygenforhold, men ikke i en anaerob atmosfære. Efter 72 timer var diameteren af ​​kolonien meget lille og nåede 2 mm, og den var beige, gennemskinnelig, rund, konveks og skinnende. Standard biokemisk test er hæmmet, fordi ASxL5T ikke kan dyrkes pålideligt i flydende medier, hvilket tyder på, at det kan stole på den komplekse livscyklus af biofilmdannelse. Imidlertid viste pladesuspensionen, at ASxL5T er aerob, positiv for oxidase og katalase og kan tolerere 5 % NaCl. ASxL5T er resistent over for 10 µg streptomycin, men er følsomt over for alle andre testede antibiotika. ASxL5T-bakteriecellerne blev undersøgt ved TEM (figur 1). Når de dyrkes uden bytteceller på BA, er ASxL5T-celler små Campylobacter, med en gennemsnitlig længde på 1,63 μm (± 0,4), en bredde på 0,37 μm (± 0,08) og en enkelt lang (op til 5 μm) pol. Seksuel flageller. Cirka 1,6% af cellerne ser ud til at have en bredde på mindre end 0,2 μm, hvilket vil tillade passage gennem filteranordningen. En usædvanlig strukturel forlængelse blev observeret på toppen af ​​nogle celler, svarende til en kåbe (latinsk cucullus) (se pilene i 1D, E, G). Dette synes at være sammensat af overskydende ydre membran, hvilket kan skyldes den hurtige reduktion i størrelsen af ​​den periplasmatiske kappe, mens den ydre membran forbliver intakt og viser et "løst" udseende. Dyrkning af ASxL5T i fravær af næringsstoffer (i PBS) i lang tid ved 4°C resulterede i, at de fleste (men ikke alle) celler viste en kokosmorfologi (figur 1C). Når ASxL5T vokser med Campylobacter jejuni som bytte i 48 timer, er den gennemsnitlige cellestørrelse signifikant længere og smallere end celler dyrket uden en vært (tabel 1 og figur 1E). I modsætning hertil, når ASxL5T vokser med E. coli som bytte i 48 timer, er den gennemsnitlige cellestørrelse længere og bredere, end når den vokser uden bytte (tabel 1), og cellelængden er variabel, normalt viser den filamentøs (figur 1F). Når de blev inkuberet med Campylobacter jejuni eller E. coli som bytte i 48 timer, viste ASxL5T-celler overhovedet ingen flageller. Tabel 1 opsummerer observationerne af ændringer i cellestørrelse baseret på tilstedeværelsen, fraværet og byttetypen af ​​ASxL5T.
TEM-visning af ASx5LT: (A) ASx5LT viser lang pisk; (B) typisk ASx5LT batteri; (C) cocci ASx5LT-celler efter lang inkubation uden næringsstoffer; (D) en gruppe ASx5LT-celler viser abnormitet (E) ASx5LT-cellegruppe inkuberet med Campylobacter-bytte udviste øget cellelængde sammenlignet med dem uden byttedyrvækst (D) viste også apikal struktur; (F) Store filamentøse flageller, ASx5LT-celler, efter inkubation med E. coli-bytte; (G) En enkelt ASx5LT-celle efter inkubation med E. coli, der viser en usædvanlig topstruktur. Søjlen repræsenterer 1 μm.
Bestemmelse af 16S rRNA-gensekvensen (accessionsnummer MT636545.1) gør det muligt for databasesøgninger at etablere sekvenser svarende til dem i Gammaproteobacteria-klassen og er tættest på marine bakterier i den marine spirillum-familie (figur 2) og er medlemmer af Thalassolituus-slægten Den nærmeste slægtning til Marine Bacillus. 16S rRNA-gensekvensen er klart forskellig fra de rovbakterier, der tilhører familien Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria). De parvise sammenligninger af B. bacteriovorus HD100T (typestamme, DSM 50701) og B. bacteriovorus DM11A var 48,4 % og 47,7 %, og for B. exovorus JSS var den 46,7 %. ASxL5T-bakterier har 3 kopier af 16S rRNA-genet, hvoraf to er identiske med hinanden, og den tredje er 3 baser fra hinanden. To andre predatoriske bakterieisolater (ASx5S og ASx5O; 16S rRNA-genaccessionsnumre er henholdsvis MT636546.1 og MT636547.1) med lignende morfologiske og fænotypiske karakteristika fra samme sted er ikke de samme, men de er forskellige fra ASxL5T og ukulturelt Bakterie. databasesekvenser er klynget sammen med andre slægter i Oceanospirillaceae (figur 2). Hele genomsekvensen af ​​ASxL5T er blevet bestemt og gemt i NCBI-databasen, og accessionsnummeret er CP046056. Genomet af ASxL5T består af et cirkulært kromosom på 2.831.152 bp med et G + C-forhold på 56,1%. Genomsekvensen indeholder 2653 CDS (total), hvoraf 2567 er forudsagt at kode for proteiner, hvoraf 1596 kan tildeles som formodede funktioner (60,2%). Genomet indeholder 67 RNA-kodende gener, herunder 9 rRNA'er (3 hver for 5S, 16S og 23S) og 57 tRNA'er. De genomiske karakteristika af ASxL5T blev sammenlignet med de tilgængelige genomer af stammer af den nærmeste relative type identificeret fra 16S rRNA-gensekvensen (tabel 2). Brug aminosyreidentitet (AAI) til at sammenligne alle tilgængelige Thalassolituus-genomer med ASxL5T. Den nærmeste tilgængelige (ufuldstændige) genomsekvens bestemt af AAI er Thalassolituus sp. C2-1 (tilføj NZ_VNIL01000001). Denne stamme blev isoleret fra dybhavssedimenterne i Mariana-graven, men der er i øjeblikket ingen fænotypisk information om denne stamme til sammenligning. Sammenlignet med ASxL5T's 2,82 Mb er organismens genom større med 4,36 Mb. Den gennemsnitlige genomstørrelse af marine spirocheter er omkring 4,16 Mb (± 1,1; n = 92 komplette referencegenomer undersøgt fra https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), så genomet af ASxL5T er på linje med rækkefølge I forhold til de øvrige medlemmer er den ret lille. Brug GToTree 1.5.54 til at generere et genom-baseret estimeret maksimal sandsynlighed fylogenetisk træ (Figur 3A), ved at bruge de justerede og forbundne aminosyresekvenser af 172 enkeltkopi gener, der er specifikke for Gammaproteobacteria 11,12,13,14,15,16, 17,18. Analysen viste, at det er tæt beslægtet med Thalassolituus, Bacterial Plane og Marine Bacterium. Disse data indikerer imidlertid, at ASxL5T er forskellig fra dets slægtninge i Marine Spirulina, og dets genomsekvensdata er tilgængelige.
