Eine neue Art von gramnegativen, aeroben, salztoleranten, aktiven, stäbchenförmigen und räuberischen Bakterien ASxL5T wurde aus einem Kuhmistteich in Nottinghamshire, England, isoliert und nutzte Campylobacter als Beute. Anschließend wurden weitere Campylobacter-Arten und Mitglieder der Familie Enterobacteriaceae als Beute entdeckt. Nach der Subkultur ohne Wirtszellen wurde auf Brain Heart Infusion Agar ein schwaches aseptisches Wachstum erzielt. Die optimalen Wachstumsbedingungen liegen bei 37 °C und einem pH-Wert von 7. Die Transmissionselektronenmikroskopie zeigte einige sehr ungewöhnliche morphologische Merkmale im Zusammenhang mit der Verfügbarkeit von Beutetieren. Die phylogenetische Analyse unter Verwendung der 16S-rRNA-Gensequenz ergab, dass das Isolat mit einem Mitglied der Marine Spirulina-Familie verwandt ist, aber nicht eindeutig als Mitglied einer bekannten Gattung klassifiziert werden kann. Die Gesamtgenomsequenzierung von ASxL5T bestätigte die Verwandtschaft mit Mitgliedern der marinen Spirochäten. Eine Datenbanksuche ergab, dass mehrere ASxL5Ts 16S-rRNA-Gensequenzen mit mehreren nicht kultivierten Bakterien aus dem Meer, der Landoberfläche und dem Grundwasser teilen. Wir vermuten, dass der Stamm ASxL5T eine neue Art in einer neuen Gattung darstellt. Wir empfehlen den Namen Venatorbacter cucullus gen. November, sp. Im November wurde ASxL5T als Typstamm verwendet.
Räuberbakterien sind Bakterien, die die Fähigkeit aufweisen, andere lebende Bakterien zu jagen und zu töten, um biosynthetische Materialien und Energie zu gewinnen. Dies unterscheidet sich von der allgemeinen Rückgewinnung von Nährstoffen aus toten Mikroorganismen und auch von parasitären Interaktionen, bei denen Bakterien eine enge Beziehung zu ihrem Wirt eingehen, ohne ihn zu töten. Räuberische Bakterien haben unterschiedliche Lebenszyklen entwickelt, um die reichhaltigen Nahrungsquellen in den Nischen, in denen sie vorkommen (z. B. Meereslebensräume), zu nutzen. Sie sind eine taxonomisch vielfältige Gruppe, die nur durch ihren einzigartigen Sterilisationslebenszyklus1 verbunden ist. Beispiele für räuberische Bakterien wurden in mehreren verschiedenen Phyla gefunden, darunter: Proteobacteria, Bacteroides und Chlorella.3. Die am besten untersuchten räuberischen Bakterien sind jedoch die Bdellovibrio- und Bdellovibrio-and-like-Organismen (BALOs4). Räuberische Bakterien sind eine vielversprechende Quelle für neue biologisch aktive Verbindungen und antibakterielle Wirkstoffe5.
Es wird angenommen, dass räuberische Bakterien die mikrobielle Vielfalt erhöhen und sich positiv auf die Gesundheit, Produktivität und Stabilität des Ökosystems auswirken6. Trotz dieser positiven Eigenschaften gibt es nur wenige Studien zu neuen räuberischen Bakterien, da die Kultivierung von Bakterien schwierig ist und die Zellinteraktionen sorgfältig beobachtet werden müssen, um ihre komplexen Lebenszyklen zu verstehen. Diese Informationen sind durch Computeranalysen nicht einfach zu erhalten.
In einer Zeit zunehmender antimikrobieller Resistenzen werden neue Strategien zur Bekämpfung bakterieller Krankheitserreger untersucht, beispielsweise der Einsatz von Bakteriophagen und räuberischen Bakterien7,8. ASxL5T-Bakterien wurden 2019 mithilfe der Phagenisolierungstechnologie aus Kuhmist isoliert, der im Dairy Centre der University of Nottingham, Nottinghamshire, gesammelt wurde. Ziel der Untersuchung ist die Isolierung von Organismen mit Potenzial als biologische Schädlingsbekämpfungsmittel. Campylobacter hyointestinalis ist ein zoonotischer Erreger, der zunehmend mit Darmerkrankungen beim Menschen in Verbindung gebracht wird10. Es ist im Serum allgegenwärtig und wird als Zielwirt verwendet.
Das Bakterium ASxL5T wurde aus Rindergelee isoliert, weil beobachtet wurde, dass die von ihm auf dem Rasen von C. hyointestinalis gebildeten Plaques denen ähnelten, die von Bakteriophagen produziert wurden. Dies ist ein unerwarteter Befund, da ein Teil des Phagenisolierungsprozesses das Filtern durch einen 0,2-µm-Filter umfasst, der zur Entfernung von Bakterienzellen ausgelegt ist. Die mikroskopische Untersuchung des aus der Plaque extrahierten Materials ergab, dass die kleinen gramnegativen, gebogenen, stäbchenförmigen Bakterien kein Polyhydroxybutyrat (PHB) anreicherten. Die von Beutezellen unabhängige aseptische Kultur wird auf reichhaltigem Festmedium (wie Hirn-Herz-Infusionsagar (BHI) und Blutagar (BA)) realisiert und ihr Wachstum ist schwach. Es wird nach Subkultur mit starkem Inokulum erhalten. Es wächst unter mikroaeroben (7 % v/v Sauerstoff) und atmosphärischen Sauerstoffbedingungen gleichermaßen gut, jedoch nicht in einer anaeroben Atmosphäre. Nach 72 Stunden war der Durchmesser der Kolonie sehr klein und erreichte 2 mm. Sie war beige, durchscheinend, rund, konvex und glänzend. Standardmäßige biochemische Tests werden dadurch erschwert, dass ASxL5T nicht zuverlässig in flüssigen Medien kultiviert werden kann, was darauf hindeutet, dass es möglicherweise auf dem komplexen Lebenszyklus der Biofilmbildung beruht. Die Plattensuspension zeigte jedoch, dass ASxL5T aerob, positiv für Oxidase und Katalase ist und 5 % NaCl verträgt. ASxL5T ist resistent gegen 10 µg Streptomycin, reagiert jedoch empfindlich auf alle anderen getesteten Antibiotika. Die ASxL5T-Bakterienzellen wurden mittels TEM untersucht (Abbildung 1). Wenn ASxL5T-Zellen ohne Beutezellen auf der BA gezüchtet werden, handelt es sich um kleine Campylobacter-Zellen mit einer durchschnittlichen Länge von 1,63 μm (± 0,4), einer