Ένας νέος τύπος Gram-αρνητικού, αερόβιου, ανθεκτικού στο άλας, ενεργού, σε σχήμα ράβδου και αρπακτικών βακτηρίων ASxL5T απομονώθηκε από μια λίμνη κοπριάς αγελάδων στο Nottinghamshire της Αγγλίας και χρησιμοποίησε το Campylobacter ως θήραμά του. Στη συνέχεια, άλλα είδη Campylobacter και μέλη της οικογένειας Enterobacteriaceae ανακαλύφθηκαν ως θήραμα. Μετά την υποκαλλιέργεια χωρίς κύτταρα-ξενιστές, επετεύχθη ασθενής άσηπτη ανάπτυξη σε Brain Heart Infusion Agar. Οι βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης είναι 37 °C και το pH είναι 7. Η ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης αποκάλυψε μερικά πολύ ασυνήθιστα μορφολογικά χαρακτηριστικά που σχετίζονται με τη διαθεσιμότητα του θηράματος. Η φυλογενετική ανάλυση χρησιμοποιώντας την αλληλουχία γονιδίου 16S rRNA έδειξε ότι το προϊόν απομόνωσης σχετίζεται με ένα μέλος της οικογένειας Marine Spirulina, αλλά δεν μπορεί να ταξινομηθεί σαφώς ως μέλος οποιουδήποτε γνωστού γένους. Η αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος του ASxL5T επιβεβαίωσε τη σχέση με μέλη των θαλάσσιων σπειροχαιτών. Μια αναζήτηση στη βάση δεδομένων αποκάλυψε ότι πολλά ASxL5T μοιράζονται αλληλουχίες γονιδίου 16S rRNA με αρκετά ακαλλιέργητα βακτήρια από τον ωκεανό, την επιφάνεια της γης και τα υπόγεια ύδατα. Προτείνουμε ότι το στέλεχος ASxL5T αντιπροσωπεύει ένα νέο είδος σε ένα νέο γένος. Συνιστούμε το όνομα Venatorbacter cucullus gen. Νοεμβρίου, sp. Τον Νοέμβριο, το ASxL5T χρησιμοποιήθηκε ως στέλεχος τύπου.
Τα αρπακτικά βακτήρια είναι βακτήρια που παρουσιάζουν την ικανότητα να κυνηγούν και να σκοτώνουν άλλα ζωντανά βακτήρια για να αποκτήσουν βιοσυνθετικά υλικά και ενέργεια. Αυτό είναι διαφορετικό από τη γενική ανάκτηση θρεπτικών ουσιών από νεκρούς μικροοργανισμούς και είναι επίσης διαφορετικό από τις παρασιτικές αλληλεπιδράσεις, στις οποίες τα βακτήρια σχηματίζουν στενή σχέση με τον ξενιστή τους χωρίς να τα σκοτώνουν. Τα αρπακτικά βακτήρια έχουν εξελίξει διαφορετικούς κύκλους ζωής για να επωφεληθούν από άφθονες πηγές τροφής στις κόγχες όπου βρίσκονται (όπως θαλάσσια ενδιαιτήματα). Αποτελούν μια ταξινομικά ποικιλόμορφη ομάδα, η οποία συνδέεται μόνο με τον μοναδικό κύκλο ζωής αποστείρωσης1. Παραδείγματα αρπακτικών βακτηρίων έχουν βρεθεί σε πολλές διαφορετικές φυλές, συμπεριλαμβανομένων των: Proteobacteria, Bacteroides και Chlorella.3. Ωστόσο, τα πιο καλά μελετημένα αρπακτικά βακτήρια είναι οι οργανισμοί Bdellovibrio και Bdellovibrio και παρόμοιοι (BALOs4). Τα αρπακτικά βακτήρια είναι μια πολλά υποσχόμενη πηγή νέων βιολογικά ενεργών ενώσεων και αντιβακτηριακών παραγόντων5.
Τα αρπακτικά βακτήρια πιστεύεται ότι ενισχύουν τη μικροβιακή ποικιλότητα και έχουν θετικό αντίκτυπο στην υγεία, την παραγωγικότητα και τη σταθερότητα του οικοσυστήματος6. Παρά αυτά τα θετικά χαρακτηριστικά, υπάρχουν λίγες μελέτες για νέα αρπακτικά βακτήρια λόγω της δυσκολίας καλλιέργειας βακτηρίων και της ανάγκης προσεκτικής παρακολούθησης των αλληλεπιδράσεων των κυττάρων για την κατανόηση των πολύπλοκων κύκλων ζωής τους. Αυτές οι πληροφορίες δεν είναι εύκολο να ληφθούν από ανάλυση υπολογιστή.
Σε μια εποχή αυξανόμενης μικροβιακής αντοχής, μελετώνται νέες στρατηγικές για τη στόχευση βακτηριακών παθογόνων, όπως η χρήση βακτηριοφάγων και αρπακτικών βακτηρίων7,8. Τα βακτήρια ASxL5T απομονώθηκαν το 2019 χρησιμοποιώντας τεχνολογία απομόνωσης φάγου από κοπριά αγελάδας που συλλέχθηκε από το Κέντρο Γάλακτος του Πανεπιστημίου του Nottingham, Nottinghamshire. Σκοπός της έρευνας είναι η απομόνωση οργανισμών με δυναμικό ως παράγοντες βιολογικού ελέγχου. Το Campylobacter hyointestinalis είναι ένα ζωονοσογόνο παθογόνο, το οποίο συνδέεται ολοένα και περισσότερο με ασθένειες του εντέρου του ανθρώπου10. Είναι πανταχού παρόν στον ορό και χρησιμοποιείται ως ξενιστής στόχος.
Το βακτήριο ASxL5T απομονώθηκε από ζελέ βοείου κρέατος επειδή παρατηρήθηκε ότι οι πλάκες που σχημάτιζε στο γρασίδι του C. hyointestinalis ήταν παρόμοιες με αυτές που παράγουν οι βακτηριοφάγοι. Αυτό είναι ένα απροσδόκητο εύρημα, επειδή μέρος της διαδικασίας απομόνωσης φάγου περιλαμβάνει διήθηση μέσω ενός φίλτρου 0,2 μm, το οποίο έχει σχεδιαστεί για την αφαίρεση βακτηριακών κυττάρων. Η μικροσκοπική εξέταση του υλικού που εξήχθη από την πλάκα αποκάλυψε ότι τα μικρά αρνητικά κατά Gram καμπυλωμένα σε σχήμα ράβδου βακτήρια δεν συσσώρευσαν πολυυδροξυβουτυρικό (PHB). Η άσηπτη καλλιέργεια ανεξάρτητη από τα κύτταρα του θηράματος πραγματοποιείται σε πλούσιο στερεό μέσο (όπως άγαρ έγχυσης εγκεφαλικής καρδιάς (BHI) και άγαρ αίματος (BA)) και η ανάπτυξή του είναι ασθενής. Λαμβάνεται μετά από υποκαλλιέργεια με βαρύ εμβόλιο βελτίωση. Αναπτύσσεται εξίσου καλά σε μικροαερόβιες (7% v/v οξυγόνο) και σε συνθήκες ατμοσφαιρικού οξυγόνου, αλλά όχι σε αναερόβια ατμόσφαιρα. Μετά από 72 ώρες, η διάμετρος της αποικίας ήταν πολύ μικρή, έφτανε τα 2 mm, και ήταν μπεζ, ημιδιαφανής, στρογγυλή, κυρτή και γυαλιστερή. Οι τυπικές βιοχημικές δοκιμές παρεμποδίζονται επειδή το ASxL5T δεν μπορεί να καλλιεργηθεί αξιόπιστα σε υγρά μέσα, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να βασίζεται στον περίπλοκο κύκλο ζωής του σχηματισμού βιοφίλμ. Ωστόσο, το εναιώρημα πλάκας έδειξε ότι το ASxL5T είναι αερόβιο, θετικό για οξειδάση και καταλάση και μπορεί να ανεχθεί 5% NaCl. Το ASxL5T είναι ανθεκτικό σε 10 μg στρεπτομυκίνης, αλλά είναι ευαίσθητο σε όλα τα άλλα αντιβιοτικά που έχουν δοκιμαστεί. Τα βακτηριακά κύτταρα ASxL5T εξετάστηκαν με ΤΕΜ (Εικόνα 1). Όταν αναπτύσσονται χωρίς κύτταρα θηράματος στο BA, τα κύτταρα ASxL5T είναι μικρά Campylobacter, με μέσο μήκος 1,63 μm (± 0,4), πλάτος 0,37 μm (± 0,08) και έναν μόνο μακρύ (έως 5 μm) πόλο. Σεξουαλικά μαστίγια. Περίπου το 1,6% των κυψελών φαίνεται να έχουν πλάτος μικρότερο από 0,2 μm, το οποίο θα επιτρέψει τη διέλευση από τη συσκευή φίλτρου. Παρατηρήθηκε μια ασυνήθιστη δομική επέκταση στην κορυφή ορισμένων κυψελών, παρόμοια με ένα φέρινγκ (λατινικό cucullus) (βλ. τα βέλη στα 1D, E, G). Αυτό φαίνεται να αποτελείται από περίσσεια εξωτερικής μεμβράνης, η οποία μπορεί να οφείλεται στη γρήγορη μείωση του μεγέθους του περιπλασμικού περιβλήματος, ενώ η εξωτερική μεμβράνη παραμένει ανέπαφη, εμφανίζοντας «χαλαρή» εμφάνιση. Η καλλιέργεια του ASxL5T απουσία θρεπτικών ουσιών (σε PBS) για μεγάλο χρονικό διάστημα στους 4°C είχε ως αποτέλεσμα τα περισσότερα (αλλά όχι όλα) κύτταρα να παρουσιάζουν μορφολογία κόκκου (Εικόνα 1C). Όταν το ASxL5T αναπτύσσεται με το Campylobacter jejuni ως θήραμα για 48 ώρες, το μέσο μέγεθος των κυττάρων είναι σημαντικά μεγαλύτερο και στενότερο από τα κύτταρα που αναπτύσσονται χωρίς ξενιστή (Πίνακας 1 και Εικόνα 1Ε). Αντίθετα, όταν το ASxL5T αναπτύσσεται με E. coli ως θήραμα για 48 ώρες, το μέσο μέγεθος κυττάρου είναι μεγαλύτερο και ευρύτερο από όταν αναπτύσσεται χωρίς θήραμα (Πίνακας 1) και το μήκος του κυττάρου είναι μεταβλητό, συνήθως εμφανίζοντας νηματοειδή (Εικόνα 1ΣΤ). Όταν επωάστηκαν με Campylobacter jejuni ή E. coli ως θήραμα για 48 ώρες, τα κύτταρα ASxL5T δεν έδειξαν καθόλου μαστίγια. Ο Πίνακας 1 συνοψίζει τις παρατηρήσεις των αλλαγών στο μέγεθος των κυττάρων με βάση την παρουσία, την απουσία και τον τύπο θηράματος του ASxL5T.