Det fylogenetiske træ ved hjælp af 16S rRNA-gensekvensen fremhæver positionen af ​​ASxL5T-, ASxO5- og ASxS5-stammerne (med indvoldene) i forhold til de udyrkede og marine bakteriestammer i Marine Spirulinaceae. Genbank-adgangsnummeret følger stammenavnet i parentes. Brug ClustalW til at justere sekvenser, og brug metoden med maksimal sandsynlighed og Tamura-Nei-modellen til at udlede fylogenetiske relationer og udføre 1000 guidede replikationer i MEGA X-programmet. Tallet på grenen angiver, at den guidede kopiværdi er større end 50 %. Escherichia coli U/541T blev anvendt som en udgruppe.
(A) Et fylogenetisk træ baseret på genomet, der viser forholdet mellem den marine Spirospiraceae bakterie ASxL5T og dens nære slægtninge, E. coli U 5/41T som en udgruppe. (B) Sammenlignet med T. oleivorans MIL-1T forudsiges den funktionelle kategorifordeling af gener baseret på den orthologe gruppe (COG) klynge af ASx5LT-protein. Figuren til venstre viser antallet af gener i hver funktionel COG-kategori i hvert genom. Grafen til højre viser procentdelen af ​​genomer indeholdt i hver funktionel COG-gruppe. (C) Sammenlignet med T. oleiverans MIL-1T, analysen af ​​den komplette KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) modulære pathway af ASxL5T.
Brug af KEGG-databasen til at undersøge de komponentgener, der er til stede i ASxL5T-genomet, afslørede den typiske metaboliske vej for aerob gamma Proteus. ASxL5T indeholder i alt 75 gener tildelt til bakterielle motorproteiner, herunder gener involveret i kemotaksi, flagellasamling og type IV fimbriae-system. I den sidste kategori er 9 ud af 10 gener ansvarlige for en række andre organismers rykkebevægelser. Genomet af ASxL5T indeholder en komplet tetrahydropyrimidin biosyntesevej, der deltager i den beskyttende reaktion på osmotisk stress20, som forventet for halofiler. Genomet indeholder også mange komplette veje for cofaktorer og vitaminer, herunder riboflavinsynteseveje. Selvom alkan 1-monooxygenase (alkB2) genet er til stede i ASxL5T, er kulbrinteudnyttelsesvejen ikke fuldstændig. I genomsekvensen af ​​ASxL5T er homologer af gener identificeret som hovedsageligt ansvarlige for nedbrydningen af ​​kulbrinter i T. oleiverans MIL-1T21, såsom TOL_2658 (alkB) og TOL_2772 (alkoholdehydrogenase), åbenlyst fraværende. Figur 3B viser sammenligningen af ​​genfordeling i COG-kategorien mellem ASxL5T og olivenolie MIL-1T. Samlet set indeholder det mindre ASxL5T-genom forholdsmæssigt færre gener fra hver COG-kategori sammenlignet med det større relaterede genom. Når antallet af gener i hver funktionel kategori er udtrykt som en procentdel af genomet, noteres forskelle i procentdelen af ​​gener i kategorierne translation, ribosomstruktur og biogenese, og energiproduktions- og konverteringsfunktionskategorierne, som udgør den større ASxL5T genom Procentdelen sammenlignes med den samme gruppe i T. oleiverans MIL-1T genomet. I modsætning hertil, sammenlignet med ASxL5T-genomet, har T. oleivorans MIL-1T en højere procentdel af gener i replikations-, rekombinations- og reparations- og transkriptionskategorierne. Interessant nok er den største forskel i indholdet af hver funktionel kategori af de to genomer antallet af ukendte gener til stede i ASxL5T (figur 3B). En berigelsesanalyse af KEGG-moduler blev udført, hvor hvert KEGG-modul repræsenterer et sæt af manuelt definerede funktionelle enheder til annotering og biologisk fortolkning af genomsekvensdata. Sammenligningen af ​​genfordelingen i den komplette KOG-modulvej for ASxL5T og oliven MIL-1T er vist i figur 3C. Denne analyse viser, at selvom ASxL5T har en komplet svovl- og nitrogenmetabolismevej, har T. oleiverans MIL-1T det ikke. I modsætning hertil har T. oleiverans MIL-1T en komplet cystein- og methionin metabolisk vej, men den er ufuldstændig i ASxL5T. Derfor har ASxL5T et karakteristisk modul til sulfatassimilering (defineret som et sæt gener, der kan bruges som fænotypiske markører, såsom metabolisk kapacitet eller patogenicitet; https://www.genome.jp/kegg/module.html) I T oleiverans MIL-1T. Sammenligning af genindholdet i ASxL5T med listen over gener, der tyder på en rovdyr livsstil, er ikke entydigt. Selvom waaL-genet, der koder for ligasen forbundet med O-antigenet polysaccharidet til kernen, er til stede i ASxL5T-genomet (men det er almindeligt i mange gramnegative bakterier), kan tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO) gener inkludere de 60 aminosyrer sure områder, der almindeligvis findes i rovbakterier, som ikke er til stede. Der er ingen andre prædatoriske karakteristiske gener i ASxL5T-genomet, inklusive dem der koder for enzymer involveret i isoprenoid biosyntese i mevalonat-vejen. Bemærk, at der ikke er noget transskriptionelt regulatorisk gen gntR i den undersøgte rovdyrgruppe, men tre gntR-lignende gener kan identificeres i ASxL5T.