Breite von 0,37 μm (± 0,08) und einem einzelnen langen (bis zu 5 μm) Pol. Sexuelle Flagellen. Ungefähr 1,6 % der Zellen scheinen eine Breite von weniger als 0,2 μm zu haben, was den Durchgang durch die Filtervorrichtung ermöglicht. Auf der Oberseite einiger Zellen wurde eine ungewöhnliche strukturelle Erweiterung beobachtet, ähnlich einer Verkleidung (lat. cucullus) (siehe die Pfeile in 1D, E, G). Dies scheint aus einer überschüssigen Außenmembran zu bestehen, was auf die schnelle Verkleinerung der periplasmatischen Hülle zurückzuführen sein könnte, während die Außenmembran intakt bleibt und ein „lockeres“ Aussehen zeigt. Die Kultivierung von ASxL5T in Abwesenheit von Nährstoffen (in PBS) über einen langen Zeitraum bei 4 °C führte dazu, dass die meisten (aber nicht alle) Zellen eine Kokkenmorphologie aufwiesen (Abbildung 1C). Wenn ASxL5T 48 Stunden lang mit Campylobacter jejuni als Beute wächst, ist die durchschnittliche Zellgröße deutlich länger und schmaler als bei Zellen, die ohne Wirt gewachsen sind (Tabelle 1 und Abbildung 1E). Wenn ASxL5T dagegen 48 Stunden lang mit E. coli als Beute wächst, ist die durchschnittliche Zellgröße länger und breiter als wenn es ohne Beute wächst (Tabelle 1), und die Zelllänge ist variabel und zeigt normalerweise filamentöse Zellen (Abbildung 1F). Bei einer 48-stündigen Inkubation mit Campylobacter jejuni oder E. coli als Beute zeigten ASxL5T-Zellen überhaupt keine Flagellen. Tabelle 1 fasst die Beobachtungen von Veränderungen der Zellgröße basierend auf der Anwesenheit, Abwesenheit und dem Beutetyp von ASxL5T zusammen.
TEM-Anzeige von ASx5LT: (A) ASx5LT zeigt lange Peitsche; (B) typischer ASx5LT-Akku; (C) Kokken ASx5LT-Zellen nach langer Inkubation ohne Nährstoffe; (D) Eine Gruppe von ASx5LT-Zellen weist eine Anomalie auf. (E) Die mit Campylobacter-Beute inkubierte ASx5LT-Zellengruppe zeigte eine erhöhte Zelllänge im Vergleich zu denen ohne Beutewachstum. (D) zeigte ebenfalls eine apikale Struktur. (F) Große filamentöse Flagellen, ASx5LT-Zellen, nach Inkubation mit E. coli-Beute; (G) Eine einzelne ASx5LT-Zelle nach Inkubation mit E. coli, die eine ungewöhnliche obere Struktur zeigt. Der Balken repräsentiert 1 μm.
Die Bestimmung der 16S-rRNA-Gensequenz (Zugangsnummer MT636545.1) ermöglicht Datenbanksuchen zur Ermittlung von Sequenzen, die denen der Gammaproteobacteria-Klasse ähneln und den Meeresbakterien der Familie der marinen Spirillums am nächsten kommen (Abbildung 2) und zur Gattung Thalassolituus gehören Der nächste Verwandte von Marine Bacillus. Die 16S-rRNA-Gensequenz unterscheidet sich deutlich von den räuberischen Bakterien der Familie Bdelvibrionaceae (Deltaproteobakterien). Die paarweisen Vergleiche von B. bacteriovorus HD100T (Typstamm, DSM 50701) und B. bacteriovorus DM11A betrugen 48,4 % und 47,7 % und für B. exovorus JSS waren es 46,7 %. ASxL5T-Bakterien verfügen über drei Kopien des 16S-rRNA-Gens, von denen zwei identisch sind und die dritte 3 Basen voneinander entfernt ist. Zwei weitere räuberische Bakterienisolate (ASx5S und ASx5O; 16S-rRNA-Gen-Zugangsnummern sind MT636546.1 bzw. MT636547.1) mit ähnlichen morphologischen und phänotypischen Merkmalen vom gleichen Standort sind nicht identisch, unterscheiden sich jedoch von ASxL5T und nicht kultivierten Bakterien Datenbanksequenzen werden zusammen mit anderen Gattungen in Oceanospirillaceae geclustert (Abbildung 2). Die gesamte Genomsequenz von ASxL5T wurde bestimmt und in der NCBI-Datenbank gespeichert. Die Zugangsnummer lautet CP046056. Das Genom von ASxL5T besteht aus einem kreisförmigen Chromosom von 2.831.152 bp mit einem G + C-Verhältnis von 56,1 %. Die Genomsequenz enthält insgesamt 2653 CDS, von denen 2567 voraussichtlich Proteine ​​kodieren, von denen 1596 als mutmaßliche Funktionen zugeordnet werden können (60,2 %). Das Genom enthält 67 RNA-kodierende Gene, darunter 9 rRNAs (jeweils 3 für 5S, 16S und 23S) und 57 tRNAs. Die genomischen Eigenschaften von ASxL5T wurden mit den verfügbaren Genomen von Stämmen des nächstgelegenen relativen Typs verglichen, der aus der 16S-rRNA-Gensequenz identifiziert wurde (Tabelle 2). Verwenden Sie die Aminosäureidentität (AAI), um alle verfügbaren Thalassolitus-Genome mit ASxL5T zu vergleichen. Die nächstgelegene verfügbare (unvollständige) Genomsequenz, die von AAI ermittelt wurde, ist Thalassolitus sp. C2-1 (NZ_VNIL01000001 hinzufügen). Dieser Stamm wurde aus den Tiefseesedimenten des Marianengrabens isoliert, es liegen jedoch derzeit keine phänotypischen Informationen zu diesem Stamm zum Vergleich vor. Im Vergleich zu den 2,82 MB von ASxL5T ist das Genom des Organismus mit 4,36 MB größer. Die durchschnittliche Genomgröße mariner Spirochäten beträgt etwa 4,16 MB (± 1,1; n = 92 vollständige Referenzgenome, untersucht von https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), sodass das Genom von ASxL5T mit dem übereinstimmt order Im Vergleich zu den anderen Mitgliedern ist es recht klein. Verwenden Sie GToTree 1.5.54, um einen genombasierten geschätzten phylogenetischen Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit (Abbildung 3A) zu erstellen, indem Sie die ausgerichteten und verknüpften Aminosäuresequenzen von 172 Einzelkopie-Genen verwenden, die für Gammaproteobakterien spezifisch sind 11,12,13,14,15,16, 17,18. Die Analyse zeigte, dass es eng mit Thalassolitus, Bacterial Plane und Marine Bacterium verwandt ist. Diese Daten deuten jedoch darauf hin, dass sich ASxL5T von seinen Verwandten in Marine Spirulina unterscheidet und seine Genomsequenzdaten verfügbar sind.