Οθόνη TEM του ASx5LT: (A) Το ASx5LT δείχνει μακρύ μαστίγιο. (Β) τυπική μπαταρία ASx5LT. (Γ) κύτταρα ASx5LT κόκκων μετά από μακρά επώαση χωρίς θρεπτικά συστατικά. (D) μια ομάδα κυττάρων ASx5LT εμφανίζει ανωμαλία (Ε) Η κυτταρική ομάδα ASx5LT που επωάστηκε με θήραμα Campylobacter έδειξε αυξημένο μήκος κυττάρου σε σύγκριση με εκείνες χωρίς ανάπτυξη θηράματος (D) έδειξε επίσης κορυφαία δομή. (ΣΤ) Μεγάλα νηματώδη μαστίγια, κύτταρα ASx5LT, μετά από επώαση με E. coli θήραμα. (Ζ) Ένα μόνο κύτταρο ASx5LT μετά από επώαση με E. coli, που δείχνει μια ασυνήθιστη κορυφαία δομή. Η ράβδος αντιπροσωπεύει 1 μm.
Ο προσδιορισμός της γονιδιακής αλληλουχίας 16S rRNA (αριθμός πρόσβασης MT636545.1) επιτρέπει στις αναζητήσεις στη βάση δεδομένων να δημιουργήσουν αλληλουχίες παρόμοιες με αυτές της κατηγορίας Gammaproteobacteria και είναι πλησιέστερα στα θαλάσσια βακτήρια της οικογένειας θαλάσσιων σπειρών (Εικόνα 2) και είναι μέλη του γένους Thalassolituus Ο πλησιέστερος συγγενής του Marine Bacillus. Η αλληλουχία γονιδίου 16S rRNA είναι σαφώς διαφορετική από τα αρπακτικά βακτήρια που ανήκουν στην οικογένεια Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria). Οι κατά ζεύγη συγκρίσεις του B. bacteriovorus HD100T (τύπου στέλεχος, DSM 50701) και του B. bacteriovorus DM11A ήταν 48,4% και 47,7%, και για το B. exovorus JSS ήταν 46,7%. Τα βακτήρια ASxL5T έχουν 3 αντίγραφα του γονιδίου 16S rRNA, δύο από τα οποία είναι πανομοιότυπα μεταξύ τους και το τρίτο απέχει 3 βάσεις μεταξύ τους. Δύο άλλα αρπακτικά βακτηριακά απομονωμένα στελέχη (ASx5S και ASx5O, οι αριθμοί προσχώρησης γονιδίου 16S rRNA είναι MT636546.1 και MT636547.1, αντίστοιχα) με παρόμοια μορφολογικά και φαινοτυπικά χαρακτηριστικά από την ίδια θέση δεν είναι τα ίδια, αλλά διαφέρουν από το ASxL5T και το μη καλλιεργημένο Οι ακολουθίες βάσης δεδομένων συγκεντρώνονται μαζί με άλλα γένη Oceanospirillaceae (Εικόνα 2). Ολόκληρη η αλληλουχία γονιδιώματος του ASxL5T έχει προσδιοριστεί και αποθηκευτεί στη βάση δεδομένων NCBI και ο αριθμός πρόσβασης είναι CP046056. Το γονιδίωμα του ASxL5T αποτελείται από ένα κυκλικό χρωμόσωμα 2.831.152 bp με αναλογία G + C 56,1%. Η αλληλουχία του γονιδιώματος περιέχει 2653 CDS (σύνολο), από τα οποία 2567 προβλέπεται να κωδικοποιούν πρωτεΐνες, εκ των οποίων οι 1596 μπορούν να αποδοθούν ως υποτιθέμενες συναρτήσεις (60,2%). Το γονιδίωμα περιέχει 67 γονίδια που κωδικοποιούν το RNA, συμπεριλαμβανομένων 9 rRNA (3 το καθένα για τα 5S, 16S και 23S) και 57 tRNA. Τα γονιδιωματικά χαρακτηριστικά του ASxL5T συγκρίθηκαν με τα διαθέσιμα γονιδιώματα στελεχών του πλησιέστερου σχετικού τύπου που ταυτοποιήθηκαν από την αλληλουχία γονιδίου 16S rRNA (Πίνακας 2). Χρησιμοποιήστε την ταυτότητα αμινοξέων (AAI) για να συγκρίνετε όλα τα διαθέσιμα γονιδιώματα Thalassolituus με το ASxL5T. Η πλησιέστερη διαθέσιμη (ημιτελής) αλληλουχία γονιδιώματος που προσδιορίζεται από το AAI είναι το Thalassolituus sp. C2-1 (προσθήκη NZ_VNIL01000001). Αυτό το στέλεχος απομονώθηκε από τα ιζήματα βαθέων υδάτων της τάφρου των Μαριανών, αλλά δεν υπάρχουν προς το παρόν φαινοτυπικές πληροφορίες για αυτό το στέλεχος για σύγκριση. Σε σύγκριση με τα 2,82 Mb του ASxL5T, το γονιδίωμα του οργανισμού είναι μεγαλύτερο στα 4,36 Mb. Το μέσο μέγεθος γονιδιώματος των θαλάσσιων σπειροχαιτών είναι περίπου 4,16 Mb (± 1,1, n = 92 πλήρη γονιδιώματα αναφοράς που διερευνήθηκαν από τη διεύθυνση https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), επομένως το γονιδίωμα του ASxL5T είναι σύμφωνο με το παραγγελία Σε σύγκριση με τα άλλα μέλη, είναι αρκετά μικρό. Χρησιμοποιήστε το GToTree 1.5.54 για να δημιουργήσετε ένα εκτιμώμενο φυλογενετικό δέντρο μέγιστης πιθανότητας με βάση το γονιδίωμα (Εικόνα 3Α), χρησιμοποιώντας τις ευθυγραμμισμένες και συνδεδεμένες αλληλουχίες αμινοξέων 172 γονιδίων ενός αντιγράφου ειδικά για τα γαμμαπρωτεοβακτήρια 11,12,13,14,15,16, 17,18. Η ανάλυση έδειξε ότι σχετίζεται στενά με το Thalassolituus, το Bacterial Plane και το Marine Bacterium. Ωστόσο, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το ASxL5T είναι διαφορετικό από τους συγγενείς του στη θαλάσσια σπιρουλίνα και τα δεδομένα της αλληλουχίας του γονιδιώματός του είναι διαθέσιμα.
Το φυλογενετικό δέντρο που χρησιμοποιεί την αλληλουχία γονιδίου 16S rRNA υπογραμμίζει τη θέση των στελεχών ASxL5T, ASxO5 και ASxS5 (με τα έντερα) σε σχέση με τα ακαλλιέργητα και θαλάσσια στελέχη βακτηρίων στα Marine Spirulinaceae. Ο αριθμός προσχώρησης της Genbank ακολουθεί το όνομα του στελέχους σε παρένθεση. Χρησιμοποιήστε το ClustalW για να ευθυγραμμίσετε τις ακολουθίες και χρησιμοποιήστε τη μέθοδο μέγιστης πιθανότητας και το μοντέλο Tamura-Nei για να συναγάγετε φυλογενετικές σχέσεις και εκτελέστε 1000 καθοδηγούμενες επαναλήψεις στο πρόγραμμα MEGA X. Ο αριθμός στον κλάδο υποδεικνύει ότι η τιμή καθοδηγούμενης αντιγραφής είναι μεγαλύτερη από 50%. Το Escherichia coli U/541T χρησιμοποιήθηκε ως εξωομάδα.