De fænotypiske karakteristika for ASxL5T er opsummeret i tabel 3 og sammenlignet med de fænotypiske karakteristika for beslægtede slægter 23, 24, 25, 26 og 27 rapporteret i litteraturen. Isolater fra T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis og Oceanobacter kriegii er aktive, salttolerante, oxidasepositive stavformede legemer, men har næsten ingen andre fænotypiske karakteristika med ASxL5T. Den gennemsnitlige pH i havet er 8,1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77), hvilket afspejles i T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis og O. kriegii. ASxL5T er velegnet til det større pH-område (4-9), typisk for ikke-marine arter. Fænotypiske karakteristika for Thalassolituus sp. C2-1. Ukendt. Væksttemperaturområdet for ASxL5T er generelt bredere end for marine stammer (4-42 °C), selvom nogle, men ikke alle T. marinus-isolater, er varmetolerante. Manglende evne til at dyrke ASxL5T i bouillonmedier forhindrede yderligere fænotypisk karakterisering. Brug API 20E til at teste materialerne skrabet fra BA-pladen, ONPG, arginindihydrolase, lysindecarboxylase, ornithin-decarboxylase, citratudnyttelse, urease, tryptophan-deaminase, gelatinehydrolyseenzym, testresultaterne var alle negative, men ingen indol, acetoin og H2S blev produceret. Ufermenterede kulhydrater omfatter: glucose, mannose, inositol, sorbitol, rhamnose, saccharose, melibiose, amygdalin og arabinose. Sammenlignet med de publicerede relaterede referencestammer er den cellulære fedtsyreprofil for ASxL5T-stammen vist i tabel 4. De vigtigste cellulære fedtsyrer er C16:1ω6c og/eller C16:1ω7c, C16:0 og C18:1ω9. Hydroxyfedtsyrer C12:0 3-OH og C10:0 3-OH findes også. Forholdet mellem C16:0 i ASxL5T er højere end den rapporterede værdi af relaterede slægter. I modsætning hertil, sammenlignet med den rapporterede T. marinus IMCC1826TT, er forholdet mellem C18:1ω7c og/eller C18:1ω6c i ASxL5T reduceret. oleivorans MIL-1T og O. kriegii DSM 6294T, men ikke påvist i B. sanyensis KCTC 32220T. Sammenligning af fedtsyreprofilerne for ASxL5T og ASxLS afslørede subtile forskelle i mængden af ​​individuelle fedtsyrer mellem de to stammer, som er i overensstemmelse med den genomiske DNA-sekvens af den samme art. Ingen poly-3-hydroxybutyrat (PHB)-partikler blev påvist under anvendelse af Sudan black-testen.
Predationsaktiviteten af ​​ASxL5T-bakterier blev undersøgt for at bestemme byttets rækkevidde. Denne bakterie kan danne plaques på Campylobacter-arter, herunder: Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T; Escherichia coli NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; C lari NCTC 11458 og C. upsaliensis NCTC 11541T. Brug de kulturer, der er angivet i afsnittet om bestemmelse af værtsområde i metoden til at teste en bredere række af gramnegative og grampositive bakterier. Resultaterne viser, at ASxL5T også kan anvendes i Escherichia coli NCTC 86 og Citrobacter freundii NCTC 9750T. Plaques dannet på Klebsiella oxytoca 11466. TEM-interaktionen med E. coli NCTC 86 er vist i figur 4A-D, og ​​interaktionen med Campylobacter jejuni PT14 og Campylobacter suis S12 er vist i figur 4E-H i midten. Angrebsmekanismen synes at være forskellig mellem de testede byttedyrstyper, med en eller flere E. coli-celler knyttet til hver ASxL5T-celle og placeret lateralt langs den udvidede celle før adsorption. I modsætning hertil ser ASxL5T ud til at binde sig til Campylobacter gennem et enkelt kontaktpunkt, normalt i kontakt med spidsen af ​​rovdyrcellen og nær spidsen af ​​Campylobacter-cellen (figur 4H).
TEM, der viser interaktionen mellem ASx5LT og bytte: (AD) og E. coli bytte; (EH) og C. jejuni bytte. (A) En typisk ASx5LT-celle forbundet til en enkelt E. coli (EC)-celle; (B) En filamentøs ASx5LT fastgjort til en enkelt EC-celle; (C) En filamentøs ASx5LT-celle forbundet til flere EC-celler; (D) Vedhæftning af mindre ASx5LT-celler på en enkelt E. coli (EC)-celle; (E) en enkelt ASx5LT-celle forbundet til en Campylobacter jejuni (CJ)-celle; (F) ASx5LT angriber C. hyointestinalis (CH) celler; (G) to En ASx5LT-celle angreb en CJ-celle; (H) Et nærbillede af ASx5LT-fastgørelsespunktet nær toppen af ​​CJ-cellen (bar 0,2 μm). Søjlen repræsenterer 1 μm i (A–G).