Der phylogenetische Baum unter Verwendung der 16S-rRNA-Gensequenz verdeutlicht die Position der Stämme ASxL5T, ASxO5 und ASxS5 (mit den Eingeweiden) im Vergleich zu den unkultivierten und marinen Bakterienstämmen in den Marine Spirulinaceae. Die Genbank-Zugangsnummer folgt dem Stammnamen in Klammern. Verwenden Sie ClustalW, um Sequenzen auszurichten, und verwenden Sie die Maximum-Likelihood-Methode und das Tamura-Nei-Modell, um phylogenetische Beziehungen abzuleiten, und führen Sie 1000 geführte Replikationen im MEGA X-Programm durch. Die Zahl auf dem Zweig gibt an, dass der Wert für geführte Kopie größer als 50 % ist. Als Fremdgruppe wurde Escherichia coli U/541T verwendet.
(A) Ein auf dem Genom basierender phylogenetischer Baum, der die Beziehung zwischen dem marinen Spirospiraceae-Bakterium ASxL5T und seinen nahen Verwandten, E. coli U 5/41T, als Außengruppe zeigt. (B) Im Vergleich zu T. oleivorans MIL-1T wird die Funktionskategorieverteilung der Gene basierend auf dem orthologen Gruppencluster (COG) des ASx5LT-Proteins vorhergesagt. Die Abbildung links zeigt die Anzahl der Gene in jeder funktionellen COG-Kategorie in jedem Genom. Die Grafik rechts zeigt den Prozentsatz der Genome, die in jeder funktionellen COG-Gruppe enthalten sind. (C) Im Vergleich zu T. oleiverans MIL-1T, die Analyse des vollständigen modularen KEGG-Signalwegs (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) von ASxL5T.
Die Verwendung der KEGG-Datenbank zur Untersuchung der im ASxL5T-Genom vorhandenen Komponentengene ergab den typischen Stoffwechselweg des aeroben Gamma-Proteus. ASxL5T enthält insgesamt 75 Gene, die bakteriellen Motorproteinen zugeordnet sind, einschließlich Genen, die an der Chemotaxis, dem Flagellenaufbau und dem Typ-IV-Fimbriensystem beteiligt sind. In der letzten Kategorie sind 9 von 10 Genen für die zuckende Bewegung einer Reihe anderer Organismen verantwortlich. Das Genom von ASxL5T enthält einen vollständigen Tetrahydropyrimidin-Biosyntheseweg, der an der Schutzreaktion auf osmotischen Stress20 beteiligt ist, wie es für Halophile erwartet wird. Das Genom enthält auch viele vollständige Wege für Cofaktoren und Vitamine, einschließlich Riboflavin-Synthesewege. Obwohl das Alkan-1-Monooxygenase-Gen (alkB2) in ASxL5T vorhanden ist, ist der Kohlenwasserstoffverwertungsweg nicht vollständig. In der Genomsequenz von ASxL5T fehlen offensichtlich Homologe von Genen, die hauptsächlich für den Abbau von Kohlenwasserstoffen in T. oleiverans MIL-1T21 verantwortlich sind, wie TOL_2658 (alkB) und TOL_2772 (Alkoholdehydrogenase). Abbildung 3B zeigt den Vergleich der Genverteilung in der COG-Kategorie zwischen ASxL5T und Olivenöl MIL-1T. Insgesamt enthält das kleinere ASxL5T-Genom im Vergleich zum größeren verwandten Genom proportional weniger Gene aus jeder COG-Kategorie. Wenn die Anzahl der Gene in jeder Funktionskategorie als Prozentsatz des Genoms ausgedrückt wird, werden Unterschiede im Prozentsatz der Gene in den Kategorien Translation, ribosomale Struktur und Biogenese sowie den Funktionskategorien Energieproduktion und -umwandlung festgestellt, die das größere ASxL5T bilden Genom Der Prozentsatz wird mit der gleichen Gruppe verglichen, die im MIL-1T-Genom von T. oleiverans vorhanden ist. Im Gegensatz dazu weist T. oleivorans MIL-1T im Vergleich zum ASxL5T-Genom einen höheren Prozentsatz an Genen in den Kategorien Replikation, Rekombination und Reparatur sowie Transkription auf. Interessanterweise besteht der größte Unterschied im Inhalt jeder Funktionskategorie der beiden Genome in der Anzahl der unbekannten Gene, die in ASxL5T vorhanden sind (Abbildung 3B). Es wurde eine Anreicherungsanalyse der KEGG-Module durchgeführt, wobei jedes KEGG-Modul einen Satz manuell definierter Funktionseinheiten zur Annotation und biologischen Interpretation von Genomsequenzdaten darstellt. Der Vergleich der Genverteilung im gesamten KOG-Modulweg von ASxL5T und Olive MIL-1T ist in Abbildung 3C dargestellt. Diese Analyse zeigt, dass ASxL5T zwar über einen vollständigen Schwefel- und Stickstoffstoffwechselweg verfügt, T. oleiverans MIL-1T jedoch nicht. Im Gegensatz dazu verfügt T. oleiverans MIL-1T über einen vollständigen Cystein- und Methionin-Stoffwechselweg, dieser ist jedoch bei ASxL5T unvollständig. Daher verfügt ASxL5T über ein charakteristisches Modul für die Sulfatassimilation (definiert als eine Reihe von Genen, die als phänotypische Marker wie Stoffwechselkapazität oder Pathogenität verwendet werden können; https://www.genome.jp/kegg/module.html) in T .oleiverans MIL-1T. Ein Vergleich des Gengehalts von ASxL5T mit der Liste der Gene, die auf einen räuberischen Lebensstil hinweisen, ist nicht schlüssig. Obwohl das waaL-Gen, das für die Ligase kodiert, die mit dem O-Antigen-Polysaccharid zum Kern verbunden ist, im ASxL5T-Genom vorhanden ist (aber es kommt bei vielen gramnegativen Bakterien häufig vor), können Tryptophan-2,3-Dioxygenase (TDO)-Gene die 60-Aminosäure enthalten saure Regionen, die häufig in räuberischen Bakterien vorkommen, aber nicht vorhanden sind. Im ASxL5T-Genom gibt es keine weiteren räuberischen charakteristischen Gene, einschließlich derjenigen, die Enzyme kodieren, die an der Isoprenoid-Biosynthese im Mevalonat-Weg beteiligt sind. Beachten Sie, dass es in der untersuchten Raubtiergruppe kein transkriptionsregulierendes Gen gntR gibt, in ASxL5T jedoch drei gntR-ähnliche Gene identifiziert werden können.