(Α) Ένα φυλογενετικό δέντρο με βάση το γονιδίωμα, που δείχνει τη σχέση μεταξύ του θαλάσσιου βακτηρίου Spirospiraceae ASxL5T και των στενών συγγενών του, E. coli U 5/41T ως εξωομάδα. (Β) Σε σύγκριση με το T. oleivorans MIL-1T, η κατανομή λειτουργικών κατηγοριών των γονιδίων προβλέπεται με βάση το σύμπλεγμα ορθολογικής ομάδας (COG) της πρωτεΐνης ASx5LT. Το σχήμα στα αριστερά δείχνει τον αριθμό των γονιδίων σε κάθε λειτουργική κατηγορία COG σε κάθε γονιδίωμα. Το γράφημα στα δεξιά δείχνει το ποσοστό των γονιδιωμάτων που περιέχονται σε κάθε λειτουργική ομάδα COG. (Γ) Σε σύγκριση με το T. oleiverans MIL-1T, η ανάλυση της πλήρους σπονδυλωτής οδού KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) του ASxL5T.
Η χρήση της βάσης δεδομένων KEGG για την εξέταση των συστατικών γονιδίων που υπάρχουν στο γονιδίωμα ASxL5T αποκάλυψε την τυπική μεταβολική οδό του αερόβιου γάμμα Proteus. Το ASxL5T περιέχει συνολικά 75 γονίδια που έχουν εκχωρηθεί σε βακτηριακές κινητικές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων γονιδίων που εμπλέκονται στη χημειοταξία, τη συναρμολόγηση μαστιγίων και το σύστημα κροσσών τύπου IV. Στην τελευταία κατηγορία, 9 στα 10 γονίδια είναι υπεύθυνα για την κίνηση συσπάσεων μιας σειράς άλλων οργανισμών. Το γονιδίωμα του ASxL5T περιέχει ένα πλήρες βιοσυνθετικό μονοπάτι τετραϋδροπυριμιδίνης που συμμετέχει στην προστατευτική απόκριση στο οσμωτικό στρες20, όπως αναμένεται για τα αλόφιλα. Το γονιδίωμα περιέχει επίσης πολλές πλήρεις οδούς για συμπαράγοντες και βιταμίνες, συμπεριλαμβανομένων των οδών σύνθεσης ριβοφλαβίνης. Αν και το γονίδιο της αλκανικής 1-μονοοξυγενάσης (alkB2) υπάρχει στο ASxL5T, η οδός χρήσης υδρογονανθράκων δεν είναι πλήρης. Στην αλληλουχία γονιδιώματος του ASxL5T, ομόλογα γονιδίων που προσδιορίζονται ως κυρίως υπεύθυνα για την αποικοδόμηση των υδρογονανθράκων στο T. oleiverans MIL-1T21, όπως το TOL_2658 (alkB) και το TOL_2772 (αφυδρογονάση αλκοόλης) είναι προφανώς απούσα. Το Σχήμα 3Β δείχνει τη σύγκριση της κατανομής γονιδίων στην κατηγορία COG μεταξύ ASxL5T και ελαιολάδου MIL-1T. Συνολικά, το μικρότερο γονιδίωμα ASxL5T περιέχει αναλογικά λιγότερα γονίδια από κάθε κατηγορία COG σε σύγκριση με το μεγαλύτερο σχετικό γονιδίωμα. Όταν ο αριθμός των γονιδίων σε κάθε λειτουργική κατηγορία εκφράζεται ως ποσοστό του γονιδιώματος, σημειώνονται διαφορές στο ποσοστό των γονιδίων στις κατηγορίες μετάφρασης, ριβοσωματικής δομής και βιογένεσης και στις κατηγορίες συνάρτησης παραγωγής και μετατροπής ενέργειας, που αποτελούν το μεγαλύτερο ASxL5T γονιδίωμα Το ποσοστό συγκρίνεται με την ίδια ομάδα που υπάρχει στο γονιδίωμα MIL-1T του T. oleiverans. Αντίθετα, σε σύγκριση με το γονιδίωμα ASxL5T, το T. oleivorans MIL-1T έχει υψηλότερο ποσοστό γονιδίων στις κατηγορίες αντιγραφής, ανασυνδυασμού και επιδιόρθωσης και μεταγραφής. Είναι ενδιαφέρον ότι η μεγαλύτερη διαφορά στο περιεχόμενο κάθε λειτουργικής κατηγορίας των δύο γονιδιωμάτων είναι ο αριθμός των άγνωστων γονιδίων που υπάρχουν στο ASxL5T (Εικόνα 3Β). Πραγματοποιήθηκε μια ανάλυση εμπλουτισμού των μονάδων KEGG, όπου κάθε ενότητα KEGG αντιπροσωπεύει ένα σύνολο λειτουργικών μονάδων καθορισμένων με το χέρι για σχολιασμό και βιολογική ερμηνεία δεδομένων αλληλουχίας γονιδιώματος. Η σύγκριση της κατανομής γονιδίων στο πλήρες μονοπάτι της μονάδας KOG του ASxL5T και του ελαιολάδου MIL-1T φαίνεται στο Σχήμα 3Γ. Αυτή η ανάλυση δείχνει ότι αν και το ASxL5T έχει πλήρη μεταβολική οδό θείου και αζώτου, το T. oleiverans MIL-1T δεν έχει. Αντίθετα, το T. oleiverans MIL-1T έχει πλήρη μεταβολική οδό κυστεΐνης και μεθειονίνης, αλλά είναι ατελής στο ASxL5T. Επομένως, το ASxL5T έχει μια χαρακτηριστική ενότητα για την αφομοίωση των θειικών (που ορίζεται ως ένα σύνολο γονιδίων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φαινοτυπικοί δείκτες, όπως η μεταβολική ικανότητα ή η παθογένεια· https://www.genome.jp/kegg/module.html) Στο T oleiverans MIL-1T. Η σύγκριση του γονιδιακού περιεχομένου του ASxL5T με τη λίστα των γονιδίων που υποδηλώνουν έναν αρπακτικό τρόπο ζωής είναι αδιευκρίνιστη. Αν και το γονίδιο waaL που κωδικοποιεί τη λιγάση που σχετίζεται με τον πολυσακχαρίτη του αντιγόνου Ο στον πυρήνα υπάρχει στο γονιδίωμα ASxL5T (αλλά είναι κοινό σε πολλά αρνητικά κατά Gram βακτήρια), τα γονίδια τρυπτοφάνης 2,3-διοξυγενάσης (TDO ) μπορεί να περιλαμβάνουν τα 60 αμινοξέα όξινες περιοχές που βρίσκονται συνήθως σε αρπακτικά βακτήρια που δεν υπάρχουν. Δεν υπάρχουν άλλα αρπακτικά χαρακτηριστικά γονίδια στο γονιδίωμα ASxL5T, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που κωδικοποιούν ένζυμα που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση ισοπρενοειδών στη μεβαλονική οδό. Σημειώστε ότι δεν υπάρχει μεταγραφικό ρυθμιστικό γονίδιο gntR στην ομάδα αρπακτικών που εξετάστηκε, αλλά τρία γονίδια που μοιάζουν με gntR μπορούν να αναγνωριστούν στο ASxL5T.
Τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά του ASxL5T συνοψίζονται στον Πίνακα 3 και συγκρίνονται με τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των σχετικών γενών 23, 24, 25, 26 και 27 που αναφέρονται στη βιβλιογραφία. Τα απομονωμένα στελέχη από T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis και Oceanobacter kriegii είναι δραστικά, ανθεκτικά σε άλατα, θετικά στην οξειδάση σώματα σε σχήμα ράβδου, αλλά δεν έχουν σχεδόν κανένα άλλο φαινοτυπικό χαρακτηριστικό με το ASxL5T. Το μέσο pH του ωκεανού είναι 8,1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77), το οποίο αντανακλάται στα T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis και O. kriegii. Το ASxL5T είναι κατάλληλο για το μεγαλύτερο εύρος pH (4-9) τυπικό των μη θαλάσσιων ειδών. Φαινοτυπικά χαρακτηριστικά του Thalassolituus sp. C2-1. Αγνωστος. Το εύρος θερμοκρασίας ανάπτυξης του ASxL5T είναι γενικά ευρύτερο από αυτό των θαλάσσιων στελεχών (4–42 °C), αν και ορισμένα αλλά όχι όλα τα προϊόντα απομόνωσης T. marinus είναι ανθεκτικά στη θερμότητα. Η αδυναμία ανάπτυξης του ASxL5T σε μέσα ζωμού εμπόδισε περαιτέρω φαινοτυπικό χαρακτηρισμό. Χρησιμοποιήστε το API 20E για να δοκιμάσετε τα υλικά που ξύστηκαν από την πλάκα BA, ONPG, διυδρολάση αργινίνης, αποκαρβοξυλάση λυσίνης, αποκαρβοξυλάση ορνιθίνης, χρήση κιτρικών, ουρεάση, απαμινάση τρυπτοφάνης, ένζυμο υδρόλυσης ζελατίνης, τα αποτελέσματα της δοκιμής ήταν όλα αρνητικά, αλλά όχι ινδόλη και H2Stoace, . παρήχθησαν. Οι μη ζυμωμένοι υδατάνθρακες περιλαμβάνουν: γλυκόζη, μαννόζη, ινοσιτόλη, σορβιτόλη, ραμνόζη, σακχαρόζη, μελιβιόζη, αμυγδαλίνη και αραβινόζη. Σε σύγκριση με τα δημοσιευμένα σχετικά στελέχη αναφοράς, το προφίλ κυτταρικού λιπαρού οξέος του στελέχους ASxL5T φαίνεται στον Πίνακα 4. Τα κύρια κυτταρικά λιπαρά οξέα είναι τα C16:1ω6c και/ή C16:1ω7c, C16:0 και C18:1ω9. Υπάρχουν επίσης υδροξυλιπαρά οξέα C12:0 3-OH και C10:0 3-OH. Η αναλογία C16:0 στο ASxL5T είναι υψηλότερη από την αναφερόμενη τιμή των σχετικών γενών. Αντίθετα, σε σύγκριση με το αναφερόμενο T. marinus IMCC1826TT, η αναλογία C18:1ω7c και/ή C18:1ω6c στο ASxL5T είναι μειωμένη. oleivorans MIL-1T και O. kriegii DSM 6294T, αλλά δεν ανιχνεύθηκαν στο B. sanyensis KCTC 32220T. Η σύγκριση των προφίλ λιπαρών οξέων των ASxL5T και ASxLS αποκάλυψε ανεπαίσθητες διαφορές στην ποσότητα των μεμονωμένων λιπαρών οξέων μεταξύ των δύο στελεχών, οι οποίες είναι σύμφωνες με τη γονιδιωματική αλληλουχία DNA του ίδιου είδους. Δεν ανιχνεύθηκαν σωματίδια πολυ-3-υδροξυβουτυρικού (PHB) χρησιμοποιώντας τη μαύρη δοκιμή του Σουδάν.
Η δραστηριότητα θήρευσης των βακτηρίων ASxL5T μελετήθηκε για να προσδιοριστεί το εύρος του θηράματος. Αυτό το βακτήριο μπορεί να σχηματίσει πλάκες σε είδη Campylobacter, συμπεριλαμβανομένων: Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T; Escherichia coli NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; C lari NCTC 11458 και C. upsaliensis NCTC 11541T. Χρησιμοποιήστε τις καλλιέργειες που αναφέρονται στην ενότητα προσδιορισμού εύρους ξενιστή της μεθόδου για να δοκιμάσετε ένα ευρύτερο φάσμα αρνητικών και θετικών κατά Gram βακτηρίων. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το ASxL5T μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί σε Escherichia coli NCTC 86 και Citrobacter freundii NCTC 9750T. Σχηματίστηκαν πλάκες στο Klebsiella oxytoca 11466. Η αλληλεπίδραση ΤΕΜ με το Ε. coli NCTC 86 φαίνεται στο Σχήμα 4Α-Δ και η αλληλεπίδραση με το Campylobacter jejuni PT14 και το Campylobacter suis S12 φαίνεται στο Σχήμα 4Ε-Η μέση. Ο μηχανισμός επίθεσης φαίνεται να είναι διαφορετικός μεταξύ των τύπων θηραμάτων που δοκιμάστηκαν, με ένα ή περισσότερα κύτταρα E. coli προσαρτημένα σε κάθε κύτταρο ASxL5T και τοποθετημένα πλευρικά κατά μήκος του εκτεταμένου κυττάρου πριν από την προσρόφηση. Αντίθετα, το ASxL5T φαίνεται να προσκολλάται στο Campylobacter μέσω ενός μόνο σημείου επαφής, συνήθως σε επαφή με την κορυφή του κυττάρου θηρευτή και κοντά στην κορυφή του κυττάρου Campylobacter (Εικόνα 4Η).
TEM που δείχνει την αλληλεπίδραση μεταξύ ASx5LT και θηράματος: (AD) και E. coli θήραμα. (EH) και C. jejuni θήραμα. (Α) Ένα τυπικό κύτταρο ASx5LT συνδεδεμένο με ένα μόνο κύτταρο E. coli (EC). (Β) Ένα νηματώδες ASx5LT προσαρτημένο σε ένα μόνο κύτταρο EC. (Γ) Ένα νηματοειδές κύτταρο ASx5LT συνδεδεμένο με πολλαπλά κύτταρα EC. (D) Προσάρτηση μικρότερων κυττάρων ASx5LT σε ένα μόνο κύτταρο E. coli (EC). (Ε) ένα μεμονωμένο κύτταρο ASx5LT συνδεδεμένο με ένα κύτταρο Campylobacter jejuni (CJ). (F) Το ASx5LT επιτίθεται στα κύτταρα του C. hyointestinalis (CH). (Ζ) δύο κυψέλες One ASx5LT επιτέθηκαν σε ένα κελί CJ. (Η) Μια κοντινή όψη του σημείου προσάρτησης ASx5LT, κοντά στην κορυφή του κυττάρου CJ (ράβδος 0,2 μm). Η μπάρα αντιπροσωπεύει 1 μm σε (A–G).
Τα αρπακτικά βακτήρια έχουν εξελιχθεί για να εκμεταλλεύονται άφθονες πηγές θηραμάτων. Προφανώς, υπάρχουν ευρέως σε πολλά διαφορετικά περιβάλλοντα. Λόγω του στενού μεγέθους των μελών του πληθυσμού, είναι δυνατό να απομονωθούν βακτήρια ASxL5T από τον πολτό χρησιμοποιώντας τη μέθοδο διαχωρισμού φάγων. Η γονιδιωματική συνάφεια του ASxL5T με τα μέλη της οικογένειας θαλάσσιων βακτηρίων ωκεανόσπιρλας είναι εκπληκτική, αν και ο οργανισμός είναι ανεκτικός στο άλας και μπορεί να αναπτυχθεί σε ένα μέσο που περιέχει 5% αλάτι. Η ανάλυση ποιότητας νερού του πολτού έδειξε ότι η περιεκτικότητα σε χλωριούχο νάτριο ήταν μικρότερη από 0,1%. Επομένως, η λάσπη απέχει πολύ από το θαλάσσιο περιβάλλον-τόσο γεωγραφικά όσο και χημικά. Η παρουσία τριών σχετικών αλλά διαφορετικών απομονώσεων από την ίδια πηγή παρέχει στοιχεία ότι αυτοί οι θηρευτές ευδοκιμούν σε αυτό το μη θαλάσσιο περιβάλλον. Επιπλέον, η ανάλυση μικροβιώματος (αρχεία δεδομένων διαθέσιμα από https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990) έδειξε ότι η ίδια γονιδιακή αλληλουχία 16S rRNA βρίσκεται στα κορυφαία 50 πιο άφθονα λειτουργικά ταξινομικά (OTU) ) Σε λίγα διαστήματα δειγματοληψίας της λάσπης. Αρκετά ακαλλιέργητα βακτήρια βρέθηκαν στη βάση δεδομένων Genbank, τα οποία έχουν αλληλουχίες γονιδίου 16S rRNA παρόμοιες με τα βακτήρια ASxL5T. Αυτές οι αλληλουχίες, μαζί με τις αλληλουχίες των ASxL5T, ASxS5 και ASxO5, φαίνεται να αντιπροσωπεύουν διαφορετικά clades διαχωρισμένα από το Thalassolituus και το Oceanobacter (Εικόνα 2). Τρία είδη ακαλλιέργητων βακτηρίων (GQ921362, GQ921357 και GQ921396) απομονώθηκαν από το νερό της σχισμής σε βάθος 1,3 χιλιομέτρων στο χρυσωρυχείο της Νότιας Αφρικής το 2009, και τα άλλα δύο (DQ256320 και DQ337006 από τη Νότια Αφρική) το 2005). Η αλληλουχία γονιδίου 16S rRNA που σχετίζεται περισσότερο με το ASxL5T είναι μέρος της αλληλουχίας γονιδίου 16S rRNA που ελήφθη από την καλλιέργεια εμπλουτισμού αμμωδών ιζημάτων που ελήφθησαν από τις παραλίες της βόρειας Γαλλίας το 2006 (αριθμός πρόσβασης AM29240828). Μια άλλη στενά συγγενής αλληλουχία γονιδίου 16S rRNA από το ακαλλιέργητο βακτήριο HQ183822.1 ελήφθη από μια δεξαμενή συλλογής που εκπλύθηκε από μια δημοτική χωματερή στην Κίνα. Προφανώς, τα βακτήρια ASxL5T δεν είναι ιδιαίτερα αντιπροσωπευτικά στις ταξινομικές βάσεις δεδομένων, αλλά αυτές οι αλληλουχίες από ακαλλιέργητα βακτήρια είναι πιθανό να αντιπροσωπεύουν οργανισμούς παρόμοιους με τον ASxL5T, οι οποίοι είναι κατανεμημένοι σε όλο τον κόσμο, συνήθως σε δύσκολα περιβάλλοντα. Από το σύνολο της φυλογενετικής ανάλυσης του γονιδιώματος, το πλησιέστερο σε σχέση με το ASxL5T είναι το Thalassolituus sp. C2-1, Τ. marinus, Τ. oleivorans. Και O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Το Thalassolituus είναι μέλος των βακτηρίων θαλάσσιου υποχρεωτικού κατακερματισμού υδρογονανθράκων (OHCB), το οποίο είναι ευρέως διαδεδομένο σε θαλάσσιο και χερσαίο περιβάλλον και συνήθως γίνεται το κυρίαρχο μετά από περιστατικά ρύπανσης από υδρογονάνθρακες30,31. Τα θαλάσσια βακτήρια δεν είναι μέλη της ομάδας OHCB, αλλά είναι απομονωμένα από το θαλάσσιο περιβάλλον.