Rovbakterier har udviklet sig til at drage fordel af rigelige kilder til bytte. Det er klart, at de er bredt til stede i mange forskellige miljøer. På grund af befolkningsmedlemmernes snævre størrelse er det muligt at isolere ASxL5T-bakterier fra gyllen ved hjælp af fagseparationsmetoden. Den genomiske relevans af ASxL5T for medlemmer af oceanospirillaceae-familien af ​​marine bakterier er overraskende, selvom organismen er salttolerant og kan vokse på et medium, der indeholder 5 % salt. Vandkvalitetsanalyse af gyllen viste, at natriumchloridindholdet var mindre end 0,1 %. Derfor er mudder langt væk fra havmiljøet - både geografisk og kemisk. Tilstedeværelsen af ​​tre beslægtede, men forskellige isolater fra samme kilde, viser, at disse rovdyr trives i dette ikke-marine miljø. Derudover viste mikrobiomanalyse (datafiler tilgængelige fra https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990), at den samme 16S rRNA gensekvens er placeret i de 50 mest udbredte operationelle taxa (OTU) ) I nogle få prøvetagningsintervaller af mudderet. Der blev fundet flere udyrkede bakterier i Genbank-databasen, som har 16S rRNA-gensekvenser, der ligner ASxL5T-bakterier. Disse sekvenser, sammen med sekvenserne af ASxL5T, ASxS5 og ASxO5, synes at repræsentere forskellige klader adskilt fra Thalassolituus og Oceanobacter (figur 2). Tre slags udyrkede bakterier (GQ921362, GQ921357 og GQ921396) blev isoleret fra sprækkevandet i en dybde på 1,3 kilometer i den sydafrikanske guldmine i 2009, og de to andre (DQ256320 og DQ337006 var også fra Sydafrika) i 2005). 16S rRNA-gensekvensen, der er tættest beslægtet med ASxL5T, er en del af 16S rRNA-gensekvensen opnået fra berigelseskulturen af ​​sandede sedimenter opnået fra strandene i det nordlige Frankrig i 2006 (accessionsnummer AM29240828). En anden nært beslægtet 16S rRNA-gensekvens fra den udyrkede bakterie HQ183822.1 blev opnået fra en opsamlingstank udvasket fra en kommunal losseplads i Kina. Det er klart, at ASxL5T-bakterier ikke er meget repræsentative i taksonomiske databaser, men disse sekvenser fra udyrkede bakterier repræsenterer sandsynligvis organismer, der ligner ASxL5T, som er fordelt over hele verden, normalt i udfordrende miljøer. Fra hele genomets fylogenetiske analyse er den nærmeste slægtning til ASxL5T Thalassolituus sp. C2-1, T. marinus, T. oleivorans. Og O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus er medlem af marine obligate kulbrintefragmenteringsbakterier (OHCB), som er udbredt i marine og terrestriske miljøer og normalt bliver den dominerende efter kulbrinteforureningshændelser30,31. Marine bakterier er ikke medlemmer af OHCB-gruppen, men er isoleret fra havmiljøet.
Fænotypiske data indikerer, at ASxL5T er en ny art og et medlem af en tidligere ikke-anerkendt slægt i den marine spirospiraceae-familie. Der er i øjeblikket ingen klar standard til at klassificere nyligt isolerede stammer i en ny slægt. Der er blevet gjort forsøg på at bestemme universelle slægtsgrænser, for eksempel, baseret på procentdelen af ​​genomet af et konservativt protein (POCP), anbefales det, at cut-off værdien er 50 % identisk med referencestammen33. Andre foreslår at bruge AAI-værdier, som har fordele i forhold til POCP, fordi de kan opnås fra ufuldstændige genomer34. Forfatteren mener, at hvis AAI-værdien er mindre end 74% sammenlignet med modelstammen af ​​modelarten, er stammen en repræsentant for en anden slægt. Modelslægten i marine spirillaceae er marine spirillum, og modelstammen er O. linum ATCC 11336T. AAI-værdien mellem ASxL5T og O. linum ATCC 11336T er 54,34 %, og AAI-værdien mellem ASxL5T og T. oleivorans MIL-1T (stammer af slægtstype) er 67,61 %, hvilket indikerer, at ASxL5T repræsenterer en ny slægt, der er forskellig fra Thalassolituus. Ved at bruge 16S rRNA-gensekvensen som klassifikationsstandard er den foreslåede slægtsafgrænsningsgrænse 94,5 %35. ASxL5T kan placeres i Thalassolituus-slægten og viser 95,03 % 16S rRNA-sekvensidentitet med T. oleivorans MIL-1T og 96,17 %. marinus IMCC1826T. Det vil dog også blive placeret i Bacteroides-slægten, der har 94,64 % 16S rRNA-genidentitet med B. sanyensis NV9, hvilket indikerer, at brugen af ​​et enkelt gen såsom 16S rRNA-genet kan føre til vilkårlig klassificering og tildeling. En anden foreslået metode bruger ANI og Genome Alignment Score (AF) til at undersøge klyngingen af ​​datapunkter fra alle typer og ikke-type stammer af eksisterende slægter. Forfatteren anbefaler at kombinere slægtsgrænsen med bøjningspunktet for den estimerede slægt, der er specifik for den taxa, der analyseres. Men hvis der ikke er nok komplette genomsekvenser fra Thalassolituus-isolater, er det umuligt at afgøre, om ASxL5T tilhører Thalassolituus-slægten ved denne metode. På grund af den begrænsede tilgængelighed af komplette genomsekvenser til analyse, bør hele genomets fylogenetiske træ fortolkes med forsigtighed. For det andet kan