Die phänotypischen Merkmale von ASxL5T sind in Tabelle 3 zusammengefasst und mit den phänotypischen Merkmalen der verwandten Gattungen 23, 24, 25, 26 und 27 verglichen, über die in der Literatur berichtet wird. Isolate aus T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis und Oceanobacter kriegii sind aktive, salztolerante, Oxidase-positive stäbchenförmige Körper, weisen aber mit ASxL5T fast keine anderen phänotypischen Merkmale auf. Der durchschnittliche pH-Wert des Ozeans beträgt 8,1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/inenchants/ocean-acidification#section_77), was sich in T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis und O widerspiegelt. kriegii. ASxL5T ist für den größeren pH-Bereich (4–9) geeignet, der für nichtmarinische Arten typisch ist. Phänotypische Merkmale von Thalassolitus sp. C2-1. Unbekannt. Der Wachstumstemperaturbereich von ASxL5T ist im Allgemeinen breiter als der von Meeresstämmen (4–42 °C), obwohl einige, aber nicht alle T. marinus-Isolate hitzetolerant sind. Die Unfähigkeit, ASxL5T in Bouillonmedien zu züchten, verhinderte eine weitere phänotypische Charakterisierung. Verwenden Sie API 20E, um die von der BA-Platte abgekratzten Materialien, ONPG, Arginin-Dihydrolase, Lysin-Decarboxylase, Ornithin-Decarboxylase, Citrat-Verwertung, Urease, Tryptophan-Deaminase, Gelatine-Hydrolyse-Enzym zu testen. Die Testergebnisse waren alle negativ, aber kein Indol, Acetoin und H2S wurden produziert. Zu den unfermentierten Kohlenhydraten gehören: Glucose, Mannose, Inositol, Sorbitol, Rhamnose, Saccharose, Melibiose, Amygdalin und Arabinose. Im Vergleich zu den veröffentlichten verwandten Referenzstämmen ist das zelluläre Fettsäureprofil des ASxL5T-Stamms in Tabelle 4 dargestellt. Die wichtigsten zellulären Fettsäuren sind C16:1ω6c und/oder C16:1ω7c, C16:0 und C18:1ω9. Es gibt auch Hydroxyfettsäuren C12:0 3-OH und C10:0 3-OH. Das Verhältnis von C16:0 in ASxL5T ist höher als der gemeldete Wert verwandter Gattungen. Im Gegensatz dazu ist im Vergleich zum gemeldeten T. marinus IMCC1826TT das Verhältnis von C18:1ω7c und/oder C18:1ω6c in ASxL5T verringert. Oleivorans MIL-1T und O. kriegii DSM 6294T, jedoch nicht in B. sanyensis KCTC 32220T nachgewiesen. Der Vergleich der Fettsäureprofile von ASxL5T und ASxLS ergab subtile Unterschiede in der Menge der einzelnen Fettsäuren zwischen den beiden Stämmen, die mit der genomischen DNA-Sequenz derselben Art übereinstimmen. Mit dem Sudanschwarz-Test wurden keine Poly-3-hydroxybutyrat (PHB)-Partikel nachgewiesen.
Die Raubaktivität von ASxL5T-Bakterien wurde untersucht, um die Reichweite der Beute zu bestimmen. Dieses Bakterium kann Plaques auf Campylobacter-Arten bilden, darunter: Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T; Escherichia coli NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; Clari NCTC 11458 und C. upsaliensis NCTC 11541T. Verwenden Sie die im Abschnitt zur Bestimmung des Wirtsbereichs der Methode aufgeführten Kulturen, um ein breiteres Spektrum gramnegativer und grampositiver Bakterien zu testen. Die Ergebnisse zeigen, dass ASxL5T auch in Escherichia coli NCTC 86 und Citrobacter freundii NCTC 9750T eingesetzt werden kann. Auf Klebsiella oxytoca 11466 bildeten sich Plaques. Die TEM-Interaktion mit E. coli NCTC 86 ist in Abbildung 4A-D dargestellt, und die Interaktion mit Campylobacter jejuni PT14 und Campylobacter suis S12 ist in Abbildung 4E-H Mitte dargestellt. Der Angriffsmechanismus scheint zwischen den getesteten Beutetypen unterschiedlich zu sein, wobei eine oder mehrere E. coli-Zellen an jede ASxL5T-Zelle gebunden und vor der Adsorption seitlich entlang der erweiterten Zelle positioniert werden. Im Gegensatz dazu scheint sich ASxL5T über einen einzigen Kontaktpunkt an Campylobacter zu binden, normalerweise in Kontakt mit der Spitze der Raubtierzelle und in der Nähe der Spitze der Campylobacter-Zelle (Abbildung 4H).
TEM, das die Interaktion zwischen ASx5LT und Beute zeigt: (AD) und E. coli-Beute; (EH) und C. jejuni Beute. (A) Eine typische ASx5LT-Zelle, verbunden mit einer einzelnen E. coli (EC)-Zelle; (B) Ein filamentöser ASx5LT, der an eine einzelne EC-Zelle gebunden ist; (C) Eine filamentöse ASx5LT-Zelle, die mit mehreren EC-Zellen verbunden ist; (D) Anbringung kleinerer ASx5LT-Zellen an einer einzelnen E. coli (EC)-Zelle; (E) eine einzelne ASx5LT-Zelle, verbunden mit einer Campylobacter jejuni (CJ)-Zelle; (F) ASx5LT greift C. hyointestinalis (CH)-Zellen an; (G) zwei Eine ASx5LT-Zelle griff eine CJ-Zelle an; (H) Eine Nahaufnahme des ASx5LT-Befestigungspunkts nahe der Spitze der CJ-Zelle (Balken 0,2 μm). Der Balken repräsentiert 1 μm in (A–G).