Τα φαινοτυπικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι το ASxL5T είναι ένα νέο είδος και μέλος ενός προηγουμένως μη αναγνωρισμένου γένους στη θαλάσσια οικογένεια spirospiraceae. Επί του παρόντος δεν υπάρχει σαφές πρότυπο για την ταξινόμηση των πρόσφατα απομονωθέντων στελεχών σε ένα νέο γένος. Έχουν γίνει προσπάθειες για τον καθορισμό των καθολικών ορίων των γενών, για παράδειγμα, με βάση το ποσοστό του γονιδιώματος μιας συντηρητικής πρωτεΐνης (POCP), συνιστάται η τιμή αποκοπής να είναι 50% ίδια με το στέλεχος αναφοράς33. Άλλοι προτείνουν τη χρήση τιμών AAI, οι οποίες έχουν πλεονεκτήματα έναντι του POCP επειδή μπορούν να ληφθούν από ελλιπή γονιδιώματα34. Ο συγγραφέας πιστεύει ότι εάν η τιμή AAI είναι μικρότερη από 74% σε σύγκριση με το πρότυπο στέλεχος του μοντέλου είδους, το στέλεχος είναι αντιπροσωπευτικό διαφορετικών γενών. Το μοντέλο γένος στα θαλάσσια σπειροειδή είναι το θαλάσσιο σπιρίλλουμ και το μοντέλο στέλεχος είναι το O. linum ATCC 11336T. Η τιμή AAI μεταξύ ASxL5T και O. linum ATCC 11336T είναι 54,34%, και η τιμή AAI μεταξύ ASxL5T και T. oleivorans MIL-1T (στελέχη τύπου γένους) είναι 67,61%, υποδεικνύοντας ότι το ASxL5T αντιπροσωπεύει ένα νέο γένος διαφορετικό από το Thalas. Χρησιμοποιώντας την αλληλουχία γονιδίου 16S rRNA ως πρότυπο ταξινόμησης, το προτεινόμενο όριο οριοθέτησης γένους είναι 94,5%35. Το ASxL5T μπορεί να τοποθετηθεί στο γένος Thalassolituus, εμφανίζοντας 95,03% ταυτότητα αλληλουχίας 16S rRNA με T. oleivorans MIL-1T και 96,17%. marinus IMCC1826T. Ωστόσο, θα τοποθετηθεί επίσης στο γένος Bacteroides που έχει 94,64% ταυτότητα γονιδίου 16S rRNA με B. sanyensis NV9, υποδεικνύοντας ότι η χρήση ενός μόνο γονιδίου όπως το γονίδιο 16S rRNA μπορεί να οδηγήσει σε αυθαίρετη ταξινόμηση και εκχώρηση. Μια άλλη προτεινόμενη μέθοδος χρησιμοποιεί το ANI και το Genome Alignment Score (AF) για να εξετάσει τη ομαδοποίηση σημείων δεδομένων από όλους τους τύπους και τα μη τύπου στελέχη υπαρχόντων γενών. Ο συγγραφέας συνιστά τον συνδυασμό του ορίου του γένους με το σημείο καμπής του εκτιμώμενου γένους που είναι συγκεκριμένο για τα ταξινομικά είδη που αναλύονται. Ωστόσο, εάν δεν υπάρχουν αρκετές πλήρεις αλληλουχίες γονιδιώματος από απομονώσεις Thalassolituus, είναι αδύνατο να προσδιοριστεί εάν το ASxL5T ανήκει στο γένος Thalassolituus με αυτή τη μέθοδο. Λόγω της περιορισμένης διαθεσιμότητας πλήρων αλληλουχιών γονιδιώματος για ανάλυση, ολόκληρο το φυλογενετικό δέντρο του γονιδιώματος θα πρέπει να ερμηνεύεται με προσοχή. Δεύτερον, οι μέθοδοι σύγκρισης ολόκληρου του γονιδιώματος δεν μπορούν να εξηγήσουν ουσιαστικές διαφορές στο μέγεθος των συγκριτικών γονιδιωμάτων. Μέτρησαν την ομοιότητα των γονιδίων ενός διατηρημένου πυρήνα ενός αντιγράφου μεταξύ των σχετικών γενών, αλλά δεν έλαβαν υπόψη τον μεγάλο αριθμό γονιδίων που δεν υπάρχουν στο πολύ μικρότερο γονιδίωμα του ASxL5T. Προφανώς, το ASxL5T και οι ομάδες συμπεριλαμβανομένων των Thalassolituus, Oceanobacter και Bacterioplanes έχουν κοινό πρόγονο, αλλά η εξέλιξη έχει ακολουθήσει διαφορετική πορεία, οδηγώντας σε μείωση του γονιδιώματος, που μπορεί να είναι η προσαρμογή σε έναν αρπακτικό τρόπο ζωής. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με το T. oleivorans MIL-1T, το οποίο είναι 28% μεγαλύτερο και έχει εξελιχθεί κάτω από διαφορετικές περιβαλλοντικές πιέσεις για να χρησιμοποιεί υδρογονάνθρακες23,30. Μια ενδιαφέρουσα σύγκριση μπορεί να γίνει με υποχρεωτικά ενδοκυτταρικά παράσιτα και συμβίωση, όπως Rickettsia, Chlamydia και Buchnera. Το μέγεθος του γονιδιώματός τους είναι περίπου 1 Mb. Η ικανότητα χρήσης μεταβολιτών του κυττάρου ξενιστή οδηγεί σε απώλεια γονιδίου, επομένως υπέστη σημαντική εξελικτική γονιδιωματική αποδόμηση. Οι εξελικτικές αλλαγές από θαλάσσιους χημικούς θρεπτικούς οργανισμούς σε αρπακτικούς τρόπους ζωής μπορεί να οδηγήσουν σε παρόμοια μείωση του μεγέθους του γονιδιώματος. Η ανάλυση COG και KEGG υπογραμμίζει τον αριθμό των γονιδίων που χρησιμοποιούνται για συγκεκριμένες λειτουργίες και τις παγκόσμιες διαφορές στις γονιδιωματικές οδούς μεταξύ ASxL5T και T. oleivorans MIL-1T, οι οποίες δεν οφείλονται στην ευρεία διαθεσιμότητα κινητών γενετικών στοιχείων. Η διαφορά στην αναλογία G + C ολόκληρου του γονιδιώματος του ASxL5T είναι 56,1%, και εκείνη του T. oleivorans MIL-1T είναι 46,6%, πράγμα που δείχνει επίσης ότι είναι διαχωρισμένο.
Η εξέταση του κωδικοποιητικού περιεχομένου του γονιδιώματος ASxL5T παρέχει λειτουργικές πληροφορίες για τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά. Η παρουσία γονιδίων που κωδικοποιούν κροσσούς τύπου IV (Tfp) παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον γιατί προάγουν την κυτταρική κίνηση, που ονομάζεται κοινωνική ολίσθηση ή σπασμοί, χωρίς μαστίγια στην επιφάνεια. Σύμφωνα με αναφορές, το Tfp έχει και άλλες λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένης της θήρευσης, της παθογένεσης, του σχηματισμού βιοφίλμ, της φυσικής πρόσληψης DNA, της αυτόματης κυτταρικής συσσώρευσης και ανάπτυξης38. Το γονιδίωμα ASxL5T περιέχει 18 γονίδια που κωδικοποιούν διγουανυλική κυκλάση (ένα ένζυμο που καταλύει τη μετατροπή 2 τριφωσφορικής γουανοσίνης σε φωσφορική γουανοσίνη 2 και κυκλικό diGMP) και 6 γονίδια που κωδικοποιούν την αντίστοιχη διγουανυλική φωσφορική κυκλάση. Το γονίδιο για την εστεράση (που καταλύει την αποδόμηση της κυκλικής δι-ΟΜΡ σε μονοφωσφορική γουανοσίνη) είναι ενδιαφέρον επειδή το κυκλ-δι-ΟΜΡ είναι ένας σημαντικός δεύτερος αγγελιοφόρος που εμπλέκεται στην ανάπτυξη και διαχωρισμό βιοφίλμ, κίνηση, προσκόλληση κυττάρων και λοιμογόνο δράση 39, 40 στη διαδικασία. Θα πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι στο Bdellovibrio bacteriovorus, η κυκλική διπλή GMP έχει αποδειχθεί ότι ελέγχει τη μετάβαση μεταξύ ελεύθερης ζωής και επιθετικού τρόπου ζωής41.