helgenomsammenligningsmetoder ikke tage højde for væsentlige forskelle i størrelsen af ​​de sammenlignede genomer. De målte ligheden mellem konserverede kerne-enkeltkopi-gener mellem beslægtede slægter, men tog ikke højde for det store antal gener, der ikke er til stede i det meget mindre genom af ASxL5T. Det er klart, at ASxL5T og grupper inklusive Thalassolituus, Oceanobacter og Bacterioplanes har en fælles forfader, men evolutionen har taget en anden vej, hvilket fører til en reduktion i genomet, hvilket kan være at tilpasse sig en rovdyr livsstil. Dette er i modsætning til T. oleivorans MIL-1T, som er 28 % større og har udviklet sig under forskellige miljømæssige belastninger til at udnytte kulbrinter23,30. En interessant sammenligning kan laves med obligate intracellulære parasitter og symbionter, såsom Rickettsia, Chlamydia og Buchnera. Deres genomstørrelse er omkring 1 Mb. Evnen til at udnytte værtscellemetabolitter fører til gentab, så Undergik betydelig evolutionær genomisk nedbrydning. Evolutionære ændringer fra marine kemiske næringsstoforganismer til rovlivsstil kan resultere i en tilsvarende reduktion i genomstørrelse. COG- og KEGG-analysen fremhæver antallet af gener, der anvendes til specifikke funktioner, og de globale forskelle i de genomiske veje mellem ASxL5T og T. oleivorans MIL-1T, som ikke skyldes den udbredte tilgængelighed af mobile genetiske elementer. Forskellen i G + C-forholdet for hele genomet af ASxL5T er 56,1 %, og for T. oleivorans MIL-1T er 46,6 %, hvilket også indikerer, at det er segregeret.
Undersøgelse af det kodende indhold af ASxL5T-genomet giver funktionel indsigt i fænotypiske karakteristika. Tilstedeværelsen af ​​gener, der koder for type IV fimbriae (Tfp) er af særlig interesse, fordi de fremmer cellebevægelse, kaldet social glidning eller kramper, uden flageller på overfladen. Ifølge rapporter har Tfp andre funktioner, herunder prædation, patogenese, biofilmdannelse, naturlig DNA-optagelse, automatisk celleaggregering og udvikling38. ASxL5T-genomet indeholder 18 gener, der koder for diguanylatcyclase (et enzym, der katalyserer omdannelsen af ​​2 guanosintriphosphat til guanosin 2-phosphat og cyklisk diGMP) og 6 gener, der koder for det tilsvarende diguanylatcyclase-phosphatdiguanylat. Genet for esterase (katalyserer nedbrydningen af ​​cyklisk di-GMP til guanosinmonophosphat) er interessant, fordi cycl-di-GMP er en vigtig anden budbringer involveret i biofilmudvikling og -separation, bevægelse, cellevedhæftning og virulens 39, 40 i processen. Det skal også bemærkes, at i Bdellovibrio bacteriovorus har cyklisk dobbelt GMP vist sig at kontrollere overgangen mellem frit liv og rovlivsstil41.
Det meste af forskningen i rovbakterier har fokuseret på Bdellovibrio, Bdellovibrio-lignende organismer og Myxococcus-arter. Disse og andre kendte eksempler på rovbakterier udgør en mangfoldig gruppe. På trods af denne mangfoldighed er et sæt karakteristiske proteinfamilier, der afspejler fænotyperne af 11 kendte rovbakterier, blevet identificeret3,22. Imidlertid er kun gener, der koder for O-antigen-ligase (waaL), blevet identificeret, hvilket er særligt almindeligt i gramnegative bakterier. Denne form for analyse er ikke nyttig til at udpege ASxL5T som et rovdyr, sandsynligvis fordi den bruger en ny angrebsstrategi. Tilgængeligheden af ​​mere forskelligartede rovbakterienomer vil hjælpe med at udvikle finere opløsningsanalyser, der tager højde for beviser på funktionelle og miljømæssige forskelle mellem gruppemedlemmer. Eksempler på rovbakterier, der ikke er inkluderet i denne analyse, omfatter medlemmer af Cupriavidus necator42 og Bradymonabacteria43, fordi efterhånden som forskere undersøger forskellige mikrobielle samfund, etableres flere rovtaxa.
Det mest bemærkelsesværdige træk ved ASxL5T-bakterier fanget af TEM-billede er dens unikke og fleksible morfologi, som kan fremme interaktion med byttedyrsbakterier. Den observerede type interaktion er forskellig fra andre rovbakterier og er ikke tidligere blevet opdaget eller rapporteret. Den foreslåede ASxL5T predatoriske livscyklus er vist i figur 5. Der er få eksempler i litteraturen med lignende apikale strukturer, som vi rapporterer her, men disse eksempler omfatter Terasakiispira papahanaumokuakeensis, en marin spirillum-bakterie med lejlighedsvis apex-forstørrelse 44, og Alphaproteobacteria, Terasakiella pusakiella , der tidligere tilhørte slægten Oceanospirillum, udstiller Den såkaldte "polære film" 45. Cocci-former ses ofte i ældre kulturer, især for bakterier med buede former, såsom Vibrio, Campylobacter og Helicobacter 46, 47, 48, som kan repræsentere en nedbrudt tilstand. Der er behov for yderligere arbejde for at klarlægge den præcise livscyklus for ASxL5T-bakterier. For at bestemme, hvordan den fanger og bytter, og om dens genom koder for biologisk aktive forbindelser, der kan bruges til medicinske eller bioteknologiske formål.