Räuberische Bakterien haben sich entwickelt, um die reichlich vorhandenen Beutequellen auszunutzen. Offensichtlich sind sie in vielen verschiedenen Umgebungen weit verbreitet. Aufgrund der geringen Größe der Populationsmitglieder ist es möglich, ASxL5T-Bakterien mithilfe der Phagentrennungsmethode aus der Aufschlämmung zu isolieren. Die genomische Relevanz von ASxL5T für Mitglieder der Familie der Meeresbakterien der Oceanospirillaceae ist überraschend, obwohl der Organismus salztolerant ist und auf einem Medium mit 5 % Salz wachsen kann. Die Analyse der Wasserqualität der Gülle ergab, dass der Natriumchloridgehalt weniger als 0,1 % betrug. Daher ist Schlamm sowohl geografisch als auch chemisch weit von der Meeresumwelt entfernt. Das Vorhandensein von drei verwandten, aber unterschiedlichen Isolaten aus derselben Quelle liefert den Beweis dafür, dass diese Raubtiere in dieser nicht-marinen Umgebung gedeihen. Darüber hinaus zeigte die Mikrobiomanalyse (Datendateien verfügbar unter https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990), dass sich dieselbe 16S-rRNA-Gensequenz in den 50 am häufigsten vorkommenden operativen Taxa (OTU) befindet ) In einigen Probenahmeintervallen des Schlamms. In der Genbank-Datenbank wurden mehrere unkultivierte Bakterien gefunden, die 16S-rRNA-Gensequenzen ähnlich den ASxL5T-Bakterien aufweisen. Diese Sequenzen scheinen zusammen mit den Sequenzen von ASxL5T, ASxS5 und ASxO5 verschiedene von Thalassolitus und Oceanobacter getrennte Kladen darzustellen (Abbildung 2). Drei Arten unkultivierter Bakterien (GQ921362, GQ921357 und GQ921396) wurden 2009 aus dem Spaltwasser in einer Tiefe von 1,3 Kilometern in der südafrikanischen Goldmine isoliert, die anderen beiden (DQ256320 und DQ337006) stammten aus dem Grundwasser (ebenfalls in Südafrika). im Jahr 2005). Die 16S-rRNA-Gensequenz, die am engsten mit ASxL5T verwandt ist, ist Teil der 16S-rRNA-Gensequenz, die aus der Anreicherungskultur von Sandsedimenten stammt, die 2006 an den Stränden Nordfrankreichs gewonnen wurden (Zugangsnummer AM29240828). Eine weitere eng verwandte 16S-rRNA-Gensequenz des unkultivierten Bakteriums HQ183822.1 wurde aus einem Sammeltank gewonnen, der auf einer städtischen Mülldeponie in China ausgelaugt wurde. Offensichtlich sind ASxL5T-Bakterien in taxonomischen Datenbanken nicht sehr repräsentativ, aber diese Sequenzen von nicht kultivierten Bakterien repräsentieren wahrscheinlich ASxL5T-ähnliche Organismen, die auf der ganzen Welt verbreitet sind, normalerweise in schwierigen Umgebungen. Aus der phylogenetischen Analyse des gesamten Genoms geht hervor, dass Thalassolitus sp. der nächste Verwandte von ASxL5T ist. C2-1, T. marinus, T. oleivorans. Und O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus ist ein Mitglied der marinen obligaten Kohlenwasserstofffragmentierungsbakterien (OHCB), die in Meeres- und Landumgebungen weit verbreitet sind und nach Vorfällen mit Kohlenwasserstoffverschmutzung normalerweise die dominierende Bakterienart werden30,31. Meeresbakterien gehören nicht zur OHCB-Gruppe, sondern kommen isoliert aus der Meeresumwelt vor.
Phänotypische Daten deuten darauf hin, dass ASxL5T eine neue Art und ein Mitglied einer bisher nicht erkannten Gattung in der Familie der marinen Spirospiraceae ist. Derzeit gibt es keinen klaren Standard, um neu isolierte Stämme einer neuen Gattung zuzuordnen. Es wurden Versuche unternommen, universelle Gattungsgrenzen zu bestimmen, beispielsweise basierend auf dem Prozentsatz des Genoms eines konservativen Proteins (POCP). Es wird empfohlen, dass der Grenzwert zu 50 % mit dem Referenzstamm identisch ist33. Andere schlagen die Verwendung von AAI-Werten vor, die gegenüber POCP Vorteile haben, da sie aus unvollständigen Genomen gewonnen werden können34. Der Autor geht davon aus, dass, wenn der AAI-Wert im Vergleich zum Modellstamm der Modellart weniger als 74 % beträgt, der Stamm ein Vertreter einer anderen Gattung ist. Die Modellgattung der marinen Spirillaceae ist Marine Spirillum und der Modellstamm ist O. linum ATCC 11336T. Der AAI-Wert zwischen ASxL5T und O. linum ATCC 11336T beträgt 54,34 %, und der AAI-Wert zwischen ASxL5T und T. oleivorans MIL-1T (Genus-Typ-Stämme) beträgt 67,61 %, was darauf hinweist, dass ASxL5T eine neue Gattung darstellt, die sich von Thalassolitus unterscheidet. Unter Verwendung der 16S-rRNA-Gensequenz als Klassifizierungsstandard beträgt die vorgeschlagene Gattungsabgrenzungsgrenze 94,5 %35. ASxL5T kann in die Gattung Thalassolitus eingeordnet werden und weist eine 16S-rRNA-Sequenzidentität von 95,03 % mit T. oleivorans MIL-1T und 96,17 % auf. marinus IMCC1826T. Es wird jedoch auch in die Gattung Bacteroides eingeordnet, die 94,64 % der 16S-rRNA-Genidentität mit B. sanyensis NV9 aufweist, was darauf hinweist, dass die Verwendung eines einzelnen Gens wie des 16S-rRNA-Gens zu einer willkürlichen Klassifizierung und Zuordnung führen kann. Eine weitere vorgeschlagene Methode verwendet ANI und Genome Alignment Score (AF), um die Häufung von Datenpunkten aller Typen und Nicht-Typ-Stämme bestehender Gattungen zu untersuchen. Der Autor empfiehlt, die Gattungsgrenze mit dem Wendepunkt der geschätzten Gattung zu kombinieren, die für die zu analysierenden Taxa spezifisch ist. Wenn jedoch nicht genügend vollständige Genomsequenzen von Thalassolituus-Isolaten vorliegen, ist es mit dieser Methode nicht möglich zu bestimmen, ob ASxL5T zur Gattung Thalassolituus gehört. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit vollständiger Genomsequenzen für die Analyse sollte der gesamte phylogenetische Genombaum mit Vorsicht interpretiert werden. Zweitens können Methoden zum Vergleich des gesamten Genoms keine wesentlichen Unterschiede in der Größe der verglichenen Genome berücksichtigen. Sie maßen die Ähnlichkeit konservierter Einzelkopie-Kerngene zwischen verwandten Gattungen, berücksichtigten jedoch nicht die große Anzahl von Genen, die im viel kleineren Genom von ASxL5T nicht vorhanden sind. Offensichtlich haben ASxL5T und Gruppen wie Thalassolitus, Oceanobacter und Bacterioplanes einen gemeinsamen Vorfahren, aber die Evolution hat einen anderen Weg eingeschlagen, der zu einer Verkleinerung des Genoms geführt hat, was möglicherweise auf die Anpassung an einen räuberischen Lebensstil zurückzuführen ist. Dies steht im Gegensatz zu T. oleivorans MIL-1T, das 28 % größer ist und sich unter unterschiedlichen Umweltbelastungen entwickelt hat, um Kohlenwasserstoffe zu nutzen23,30. Ein interessanter Vergleich kann mit obligat intrazellulären Parasiten und Symbionten wie Rickettsien, Chlamydien und Buchnera durchgeführt werden. Ihre Genomgröße beträgt etwa 1 MB. Die Fähigkeit, Metaboliten der Wirtszelle zu nutzen, führt zum Verlust von Genen und erfuhr daher einen erheblichen evolutionären genomischen Abbau. Evolutionäre Veränderungen von marinen chemischen Nährstofforganismen hin zu räuberischen Lebensstilen können zu einer ähnlichen Verringerung der Genomgröße führen. Die COG- und KEGG-Analyse verdeutlicht die Anzahl der Gene, die für bestimmte Funktionen verwendet werden, und die globalen Unterschiede in den genomischen Signalwegen zwischen ASxL5T und T. oleivorans MIL-1T, die nicht auf die weit verbreitete Verfügbarkeit mobiler genetischer Elemente zurückzuführen sind. Der Unterschied im G + C-Verhältnis des gesamten Genoms von ASxL5T beträgt 56,1 %, der von T. oleivorans MIL-1T beträgt 46,6 %, was ebenfalls darauf hinweist, dass es segregiert ist.
Die Untersuchung des kodierenden Inhalts des ASxL5T-Genoms liefert funktionelle Einblicke in phänotypische Merkmale. Das Vorhandensein von Genen, die für Typ-IV-Fimbrien (Tfp) kodieren, ist von besonderem Interesse, da sie die Zellbewegung, soziales Gleiten oder Krämpfe genannt, ohne Geißeln auf der Oberfläche fördern. Berichten zufolge hat Tfp weitere Funktionen, darunter Prädation, Pathogenese, Biofilmbildung, natürliche DNA-Aufnahme, automatische Zellaggregation und -entwicklung38. Das ASxL5T-Genom enthält 18 Gene, die für Diguanylatcyclase kodieren (ein Enzym, das die Umwandlung von 2-Guanosintriphosphat in Guanosin-2-phosphat und zyklisches diGMP katalysiert) und 6 Gene, die für das entsprechende Diguanylatcyclase-Phosphatdiguanylat kodieren. Das Gen für Esterase (das den Abbau von zyklischem Di-GMP zu Guanosinmonophosphat katalysiert) ist interessant, weil zyklisches Di-GMP ein wichtiger sekundärer Botenstoff ist, der an der Entwicklung und Trennung, Bewegung, Zellanheftung und Virulenz von Biofilmen beteiligt ist 39, 40. Es sollte auch beachtet werden, dass bei Bdellovibrio bacteriovorus gezeigt wurde, dass zyklisches Doppel-GMP den Übergang zwischen freiem Leben und räuberischem Lebensstil kontrolliert41.
Die meisten Forschungen zu räuberischen Bakterien konzentrierten sich auf Bdellovibrio, Bdellovibrio-ähnliche Organismen und Myxococcus-Arten. Diese und andere bekannte Beispiele räuberischer Bakterien bilden eine vielfältige Gruppe. Trotz dieser Vielfalt wurde eine Reihe charakteristischer Proteinfamilien identifiziert, die die Phänotypen von 11 bekannten Raubbakterien widerspiegeln3,22. Es wurden jedoch nur Gene identifiziert, die für die O-Antigen-Ligase (waaL) kodieren, was besonders häufig bei gramnegativen Bakterien vorkommt. Diese Form der Analyse ist nicht hilfreich, um ASxL5T als Raubtier einzustufen, wahrscheinlich weil es eine neuartige Angriffsstrategie verwendet. Die Verfügbarkeit vielfältigerer räuberischer Bakteriengenome wird dazu beitragen, Analysen mit genauerer Auflösung zu entwickeln, die Hinweise auf funktionelle und umweltbedingte Unterschiede zwischen Gruppenmitgliedern berücksichtigen. Beispiele für räuberische Bakterien, die in dieser Analyse nicht berücksichtigt wurden, sind Mitglieder von Cupriavidus necator42 und Bradymonabacteria43, da bei der Untersuchung verschiedener mikrobieller Gemeinschaften durch Forscher immer mehr räuberische Taxa etabliert werden.
Das bemerkenswerteste Merkmal der im TEM-Bild erfassten ASxL5T-Bakterien ist ihre einzigartige und flexible Morphologie, die die Interaktion mit Beutebakterien fördern kann. Die Art der beobachteten Interaktion unterscheidet sich von der anderer räuberischer Bakterien und wurde bisher weder entdeckt noch berichtet. Der vorgeschlagene räuberische Lebenszyklus von ASxL5T ist in Abbildung 5 dargestellt. In der Literatur gibt es nur wenige Beispiele mit ähnlichen apikalen Strukturen wie hier, aber zu diesen Beispielen gehören Terasakiispira papahanaumokuakeensis, ein marines Spirillum-Bakterium mit gelegentlicher Apexvergrößerung 44, und Alphaproteobakterien, Terasakiella pusilla , früher zur Gattung Oceanospirillum gehörend, zeigt den sogenannten „Polarfilm“ 45. Kokkenformen werden häufig in älteren Kulturen beobachtet, insbesondere bei Bakterien mit gebogenen Formen, wie Vibrio, Campylobacter und Helicobacter 46, 47, 48, die einen degradierten Zustand darstellen können. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um den genauen Lebenszyklus von ASxL5T-Bakterien zu klären. Um zu bestimmen, wie es fängt und jagt und ob sein Genom biologisch aktive Verbindungen kodiert, die für medizinische oder biotechnologische Zwecke verwendet werden können.