Οι περισσότερες έρευνες για τα αρπακτικά βακτήρια έχουν επικεντρωθεί στο Bdellovibrio, σε οργανισμούς που μοιάζουν με Bdellovibrio και στα είδη Myxococcus. Αυτά και άλλα γνωστά παραδείγματα αρπακτικών βακτηρίων αποτελούν μια διαφορετική ομάδα. Παρά αυτή την ποικιλομορφία, έχει εντοπιστεί ένα σύνολο χαρακτηριστικών πρωτεϊνικών οικογενειών που αντικατοπτρίζουν τους φαινότυπους 11 γνωστών αρπακτικών βακτηρίων3,22. Ωστόσο, έχουν εντοπιστεί μόνο γονίδια που κωδικοποιούν τη λιγάση του αντιγόνου Ο (waaL), το οποίο είναι ιδιαίτερα κοινό στα αρνητικά κατά Gram βακτήρια. Αυτή η μορφή ανάλυσης δεν είναι χρήσιμη για τον χαρακτηρισμό του ASxL5T ως αρπακτικό, πιθανώς επειδή χρησιμοποιεί μια νέα στρατηγική επίθεσης. Η διαθεσιμότητα πιο διαφορετικών αρπακτικών βακτηριακών γονιδιωμάτων θα βοηθήσει στην ανάπτυξη αναλύσεων λεπτότερης ανάλυσης που θα λάβουν υπόψη στοιχεία λειτουργικών και περιβαλλοντικών διαφορών μεταξύ των μελών της ομάδας. Παραδείγματα αρπακτικών βακτηρίων που δεν περιλαμβάνονται σε αυτήν την ανάλυση περιλαμβάνουν μέλη των Cupriavidus necator42 και Bradymonabacteria43, επειδή καθώς οι ερευνητές διερευνούν διαφορετικές μικροβιακές κοινότητες, καθιερώνονται περισσότερα αρπακτικά ταξινομικά είδη.
Το πιο αξιοσημείωτο χαρακτηριστικό των βακτηρίων ASxL5T που καταγράφονται από την εικόνα TEM είναι η μοναδική και ευέλικτη μορφολογία του, η οποία μπορεί να προωθήσει την αλληλεπίδραση με βακτήρια θηράματος. Ο τύπος της αλληλεπίδρασης που παρατηρείται είναι διαφορετικός από άλλα αρπακτικά βακτήρια και δεν έχει ανακαλυφθεί ή αναφερθεί προηγουμένως. Ο προτεινόμενος κύκλος ζωής αρπακτικών ASxL5T φαίνεται στο Σχήμα 5. Υπάρχουν λίγα παραδείγματα στη βιβλιογραφία με παρόμοιες κορυφαίες δομές όπως αναφέρουμε εδώ, αλλά αυτά τα παραδείγματα περιλαμβάνουν το Terasakiispira papahanaumokuakeensis, ένα θαλάσσιο βακτήριο σπιρίλλου με περιστασιακή μεγέθυνση κορυφής 44, και το Alphateriellaproteo. , που ανήκε στο παρελθόν στο γένος Oceanospillum, που παρουσιάζει το λεγόμενο «πολικό φιλμ» 45. Μορφές κόκκων παρατηρούνται συχνά σε παλαιότερες καλλιέργειες, ειδικά για βακτήρια με καμπύλες μορφές, όπως Vibrio, Campylobacter και Helicobacter 46, 47, 48, που μπορεί να αντιπροσωπεύουν μια υποβαθμισμένη κατάσταση . Απαιτείται περαιτέρω εργασία για να αποσαφηνιστεί ο ακριβής κύκλος ζωής των βακτηρίων ASxL5T. Να προσδιορίσει πώς συλλαμβάνει και θηράματα και αν το γονιδίωμά του κωδικοποιεί βιολογικά ενεργές ενώσεις που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ιατρικούς ή βιοτεχνολογικούς σκοπούς.
Περιγραφή του Venatorbacter gen. Νοέμβριος Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. αποτελείται από venators από τα L. n. venator, 'hunter' και Gr. n. bacter,'a rod'. Venatorbacter,'a hunting Rod' Τα κύτταρα είναι αερόβια, ανεκτικά στο άλας, αρνητικά σε καμπύλες Gram, ενώ η δραστηριότητα της καταλάσης και της οξειδάσης δεν είναι συσσωρεύονται στο εύρος θερμοκρασίας από 4 έως 42 °C. Το εύρος του pH είναι ασυνήθιστο στα θαλάσσια σαλιγκάρια. Τα C16:0 και C18:1ω9 ; Τα υδροξυλιπαρά οξέα δεν αναπτύσσονται σε ζωμό Η περιεκτικότητα σε DNA G + C είναι 56,1 mol την οικογένεια.
Περιγραφή του Venatorbacter cucullus sp. Νοέμβριος Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus σημαίνει φέρινγκ).
Επιπλέον, το περιγραφικό χαρακτηριστικό αυτού του γένους είναι ότι όταν αναπτύσσονται σε ΒΑ ή ΒΗΙ, τα κύτταρα έχουν μήκος 1,63 μm και πλάτος 0,37 μm. Οι αποικίες στο άγαρ BHI είναι πολύ μικρές, φτάνοντας σε διάμετρο 2 mm μετά από 72 ώρες. Είναι μπεζ, ημιδιαφανή, στρογγυλά, κυρτά και γυαλιστερά. Τα μέλη αυτού του είδους μπορούν να χρησιμοποιήσουν Escherichia coli και Klebsiella. Το Campylobacter και πολλά άλλα Gram-αρνητικά βακτήρια χρησιμεύουν ως θήραμα.
Το τυπικό στέλεχος ASxL5T απομονώθηκε από βοδινό γάλα στο Nottinghamshire, UK, και κατατέθηκε στην Εθνική Συλλογή Τύπου Καλλιεργειών (Ηνωμένο Βασίλειο): αριθμός πρόσβασης NCTC 14397 και ο αριθμός εισαγωγής της συλλογής βακτηριακής καλλιέργειας της Ολλανδίας (NCCB) NCCB 100775. Η πλήρης αλληλουχία γονιδιώματος του ASxL έχει κατατεθεί στη Genbank σύμφωνα με την προσθήκη του CP046056.