Beskrivelse af Venatorbacter gen. November Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. er sammensat af venatorer fra L. n. venator, 'hunter' og Gr. n. bacter, 'en stang'. Venatorbacter, 'en jagtstang' Celler er aerobe, salttolerante, buede Gram-farve-negative, motionsstave og oxidaseaktivitet akkumuleres ikke. I temperaturområdet 4 til 42 °C Indgroet pH-området på 4-9 er usædvanligt. De fleste er intolerante over for sure pH-værdier. 0 og C18:1ω9; C12:0 3-OH og C10:0 3-OH findes som hydroxyfedt syrer. De vokser ikke i bouillon. DNA G + C-indholdet er 56,1 mol%. .
Beskrivelse af Venatorbacter cucullus sp. november Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus betyder kåbe).
Derudover er det beskrivende træk ved denne slægt, at når de dyrkes på BA eller BHI, er cellerne 1,63 µm lange og 0,37 µm brede. Kolonierne på BHI agar er meget små og når 2 mm i diameter efter 72 timer. De er beige, gennemskinnelige, runde, konvekse og skinnende. Medlemmerne af denne art kan bruge Escherichia coli og Klebsiella. Campylobacter og flere andre gramnegative bakterier tjener som bytte.
Den typiske stamme ASxL5T blev isoleret fra oksemælk i Nottinghamshire, UK, og deponeret i National Type Culture Collection (UK): accessionsnummer NCTC 14397 og Netherlands Bacterial Culture Collection (NCCB) accessionsnummer NCCB 100775. Den komplette genomsekvens af ASxL5T er deponeret i Genbank i henhold til tilføjelsen af ​​CP046056.
ASxL5T-bakterier blev isoleret fra oksemælk ved hjælp af fagisoleringsteknologi9,49. Opslæmningen blev fortyndet 1:9 (vægt/volumen) i SM-buffer (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,1 M NaCl, 8 mM MgSO4.7H2O og 0,01 % gelatine; Sigma Aldrich, Gillingham, UK), inkuber derefter ved 4°C i 24 timer, roterende langsomt for at eluere rovdyrene ind i bufferen. Suspensionen blev centrifugeret ved 3000 g i 3 minutter. Supernatanten blev opsamlet og centrifugeret ved 13.000 g for anden gang i 5 minutter. Supernatanten blev derefter ført gennem et 0,45 µm membranfilter (Minisart; Sartorius, Gottingen, Tyskland) og et 0,2 µm membranfilter (Minisart) for at fjerne eventuelle tilbageværende bakterieceller. ASxL5T kan passere disse filtre. En blød agarplæne af Campylobacter enterosus S12 (NCBI accessionsnummer CP040464) fra den samme opslæmning blev fremstillet under anvendelse af standardteknikker. Den filtrerede opslæmning blev fordelt på hver af disse værtscelleplader i 10 µl dråber i tre eksemplarer og fik lov til at tørre. Pladen blev inkuberet i en mikroaerofil tank ved 37°C i 48 timer under mikroaerobe betingelser (5% O2, 5% H2, 10% CO2 og 80% N2). Den opnåede synlige plak blev ekstraheret i SM-buffer og overført til den friske græsplæne af C. hyointestinalis S12 for yderligere at opformere de lyserede organismer. Når det er fastslået, at bakterierne er årsagen til den lytiske plaque og ikke fagen, skal du prøve at dyrke organismen uafhængigt af værten og yderligere karakterisere den. Den aerobe kultur blev udført ved 37 °C med 5 % v/v defibrineret hesteblod (TCS Biosciences Lt, Buckingham, UK, supplement). I henhold til retningslinjerne fra National Clinical Standards Committee anvendes diskdiffusionsmetoden til antibakteriel følsomhedstestning. BHI-agar blev dyrket ved 37°C under anvendelse af en skive indeholdende følgende antibiotika (Oxoid) til aerob dyrkning: amoxicillin og clavulansyre 30 µg; cefotaxim 30 µg; streptomycin 10 µg; ciprofloxacin 5 µg; Ceftazidim 30 µg Nalidixinsyre 30 µg; Imipenem 10 µg; Azithromycin 15 µg; Chloramphenicol 30 µg; Cefoxitin 30 µg; Tetracyclin 30 µg; nitrofurantoin 300 µg; Aztreonam 30 µg; Ampicillin 10 µg; Cefpodoxim 10 µg; Trimethoprim-Sulfamethoxazol 25 µg. Salttolerancen blev etableret ved aerob inkubation på BHI-agarplader ved 37 °C. Yderligere NaCl blev tilsat til BHI-agarpladerne for at give et koncentrationsområde på op til 10% vægt/volumen. pH-området bestemmes ved aerob kultur på BHI-agarplader ved 37°C, hvor pH-området er blevet justeret til mellem 4 og 9 med sterilt HCl eller sterilt NaOH, og mål-pH-værdien verificeres, før pladen hældes. Til cellulær fedtsyreanalyse blev ASxL5T dyrket på BHI-agar i 3 dage og aerob ved 37 °C. I henhold til MIDI (Sherlock Microbial Identification System, version 6.10) standardprotokol fra FERA Science Ltd, (York, UK), blev cellefedtsyrer ekstraheret, forberedt og analyseret.