Beschreibung von Venatorbacter gen. November Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. setzt sich zusammen aus venators von L. n. venator, „Jäger“ und Gr. n. bacter, „eine Rute“. Venatorbacter, „eine Jagdrute“ . Zellen sind aerob, salztolerant, die Katalase- und Oxidase-Aktivität ist im Temperaturbereich von 4 bis 42 °C nicht positiv Eingewachsen. Der pH-Bereich von 4–9 ist bei Meeresschnecken ungewöhnlich. Die Hauptfettsäuren sind C16:1ω7c, C16:0 und C12:0 3 -OH und C10:0 3-OH kommen als Hydroxyfettsäuren vor. Sie wachsen nicht in Nährmedien. Der DNA-G + C-Gehalt beträgt 56,1 Mol-%. Mitglieder dieser Gattung zeigen eine Resistenz gegen Campylobacter. Und das Raubtierverhalten von Mitgliedern der Familie Enterobacteriaceae.
Beschreibung von Venatorbacter cucullus sp. November Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus bedeutet Verkleidung).
Darüber hinaus besteht das beschreibende Merkmal dieser Gattung darin, dass die Zellen bei Wachstum auf BA oder BHI 1,63 µm lang und 0,37 µm breit sind. Die Kolonien auf BHI-Agar sind sehr klein und erreichen nach 72 Stunden einen Durchmesser von 2 mm. Sie sind beige, durchscheinend, rund, konvex und glänzend. Die Vertreter dieser Art können Escherichia coli und Klebsiella nutzen. Als Beute dienen Campylobacter und mehrere andere gramnegative Bakterien.
Der typische Stamm ASxL5T wurde aus Rindermilch in Nottinghamshire, Großbritannien, isoliert und in der National Type Culture Collection (UK) hinterlegt: Hinterlegungsnummer NCTC 14397 und der Netherlands Bacterial Culture Collection (NCCB), Hinterlegungsnummer NCCB 100775. Die vollständige Genomsequenz von ASxL5T wurde gemäß der Ergänzung CP046056 in der Genbank hinterlegt.
ASxL5T-Bakterien wurden mithilfe der Phagenisolationstechnologie aus Rindermilch isoliert9,49. Die Aufschlämmung wurde 1:9 (Gew./Vol.) in SM-Puffer (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,1 M NaCl, 8 mM MgSO4.7H2O und 0,01 % Gelatine; Sigma Aldrich, Gillingham, UK) verdünnt und dann inkubiert 24 Stunden bei 4 °C unter langsamer Rotation, um die Raubtiere in den Puffer zu eluieren. Die Suspension wurde 3 Minuten lang bei 3000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und ein zweites Mal 5 Minuten lang bei 13.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde dann durch einen 0,45-µm-Membranfilter (Minisart; Sartorius, Göttingen, Deutschland) und einen 0,2-µm-Membranfilter (Minisart) geleitet, um alle verbleibenden Bakterienzellen zu entfernen. ASxL5T kann diese Filter passieren. Ein weicher Agarrasen von Campylobacter enterosus S12 (NCBI-Zugangsnummer CP040464) aus derselben Aufschlämmung wurde unter Verwendung von Standardtechniken hergestellt. Die gefilterte Aufschlämmung wurde auf jeder dieser Wirtszellplatten in 10-µl-Tröpfchen in dreifacher Ausfertigung verteilt und trocknen gelassen. Die Platte wurde in einem mikroaerophilen Tank bei 37 °C 48 Stunden lang unter mikroaeroben Bedingungen (5 % O2, 5 % H2, 10 % CO2 und 80 % N2) inkubiert. Der erhaltene sichtbare Plaque wurde in SM-Puffer extrahiert und auf den frischen Rasen von C. hyointestinalis S12 übertragen, um die lysierten Organismen weiter zu vermehren. Sobald festgestellt wird, dass die Bakterien die Ursache für die lytische Plaque und nicht der Phagen sind, versuchen Sie, den Organismus unabhängig vom Wirt zu züchten und ihn weiter zu charakterisieren. Die aerobe Kultur wurde bei 37 °C mit 5 % v/v defibriniertem Pferdeblut (TCS Biosciences Lt, Buckingham, UK, Ergänzung) durchgeführt. Gemäß den Richtlinien des National Clinical Standards Committee wird die Scheibendiffusionsmethode zum Testen der antibakteriellen Empfindlichkeit verwendet. BHI-Agar wurde bei 37 °C unter Verwendung einer Scheibe kultiviert, die die folgenden Antibiotika (Oxoid) für die aerobe Kultur enthielt: Amoxicillin und Clavulansäure 30 µg; Cefotaxim 30 µg; Streptomycin 10 µg; Ciprofloxacin 5 µg; Ceftazidim 30 µg Nalidixinsäure 30 µg; Imipenem 10 µg; Azithromycin 15 µg; Chloramphenicol 30 µg; Cefoxitin 30 µg; Tetracyclin 30 µg; Nitrofurantoin 300 µg; Aztreonam 30 µg; Ampicillin 10 µg; Cefpodoxim 10 µg; Trimethoprim-Sulfamethoxazol 25 µg. Die Salztoleranz wurde durch aerobe Inkubation auf BHI-Agarplatten bei 37 °C ermittelt. Den BHI-Agarplatten wurde zusätzliches NaCl zugesetzt, um einen Konzentrationsbereich von bis zu 10 % w/v bereitzustellen. Der pH-Bereich wird durch aerobe Kultur auf BHI-Agarplatten bei 37 °C bestimmt, wobei der pH-Bereich mit steriler HCl oder steriler NaOH auf 4 bis 9 eingestellt wurde und der angestrebte pH-Wert vor dem Ausgießen der Platte überprüft wird. Für die zelluläre Fettsäureanalyse wurde ASxL5T 3 Tage lang auf BHI-Agar und aerob bei 37 °C kultiviert. Gemäß dem MIDI-Standardprotokoll (Sherlock Microbial Identification System, Version 6.10) von FERA Science Ltd (York, UK) wurden Zellfettsäuren extrahiert, vorbereitet und analysiert.