Τα βακτήρια ASxL5T απομονώθηκαν από βοδινό γάλα χρησιμοποιώντας τεχνολογία απομόνωσης φάγου9,49. Ο πολτός αραιώθηκε 1:9 (β/ο) σε ρυθμιστικό διάλυμα SM (50 mM Tris-HCl [ρΗ 7,5], 0,1 Μ NaCl, 8 mM MgSO4,7H2O και 0,01% ζελατίνη· Sigma Aldrich, Gillingham, UK), στη συνέχεια επωάστηκε στους 4°C για 24 ώρες, περιστρέφοντας αργά για να εκλουστεί το αρπακτικά μέσα στο buffer. Το εναιώρημα φυγοκεντρήθηκε στα 3000 g για 3 λεπτά. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε στα 13.000 g για δεύτερη φορά για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο στη συνέχεια πέρασε μέσω ενός φίλτρου μεμβράνης 0,45 μm (Minisart· Sartorius, Gottingen, Γερμανία) και ενός φίλτρου μεμβράνης 0,2 μm (Minisart) για να αφαιρεθούν τυχόν εναπομείναντα βακτηριακά κύτταρα. Το ASxL5T μπορεί να περάσει αυτά τα φίλτρα. Ένας μαλακός χλοοτάπητας άγαρ Campylobacter enterosus S12 (NCBI αριθμός πρόσβασης CP040464) από τον ίδιο πολτό παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τυπικές τεχνικές. Ο διηθημένος πολτός κατανεμήθηκε σε καθεμία από αυτές τις πλάκες κυττάρων ξενιστή σε σταγονίδια των 10 μΐ εις τριπλούν και αφέθηκε να στεγνώσει. Η πλάκα επωάστηκε σε μια μικροαερόφιλη δεξαμενή στους 37°C για 48 ώρες υπό μικροαερόβιες συνθήκες (5% Ο2, 5% Η2, 10% CO2 και 80% Ν2). Η ληφθείσα ορατή πλάκα εκχυλίστηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα SM και μεταφέρθηκε στο φρέσκο ​​γρασίδι του C. hyointestinalis S12 για περαιτέρω πολλαπλασιασμό των οργανισμών που υπέστησαν λύση. Αφού διαπιστωθεί ότι τα βακτήρια είναι η αιτία της λυτικής πλάκας και όχι ο φάγος, προσπαθήστε να αναπτύξετε τον οργανισμό ανεξάρτητα από τον ξενιστή και να τον χαρακτηρίσετε περαιτέρω. Η αερόβια καλλιέργεια πραγματοποιήθηκε στους 37 °C με 5% ν/ν απινιδωμένο αίμα αλόγου (TCS Biosciences Lt, Buckingham, UK, συμπλήρωμα). Σύμφωνα με τις οδηγίες της Εθνικής Επιτροπής Κλινικών Προτύπων, η μέθοδος διάχυσης του δίσκου χρησιμοποιείται για τον έλεγχο αντιβακτηριακής ευαισθησίας. Το άγαρ BHI καλλιεργήθηκε στους 37 °C χρησιμοποιώντας ένα δίσκο που περιείχε τα ακόλουθα αντιβιοτικά (Oxoid) για αερόβια καλλιέργεια: αμοξικιλλίνη και κλαβουλανικό οξύ 30 μg. κεφοταξίμη 30 μg; στρεπτομυκίνη 10 μg; σιπροφλοξασίνη 5 μg; Κεφταζιδίμη 30 μg Ναλιδιξικό οξύ 30 μg; Ιμιπενέμη 10 μg; Αζιθρομυκίνη 15 μg; Χλωραμφενικόλη 30 μg; Κεφοξιτίνη 30 μg; Τετρακυκλίνη 30 μg; Νιτροφουραντοΐνη 300 μg; Αζτρεονάμη 30 μg; Αμπικιλλίνη 10 μg ; Κεφποδοξίμη 10 μg; Τριμεθοπρίμη-Σουλφαμεθοξαζόλη 25 μg. Η ανοχή σε αλάτι καθορίστηκε με αερόβια επώαση σε πλάκες άγαρ BHI στους 37 °C. Πρόσθετο NaCl προστέθηκε στις πλάκες άγαρ ΒΗΙ για να παράσχει ένα εύρος συγκέντρωσης έως και 10% β/ο. Το εύρος του pH προσδιορίζεται με αερόβια καλλιέργεια σε πλάκες άγαρ BHI στους 37°C, όπου το εύρος του pH έχει ρυθμιστεί μεταξύ 4 και 9 με στείρο HCl ή στείρο NaOH και η τιμή του pH στόχου επαληθεύεται πριν από την έκχυση του πλακιδίου. Για ανάλυση κυτταρικών λιπαρών οξέων, το ASxL5T καλλιεργήθηκε σε άγαρ BHI για 3 ημέρες και αερόβια στους 37 °C. Σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο MIDI (Sherlock Microbial Identification System, έκδοση 6.10) της FERA Science Ltd, (York, UK), τα λιπαρά οξέα των κυττάρων εκχυλίστηκαν, παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν.
Για το TEM, το ASxL5T καλλιεργήθηκε αερόβια με ομοιόμορφη επάλειψη σε BA στους 37°C για 24 ώρες και στη συνέχεια συλλέχτηκε σε 1 ml γλουταραλδεΰδης 3% (v/v) σε ρυθμιστικό διάλυμα κακοδυλικής 0,1 M σε θερμοκρασία δωματίου. στα 10.000 γρ για 3 λεπτά. Στη συνέχεια, επαναιωρήστε απαλά το ίζημα σε 600 μl ρυθμιστικού κακοδυλικού διαλύματος 0,1 M. Μεταφέρετε τη σταθερή ανάρτηση ASxL5T στη μεμβράνη Formvar/carbon σε ένα πλέγμα χαλκού 200 mesh. Τα βακτήρια χρωματίστηκαν με 0,5% (β/ο) οξικό ουρανύλιο για 1 λεπτό και εξετάστηκαν με ΤΕΜ χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο TEI Tecnai G2 12 Biotwin. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, συνδυάστε τον ίδιο αριθμό θηραμάτων και αρπακτικών στο ζωμό NZCYM (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) και επωάστε για 48 ώρες κάτω από μικροαερόβιες συνθήκες Campylobacter ή Campylobacter στους 37°C , Η αλληλεπίδραση αρπακτικού και θηράματος εξετάστηκε και από την ΤΕΜ. Αερόβιες συνθήκες για Escherichia coli. Εξετάστε ανεξάρτητα το θήραμα και τα αρπακτικά βακτήρια για να προσδιορίσετε τυχόν αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων λόγω θήρευσης. Η μέθοδος μαύρου του Σουδάν χρησιμοποιήθηκε για την οπτική μικροσκοπία της συσσώρευσης PHB.
Αναπτύξτε καλλιέργειες ASxL5T ολονύκτιας επάλειψης ανάπτυξης σε πλάκες BHI ή BA με ένα αποστειρωμένο στυλεό. Συλλέξτε κύτταρα ASxL5T και εναιωρήστε τα σε MRD (CM0733, Oxoid) και στη συνέχεια τοποθετήστε τα στους 4°C για 7 ημέρες για να λιμοκτονήσουν τα κύτταρα. Η βακτηριακή καλλιέργεια αναφοράς NCTC ή αποθέματος εργαστηρίου εμβολιάστηκε σε ζωμό BHI ή θρεπτικό ζωμό Νο. 2 (CM007, Oxoid), επωάστηκε όλη τη νύχτα, φυγοκεντρήθηκε στα 13.000 g και επαναιωρήθηκε σε MRD έως ότου το OD600 ήταν 0,4. Καλλιέργεια: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, Klebsiella,TCU114oxy 10817, Listeria Special βακτήρια NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, Rhodococcus υποβρύχιο χάμπουργκερ NCTC 1621T, NCTC 1621T βακτηρίδια Salmonellade7 NCTC 10861, Staphylococcus aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. Ο ξενιστής Campylobacter επωάστηκε μικροαερόβια σε τρυβλία BA και αιωρήθηκε στους 37°C στους 37°C στους 37°C. Οι δοκιμασμένοι ξενιστές Campylobacter είναι: C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11148, C. lari NCTC 11148 jejuni PT14, C... Συλλέξτε κύτταρα σε MRD, φυγοκεντρήστε στα 13.000 g και επαναιωρήστε σε MRD μέχρι το OD600 να γίνει 0,4. Προσθέστε ένα κλάσμα 0,5 ml εναιωρήματος σε 5 ml λιωμένο πάνω άγαρ NZCYM (0,6% άγαρ) και χύστε το σε μια πλάκα βάσης 1,2% NZCYM. Μετά τη σκλήρυνση και ξήρανση, το σειριακά αραιωμένο ASxL5T κατανεμήθηκε ως σταγονίδια 20 μl σε κάθε σανίδα γκαζόν εις τριπλούν. Η θερμοκρασία και η ατμόσφαιρα καλλιέργειας εξαρτώνται από τις απαιτήσεις των βακτηρίων δοκιμής.