Til TEM blev ASxL5T dyrket aerobt ved at sprede ensartet på BA ved 37°C i 24 timer og derefter høstet i 1 ml 3% (v/v) glutaraldehyd i 0,1 M cacodylatbuffer ved stuetemperatur Fix i 1 time, og centrifuger derefter ved 10.000 g i 3 minutter. Resuspender derefter forsigtigt pelleten i 600 μl 0,1 M cacodylatbuffer. Overfør den faste ASxL5T-suspension til Formvar/carbon-filmen på et 200 mesh kobbergitter. Bakterierne blev farvet med 0,5 % (vægt/volumen) uranylacetat i 1 minut og undersøgt ved TEM under anvendelse af et TEI Tecnai G2 12 Biotwin-mikroskop. Som nævnt ovenfor, kombiner det samme antal byttedyr og rovdyr i NZCYM bouillon (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) og inkuber i 48 timer under mikroaerobe forhold af Campylobacter eller Campylobacter ved 37°C, Interaktionen mellem rovdyr og bytte. blev også undersøgt af TEM. Aerobe forhold for Escherichia coli. Undersøg uafhængigt byttedyr og rovbakterier for at bestemme eventuelle ændringer i cellemorfologi på grund af prædation. Sudan black-metoden blev brugt til optisk mikroskopi af PHB-akkumulering.
Dyrk ASxL5T-kulturer natten over ved at smøre vækst på BHI- eller BA-plader med en steril vatpind. Saml ASxL5T-celler og suspender dem i MRD (CM0733, Oxoid), og anbring dem derefter ved 4°C i 7 dage for at udsulte cellerne. NCTC-reference- eller laboratorie-bakteriekulturen blev inokuleret i BHI-bouillon eller nr. 2-næringsbouillon (CM007, Oxoid), inkuberet natten over, centrifugeret ved 13.000 g og resuspenderet i MRD, indtil OD600 var 0,4. Kultur: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, LeNCiella 4oxyto6, LeNCiella 14oxyto6, LeNCiella 14oxyto6 10817, Listeria Special bacteria NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, Rhodococcus ubådshamburger NCTC 1621T, Salmonella bacteria moncildestinage 7, NCTC 1621T NCTC 10861, Staphylococcus aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. Campylobacter-værten blev mikroaerobt inkuberet på BA-plader ved 37°C NZ og CYM suspenderet. De testede Campylobacter-værter er: C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11458, C.i lari NCTC 11458, C.i lari je PT14, C... Saml celler i MRD, centrifuger ved 13.000 g og resuspender i MRD indtil OD600 er 0,4. Tilsæt en alikvot på 0,5 ml suspension til 5 ml smeltet NZCYM topagar (0,6 % agar) og hæld den på en 1,2 % NZCYM bundplade. Efter hærdning og tørring blev den serielt fortyndede ASxL5T fordelt som 20 µl dråber på hver plæneplade i tre eksemplarer. Kulturtemperaturen og atmosfæren afhænger af testbakteriernes krav.
Brug GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma Aldridge) til at forberede DNA fra bakterieisolater. Standardmetoder blev anvendt til PCR-amplifikation af 16S rRNA-gen og produktsekvensbestemmelse ved anvendelse af farvestoftermineringskemi (Eurofins Value Read Service, Tyskland). Brug BLAST-N-programmet til at sammenligne disse sekvenser med andre 16S rRNA-gensekvenser for at identificere og indsamle nært beslægtede arter. Disse er justeret ved hjælp af ClustalW i MEGA X-programmet. Det fylogenetiske træ blev rekonstrueret ved hjælp af MEGA X ved at bruge den maksimale sandsynlighedsmetode baseret på Tamura-Nei-modellen med 1000 guidede kopier54. Brug PureLink™ Genomic DNA Kit (Fisher Scientific, Loughborough, UK) til at ekstrahere DNA til hel-genom-sekventering. Genomsekvensen af ​​ASxL5T blev bestemt ved hjælp af Illumina MiSeq-kombinationen, som består af 250 bp dobbelt-endede læsninger sammensat af et bibliotek fremstillet ved hjælp af Nextera-mærkesættet og 2 til 20 kb lange læsninger fra PacBio-platformen. Genomics DNA Sequencing Research Facility ved Sembia University. Genomet blev samlet ved hjælp af CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen, Aarhus, Danmark). ASxL5T-kulturer deponeres i National Type Culture Collection (UK) og Netherlands Bacterial Culture Collection (NCCB). Genomerne af beslægtede organismer anvendt til sammenligning er: Thalassolituus oleivorans MIL-1T (accessionsnummer HF680312, komplet); Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (adgangsnummer BMYY01000001, ufuldstændig); Oceanobacter kriegii DSM 6294T (adgangsnummer NZ_AUGV00000000, ufuldstændig); Marinamonas community DSM 5604T (tilsat ASM436330v1, ufuldstændig), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (tilsat MTSD02000001, ufuldstændig) og Thalassolituus sp. C2-1 (tilføj NZ_VNIL01000001, ufuldstændig). Brug JGI Genome Portal36 på https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page= til at bestemme alignment score (AF) og gennemsnitlig nukleinsyreidentitet (ANI). I par. Metoden ifølge Rodriguez-R & Konstantinidis55 blev brugt til at bestemme aminosyreidentitet (AAI). Brug GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 til at generere et estimeret fylogenetisk træ med maksimal sandsynlighed. Inputgenomet, der repræsenterer det tilgængelige referencegenom, er valgt fra referenceslægter, der er identificeret som værende relateret til ASxL5T fra 16S rRNA-fylogenien. Kommenterede træet ved hjælp af det interaktive livstræ online-værktøj (https://itol.embl.de/). Den funktionelle annotering og analyse af ASxL5T-genomet udføres ved hjælp af BlastKOALA KEGG-onlineværktøjet ved hjælp af KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) modulberigelsesdistribution. Fordelingen af ​​COG-kategorier (orthologe grupper) bestemmes ved hjælp af eggNOG-mapper online-værktøjet.