Für TEM wurde ASxL5T aerob kultiviert, indem es 24 Stunden lang gleichmäßig auf BA bei 37 °C verteilt wurde, und dann in 1 ml 3 % (v/v) Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer bei Raumtemperatur geerntet, 1 Stunde lang fixiert und dann zentrifugiert bei 10.000 g für 3 Minuten. Anschließend das Pellet vorsichtig in 600 μl 0,1 M Cacodylatpuffer resuspendieren. Übertragen Sie die feste ASxL5T-Suspension auf die Formvar/Carbon-Folie auf einem 200-Mesh-Kupfergitter. Die Bakterien wurden 1 Minute lang mit 0,5 % (Gew./Vol.) Uranylacetat angefärbt und mittels TEM unter Verwendung eines TEI Tecnai G2 12 Biotwin-Mikroskops untersucht. Kombinieren Sie, wie oben erwähnt, die gleiche Anzahl an Beute- und Raubtieren in NZCYM-Brühe (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) und inkubieren Sie sie 48 Stunden lang unter mikroaeroben Bedingungen von Campylobacter oder Campylobacter bei 37 °C. Die Interaktion von Raubtier und Beute wurde auch TEM untersucht. Aerobe Bedingungen für Escherichia coli. Untersuchen Sie Beutetiere und räuberische Bakterien unabhängig voneinander, um etwaige Veränderungen der Zellmorphologie aufgrund von Raubtieren festzustellen. Für die optische Mikroskopie der PHB-Anreicherung wurde die Sudanschwarz-Methode verwendet.
Züchten Sie ASxL5T-Übernachtkulturen, indem Sie das Wachstum auf BHI- oder BA-Platten mit einem sterilen Tupfer verschmieren. Sammeln Sie ASxL5T-Zellen, suspendieren Sie sie in MRD (CM0733, Oxoid) und stellen Sie sie dann 7 Tage lang bei 4 °C, um die Zellen auszuhungern. Die NCTC-Referenz- oder Laborstamm-Bakterienkultur wurde in BHI-Brühe oder Nr. 2-Nährbrühe (CM007, Oxoid) inokuliert, über Nacht inkubiert, bei 13.000 g zentrifugiert und in MRD resuspendiert, bis die OD600 0,4 betrug. Kultur: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, Klebsiella oxytoca 11466, Leuconostoc NCTC 10817, Listeria Spezialbakterien NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, Rhodococcus submarine hamburger NCTC 1621T, Salmonella-Darmbakterien Mondeville NCTC 5747, Schleim NCTC 10861, Staphylococcus aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. Der Campylobacter-Wirt wurde mikroaerob auf BA-Platten bei 37 °C inkubiert und in NZCYM-Brühe suspendiert. Die getesteten Campylobacter-Wirte sind: C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11458, C. lari NCTC 11458, C. jejuni PT14 , C... Zellen sammeln in MRD bei 13.000 g zentrifugieren und in MRD resuspendieren, bis OD600 0,4 beträgt. Ein Aliquot von 0,5 ml Suspension zu 5 ml geschmolzenem NZCYM-Oberagar (0,6 % Agar) hinzufügen und auf eine 1,2 % NZCYM-Bodenplatte gießen. Nach dem Aushärten und Trocknen wurde das seriell verdünnte ASxL5T als 20-µl-Tröpfchen in dreifacher Ausfertigung auf jedes Rasenbrett verteilt. Kulturtemperatur und Atmosphäre richten sich nach den Anforderungen der Testbakterien.
Verwenden Sie das GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma Aldridge), um DNA aus Bakterienisolaten vorzubereiten. Zur PCR-Amplifikation des 16S-rRNA-Gens und zur Bestimmung der Produktsequenz wurden Standardmethoden unter Verwendung der Farbstoffterminationschemie (Eurofins Value Read Service, Deutschland) verwendet. Verwenden Sie das BLAST-N-Programm, um diese Sequenzen mit anderen 16S-rRNA-Gensequenzen zu vergleichen und eng verwandte Arten zu identifizieren und zu sammeln. Diese werden mit ClustalW im MEGA X-Programm ausgerichtet. Der Stammbaum wurde mit MEGA X unter Verwendung der Maximum-Likelihood-Methode basierend auf dem Tamura-Nei-Modell mit 1000 geführten Kopien rekonstruiert54. Verwenden Sie das PureLink™ Genomic DNA Kit (Fisher Scientific, Loughborough, UK), um DNA für die Sequenzierung des gesamten Genoms zu extrahieren. Die Genomsequenz von ASxL5T wurde mithilfe der Illumina MiSeq-Kombination bestimmt, die aus doppelendigen 250-bp-Reads besteht, die aus einer mit dem Nextera-Markierungskit erstellten Bibliothek und 2 bis 20 kb langen Reads von der PacBio-Plattform bestehen. Genomics DNA Sequencing Research Facility an der Sembia University. Das Genom wurde mit CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen, Aarhus, Dänemark) zusammengestellt. ASxL5T-Kulturen sind in der National Type Culture Collection (UK) und der Netherlands Bacterial Culture Collection (NCCB) hinterlegt. Die zum Vergleich verwendeten Genome verwandter Organismen sind: Thalassolituus oleivorans MIL-1T (Zugangsnummer HF680312, vollständig); Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (Zugangsnummer BMYY01000001, unvollständig); Oceanobacter kriegii DSM 6294T (Zugangsnummer NZ_AUGV00000000, unvollständig); Marinamonas-Gemeinschaft DSM 5604T (hinzugefügt ASM436330v1, unvollständig), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (hinzugefügt MTSD02000001, unvollständig) und Thalassolituus sp. C2-1 (NZ_VNIL01000001 hinzufügen, unvollständig). Verwenden Sie JGI Genome Portal36 unter https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page=, um den Alignment-Score (AF) und die durchschnittliche Nukleinsäureidentität (ANI) zu bestimmen. Paarweise. Zur Bestimmung der Aminosäureidentität (AAI) wurde die Methode von Rodriguez-R & Konstantinidis55 verwendet. Verwenden Sie GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18, um einen geschätzten phylogenetischen Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit zu generieren. Das Eingabegenom, das das verfügbare Referenzgenom darstellt, wird aus Referenzgattungen ausgewählt, die als mit ASxL5T aus der 16S-rRNA-Phylogenie verwandt identifiziert wurden. Kommentierte den Baum mit dem interaktiven Online-Tool „Tree of Life“ (https://itol.embl.de/). Die funktionale Annotation und Analyse des ASxL5T-Genoms erfolgt mit dem Online-Tool BlastKOALA KEGG unter Verwendung der Modulanreicherungsverteilung KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Die Verteilung der COG-Kategorien (orthologe Gruppen) wird mit dem Online-Tool eggNOG-Mapper ermittelt.
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