Χρησιμοποιήστε το GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma Aldridge) για να παρασκευάσετε DNA από βακτηριακά απομονωμένα στελέχη. Χρησιμοποιήθηκαν πρότυπες μέθοδοι για την ενίσχυση PCR του γονιδίου 16S rRNA και τον προσδιορισμό της αλληλουχίας προϊόντος χρησιμοποιώντας χημεία τερματισμού βαφής (Eurofins Value Read Service, Γερμανία). Χρησιμοποιήστε το πρόγραμμα BLAST-N για να συγκρίνετε αυτές τις αλληλουχίες με άλλες αλληλουχίες γονιδίου 16S rRNA για να αναγνωρίσετε και να συλλέξετε στενά συγγενικά είδη. Αυτά είναι ευθυγραμμισμένα χρησιμοποιώντας το ClustalW στο πρόγραμμα MEGA X. Το φυλογενετικό δέντρο ανακατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το MEGA X χρησιμοποιώντας τη μέθοδο μέγιστης πιθανότητας που βασίζεται στο μοντέλο Tamura-Nei, με 1000 καθοδηγούμενα αντίγραφα54. Χρησιμοποιήστε το PureLink™ Genomic DNA Kit (Fisher Scientific, Loughborough, UK) για να εξαγάγετε DNA για αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος. Η αλληλουχία γονιδιώματος του ASxL5T προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τον συνδυασμό Illumina MiSeq, ο οποίος αποτελείται από αναγνώσεις διπλού άκρου 250 bp που αποτελείται από μια βιβλιοθήκη που παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ετικετών Nextera και μετρήσεις μήκους 2 έως 20 kb από την πλατφόρμα PacBio. Genomics DNA Sequencing Research Facility στο Πανεπιστήμιο Sembia. Το γονιδίωμα συναρμολογήθηκε χρησιμοποιώντας CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen, Aarhus, Δανία). Οι καλλιέργειες ASxL5T κατατίθενται στην Εθνική Συλλογή Καλλιεργειών Τύπου (Ηνωμένο Βασίλειο) και στη Συλλογή Βακτηριακής Καλλιέργειας Ολλανδίας (NCCB). Τα γονιδιώματα συγγενών οργανισμών που χρησιμοποιούνται για σύγκριση είναι: Thalassolituus oleivorans MIL-1T (αριθμός πρόσβασης HF680312, πλήρης). Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (αριθμός πρόσβασης BMYY01000001, ελλιπής). Oceanobacter kriegii DSM 6294T (αριθμός πρόσβασης NZ_AUGV00000000, ελλιπής); Marinamonas community DSM 5604T (προστέθηκε ASM436330v1, μη ολοκληρωμένο), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (προστέθηκε MTSD02000001, ελλιπές) και Thalassolituus sp. C2-1 (προσθήκη NZ_VNIL01000001, ελλιπής). Χρησιμοποιήστε το JGI Genome Portal36 στη διεύθυνση https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page= για να προσδιορίσετε τη βαθμολογία ευθυγράμμισης (AF) και τη μέση ταυτότητα νουκλεϊκού οξέος (ANI). Σε ζευγάρια. Για τον προσδιορισμό της ταυτότητας αμινοξέων (AAI) χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Rodriguez-R & Konstantinidis55. Χρησιμοποιήστε το GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 για να δημιουργήσετε ένα εκτιμώμενο φυλογενετικό δέντρο μέγιστης πιθανότητας. Το γονιδίωμα εισόδου που αντιπροσωπεύει το διαθέσιμο γονιδίωμα αναφοράς επιλέγεται από γένη αναφοράς που προσδιορίζεται ότι σχετίζεται με το ASxL5T από τη φυλογένεση του 16S rRNA. Σημείωσε το δέντρο χρησιμοποιώντας το διαδραστικό διαδικτυακό εργαλείο δέντρου της ζωής (https://itol.embl.de/). Ο λειτουργικός σχολιασμός και η ανάλυση του γονιδιώματος ASxL5T πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας το διαδικτυακό εργαλείο BlastKOALA KEGG χρησιμοποιώντας τη διανομή εμπλουτισμού της ενότητας KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Η κατανομή των κατηγοριών COG (ορθολογικές ομάδες) προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας το διαδικτυακό εργαλείο eggNOG-mapper.
Pérez, J., Moraleda-Muñoz, A., Marcos-Torres, FJ και Muñoz-Dorado, J. Βακτηριακή αρπαγή: 75 χρόνια και συνεχίζεται! . περιβάλλο. μικροοργανισμός. 18, 766–779 (2016).
Linares-Otoya, L. κ.λπ. Ποικιλομορφία και αντιβακτηριδιακό δυναμικό αρπακτικών βακτηρίων στην περουβιανή ακτογραμμή. Μάρτιος ναρκωτικά. 15. Ε308. https://doi.org/10.3390/md15100308 (2017).
Pasternak, Z. et al. Μέσα από τα γονίδιά τους, θα τα καταλάβετε: τα γονιδιωματικά χαρακτηριστικά των αρπακτικών βακτηρίων. ISME J. 7, 756–769 (2013).
Sockett, RE Ο αρπακτικός τρόπος ζωής του βακτηριοφάγου Bdellovibrio. εγκαθιστώ. Μικρόβια πάστορα. 63, 523–539 (2009).
Korp, J., Vela Gurovic, MS & Nett, M. Αντιβιοτικά από αρπακτικά βακτήρια. Beilstein J. Histochemistry 12, 594–607 (2016).
Johnke, J., Fraune, S., Bosch, TCG, Hentschel, U. & Schulenburg, H. Bdellovibrio και παρόμοιοι οργανισμοί είναι προγνωστικοί παράγοντες της ποικιλότητας του μικροβιώματος σε διαφορετικούς πληθυσμούς ξενιστές. μικροοργανισμός. Οικολογία. 79, 252–257 (2020).
Vila, J., Moreno-Morales, J. and Ballesté-Delpierre, C. Ανακαλύψτε την τρέχουσα κατάσταση των νέων αντιβακτηριακών παραγόντων. κλινικός. μικροοργανισμός. Μολύνω. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2019.09.015 (2019).
Hobley, L. et al. Η διπλή θήρευση φάγου και φάγου μπορεί να εξαλείψει το θήραμα του E. coli χωρίς ούτε μία θήρα. J. Βακτήρια. 202, e00629-19. https://doi.org/10.1128/JB.00629-19 (2020).
El-Shibiny, A., Connerton, PL & Connerton, IF Ο αριθμός και η ποικιλομορφία του Campylobacter και των βακτηριοφάγων που απομονώθηκαν κατά τη διάρκεια του κύκλου σίτισης κοτόπουλων ελευθέρας βοσκής και βιολογικής καλλιέργειας. Περιβάλλον εφαρμογής. μικροοργανισμός. 71, 1259–1266 (2005).
Wilkinson, DA κ.λπ. Ενημέρωση της γονιδιωματικής ταξινόμησης και επιδημιολογίας του Campylobacter των χοίρων. επιστήμη. Αντιπρόσωπος 8, 2393. https://doi.org/10.1038/s41598-018-20889-x (2018).
Lee, MD GToTree: Φιλική προς το χρήστη ροή εργασίας για συστήματα γονιδιωματικής. Bioinformatics 35, 4162–4164 (2019).
Edgar, RC MUSCLE: Μια μέθοδος ευθυγράμμισης πολλαπλών ακολουθιών που μειώνει την πολυπλοκότητα του χρόνου και του χώρου. Βιολογικές πληροφορίες BMC. 5, 113 (2004).
Capella-Gutiérrez, S., Silla-Martínez, JM & Gabaldón, T. TrimAl: Ένα εργαλείο για αυτόματη ευθυγράμμιση και περικοπή σε μεγάλης κλίμακας φυλογενετική ανάλυση. Bioinformatics 25, 1972–1973 (2009).
Hyatt, D., LoCascio, PF, Hauser, LJ & Uberbacher, πρόβλεψη θέσης έναρξης μετάφρασης γονιδίου EC και μεταγονιδιωματικής αλληλουχίας. Bioinformatics 28, 2223-2230 (2012).
Shen, W. & Xiong, J. TaxonKit: Cross-platform and αποτελεσματική εργαλειοθήκη ταξινόμησης NCBI. Bio Rxiv. (Πρόσβαση την 1η Ιουνίου 2021) https://www.biorxiv.org/content/10.1101/513523v1 (2019).
Τιμή, MN, Dehal, PS & Arkin, AP FastTree 2-κατά προσέγγιση δέντρο μέγιστης πιθανότητας με μεγάλη ευθυγράμμιση. PLoS One 5, e9490 (2010).
Tange, O. GNU Parallel. (Πρόσβαση την 1η Ιουνίου 2021) https://zenodo.org/record/1146014#.YOHaiJhKiUk (2018).
Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Έρευνα νουκλεϊκών οξέων. 28, 27-30 (2000).
Τσεχική Δημοκρατία, L. κ.λπ. Ο ρόλος των ακραίων ουσιών εκτοΐνη και υδροξυεκτοΐνη ως προστατευτικά και θρεπτικά συστατικά του στρες: γενετική, γονιδιωματική συστημάτων, βιοχημεία και δομική ανάλυση. Γονίδιο (Βασιλεία). 9. Ε177. https://doi.org/10.3390/genes9040177 (2018).
Gregson, BH, Metodieva, G., Metodiev, MV, Golyshin, PN & McKew, BA Διαφορική έκφραση πρωτεΐνης κατά την ανάπτυξη του υποχρεωτικού θαλάσσιου βακτηρίου Thalassolituus oleivorans MIL-1 κατά την ανάπτυξη αλκανίων μέσης και μακράς αλυσίδας. εμπρός. μικροοργανισμός. 9, 3130 (2018).
Pasternak, Z., Ben Sasson, T., Cohen, Y., Segev, E., and Jurkevitch, E. Μια νέα μέθοδος συγκριτικής γονιδιωματικής για τον καθορισμό φαινοτυπικών ειδικών δεικτών αποκαλύπτει ειδική κληρονομικότητα σε σημάδια αρπακτικών βακτηρίων. Public Science Library One. 10. e0142933. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142933 (2015).
Yakimov, MM, κλπ. Γονίδιο Thalassolituus oleivorans. Νοεμβρίου, sp. Νοέμβριος, ένας νέος τύπος θαλάσσιων βακτηρίων που ειδικεύεται στη χρήση υδρογονανθράκων. διεθνής. J. System. εξέλιξη. μικροοργανισμός. 54, 141–148 (2004).
Wang, Υ., Yu, Μ., Liu, Υ., Yang, Χ. & Zhang, XH Bacterioplanoides pacificum gen. Νοεμβρίου, sp. Τον Νοέμβριο, διαχωρίστηκε από το θαλασσινό νερό που κυκλοφορούσε στον Νότιο Ειρηνικό. διεθνής. J. System. εξέλιξη. μικροοργανισμός. 66, 5010–5015 (2016).