Pérez, J., Moraleda-Muñoz, A., Marcos-Torres, FJ og Muñoz-Dorado, J. Bakteriel prædation: 75 år og det fortsætter! . miljø. mikroorganisme. 18, 766-779 (2016).
Linares-Otoya, L. etc. Diversitet og antibakterielt potentiale af rovbakterier på den peruvianske kystlinje. marts stoffer. 15. E308. https://doi.org/10.3390/md15100308 (2017).
Pasternak, Z. et al. Gennem deres gener vil du forstå dem: rovbakteriers genomiske karakteristika. ISME J. 7, 756-769 (2013).
Sockett, RE Den rovdyrske livsstil for bakteriofagen Bdellovibrio. installere. Pastor mikrober. 63, 523-539 (2009).
Korp, J., Vela Gurovic, MS & Nett, M. Antibiotika fra rovbakterier. Beilstein J. Histochemistry 12, 594-607 (2016).
Johnke, J., Fraune, S., Bosch, TCG, Hentschel, U. & Schulenburg, H. Bdellovibrio og lignende organismer er forudsigere for mikrobiomdiversitet i forskellige værtspopulationer. mikroorganisme. Økologi. 79, 252-257 (2020).
Vila, J., Moreno-Morales, J. og Ballesté-Delpierre, C. Oplev den aktuelle status for nye antibakterielle midler. klinisk. mikroorganisme. Inficere. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2019.09.015 (2019).
Hobley, L. et al. Den dobbelte prædation af fag og fag kan udrydde E. coli byttedyr uden en enkelt prædation. J. Bakterier. 202, e00629-19. https://doi.org/10.1128/JB.00629-19 (2020).
El-Shibiny, A., Connerton, PL & Connerton, IF Antallet og diversiteten af ​​Campylobacter og bakteriofager isoleret under fodringscyklussen af ​​fritgående og økologiske kyllinger. Applikationsmiljø. mikroorganisme. 71, 1259-1266 (2005).
Wilkinson, DA etc. Opdater den genomiske taksonomi og epidemiologi for Campylobacter-svin. videnskab. Repræsentant 8, 2393. https://doi.org/10.1038/s41598-018-20889-x (2018).
Lee, MD GToTree: Brugervenlig arbejdsgang til systemgenomik. Bioinformatics 35, 4162-4164 (2019).
Edgar, RC MUSKEL: En flersekvensjusteringsmetode, der reducerer tid og rumkompleksitet. BMC biologisk information. 5, 113 (2004).
Capella-Gutiérrez, S., Silla-Martínez, JM & Gabaldón, T. TrimAl: Et værktøj til automatisk justering og trimning i storstilet fylogenetisk analyse. Bioinformatics 25, 1972-1973 (2009).
Hyatt, D., LoCascio, PF, Hauser, LJ & Uberbacher, forudsigelse af startsted for EC-gen og metagenomisk sekvensoversættelse. Bioinformatics 28, 2223-2230 (2012).
Shen, W. & Xiong, J. TaxonKit: Cross-platform og effektiv NCBI-klassificeringsværktøjskasse. Bio Rxiv. (Få adgang den 1. juni 2021); https://www.biorxiv.org/content/10.1101/513523v1 (2019).
Pris, MN, Dehal, PS & Arkin, AP FastTree 2-omtrentligt maksimum sandsynlighed træ med stor justering. PLoS One 5, e9490 (2010).
Tange, O. GNU Parallel. (Få adgang den 1. juni 2021); https://zenodo.org/record/1146014#.YOHaiJhKiUk (2018).
Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Nukleinsyreforskning. 28, 27-30 (2000).
Tjekkiet, L. etc. Rollen af ​​ekstremolytter ektoin og hydroxyektoin som stressbeskyttere og næringsstoffer: genetik, systemgenomik, biokemi og strukturel analyse. Gene (Basel). 9. E177. https://doi.org/10.3390/genes9040177 (2018).
Gregson, BH, Metodieva, G., Metodiev, MV, Golyshin, PN & McKew, BA Differentiel proteinekspression under væksten af ​​den obligatoriske marine kulbrinte-nedbrydende bakterie Thalassolituus oleivorans MIL-1 under væksten af ​​middel- og langkædede alkaner. front. mikroorganisme. 9, 3130 (2018).
Pasternak, Z., Ben Sasson, T., Cohen, Y., Segev, E., og Jurkevitch, E. En ny komparativ genomisk metode til at definere fænotypiske specifikke indikatorer afslører specifik arv i rovbakterier mærke. Public Science Library One. 10. e0142933. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142933 (2015).
Yakimov, MM, etc. Thalassolituus oleivorans-gen. november, sp. nov., en ny type marine bakterier, der har specialiseret sig i brugen af ​​kulbrinter. internationalitet. J. System. udvikling. mikroorganisme. 54, 141-148 (2004).
Wang, Y., Yu, M., Liu, Y., Yang, X. & Zhang, XH. Bacterioplanoides pacificum gen. november, sp. I november adskilte den sig fra havvandet, der cirkulerede i det sydlige Stillehav. internationalitet. J. System. udvikling. mikroorganisme. 66, 5010-5015 (2016).