Se aisló un nuevo tipo de bacteria ASxL5T gramnegativa, aeróbica, tolerante a la sal, activa, con forma de bastón y depredadora de un estanque de estiércol de vaca en Nottinghamshire, Inglaterra, y utilizó Campylobacter como presa. Posteriormente, se descubrieron como presas otras especies de Campylobacter y miembros de la familia Enterobacteriaceae. Después del subcultivo sin células huésped, se logró un crecimiento aséptico débil en Brain Heart Infusion Agar. Las condiciones óptimas de crecimiento son 37 °C y el pH es 7. La microscopía electrónica de transmisión reveló algunas características morfológicas muy inusuales relacionadas con la disponibilidad de presas. El análisis filogenético utilizando la secuencia del gen 16S rRNA indicó que el aislado está relacionado con un miembro de la familia Marine Spirulina, pero no puede clasificarse claramente como miembro de ningún género conocido. La secuenciación del genoma completo de ASxL5T confirmó la relación con miembros de las espiroquetas marinas. Una búsqueda en una base de datos reveló que varios ASxL5T comparten secuencias del gen 16S rRNA con varias bacterias no cultivadas del océano, la superficie terrestre y las aguas subterráneas. Sugerimos que la cepa ASxL5T representa una nueva especie en un nuevo género. Recomendamos el nombre Venatorbacter cucullus gen. noviembre, sp. En noviembre, se utilizó ASxL5T como cepa tipo.
Las bacterias depredadoras son bacterias que exhiben la capacidad de cazar y matar otras bacterias vivas para obtener materiales biosintéticos y energía. Esto es diferente de la recuperación general de nutrientes de microorganismos muertos, y también es diferente de las interacciones parasitarias, en las que las bacterias forman una relación estrecha con su huésped sin matarlo. Las bacterias depredadoras han evolucionado en diferentes ciclos de vida para aprovechar las abundantes fuentes de alimento en los nichos donde se encuentran (como los hábitats marinos). Son un grupo taxonómicamente diverso, que sólo están conectados por su ciclo de vida de esterilización único1. Se han encontrado ejemplos de bacterias depredadoras en varios filos diferentes, incluidos: Proteobacteria, Bacteroides y Chlorella.3. Sin embargo, las bacterias depredadoras mejor estudiadas son los organismos Bdellovibrio y Bdellovibrio y similares (BALO4). Las bacterias depredadoras son una fuente prometedora de nuevos compuestos biológicamente activos y agentes antibacterianos5.
Se cree que las bacterias depredadoras mejoran la diversidad microbiana y tienen un impacto positivo en la salud, la productividad y la estabilidad de los ecosistemas6. A pesar de estos atributos positivos, existen pocos estudios sobre nuevas bacterias depredadoras debido a la dificultad de cultivar bacterias y la necesidad de observar cuidadosamente las interacciones celulares para comprender sus complejos ciclos de vida. Esta información no es fácil de obtener a partir de análisis informáticos.
En una era de creciente resistencia a los antimicrobianos, se están estudiando nuevas estrategias para atacar a los patógenos bacterianos, como el uso de bacteriófagos y bacterias depredadoras7,8. Las bacterias ASxL5T se aislaron en 2019 utilizando tecnología de aislamiento de fagos a partir de estiércol de vaca recolectado en el Centro Lácteo de la Universidad de Nottingham, Nottinghamshire. El propósito de la investigación es aislar organismos con potencial como agentes de control biológico. Campylobacter hyointestinalis es un patógeno zoonótico que se asocia cada vez más con enfermedades intestinales humanas10. Es ubicuo en el suero y se utiliza como huésped objetivo.
La bacteria ASxL5T fue aislada de la gelatina de res porque se observó que las placas que formaba en el césped de C. hyointestinalis eran similares a las producidas por los bacteriófagos. Este es un hallazgo inesperado, porque parte del proceso de aislamiento de fagos implica filtrar a través de un filtro de 0,2 µm, que está diseñado para eliminar células bacterianas. El examen microscópico del material extraído de la placa reveló que las pequeñas bacterias gramnegativas con forma de bastón curvado no acumulaban polihidroxibutirato (PHB). El cultivo aséptico independiente de las células presa se realiza en medio sólido rico (como agar de infusión de cerebro y corazón (BHI) y agar sangre (BA)), y su crecimiento es débil. Se obtiene después de mejorar el subcultivo con un inóculo pesado. Crece igualmente bien en condiciones microaeróbicas (7% v/v de oxígeno) y de oxígeno atmosférico, pero no en una atmósfera anaeróbica. Después de 72 horas, el diámetro de la colonia era muy pequeño, alcanzando los 2 mm, y era de color beige, translúcida, redonda, convexa y brillante. Las pruebas bioquímicas estándar se ven obstaculizadas porque ASxL5T no se puede cultivar de manera confiable en medios líquidos, lo que sugiere que puede depender del complejo ciclo de vida de la formación de biopelículas. Sin embargo, la suspensión en placa mostró que ASxL5T es aeróbico, positivo para oxidasa y catalasa y puede tolerar NaCl al 5%. ASxL5T es resistente a 10 µg de estreptomicina, pero es sensible a todos los demás antibióticos probados. Las células bacterianas ASxL5T fueron examinadas mediante TEM (Figura 1). Cuando se cultivan sin células presa en el BA, las células ASxL5T son Campylobacter pequeñas, con una longitud promedio de 1,63 μm (± 0,4), un ancho de 0,37 μm (± 0,08) y un solo polo largo (hasta 5 μm). Flagelos sexuales. Aproximadamente el 1,6% de las células parecen tener una anchura inferior a 0,2 µm, lo que permitirá el paso a través del dispositivo de filtrado. Se observó una extensión estructural inusual en la parte superior de algunas celdas, similar a un carenado (del latín cucullus) (ver las flechas en 1D, E, G). Esta parece estar compuesta por un exceso de membrana externa, lo que puede deberse a la rápida reducción del tamaño de la envoltura periplásmica, mientras que la membrana externa permanece intacta, mostrando un aspecto "suelto". El cultivo de ASxL5T en ausencia de nutrientes (en PBS) durante un período prolongado a 4 ° C dio como resultado que la mayoría (pero no todas) las células mostraran una morfología cocal (Figura 1C). Cuando ASxL5T crece con Campylobacter jejuni como presa durante 48 horas, el tamaño celular promedio es significativamente más largo y estrecho que el de las células cultivadas sin un huésped (Tabla 1 y Figura 1E). En contraste, cuando ASxL5T crece con E. coli como presa durante 48 horas, el tamaño promedio de las células es más largo y ancho que cuando crece sin presas (Tabla 1), y la longitud de las células es variable, mostrándose generalmente filamentosas (Figura 1F). Cuando se incubaron con Campylobacter jejuni o E. coli como presa durante 48 horas, las células ASxL5T no mostraron ningún flagelo. La Tabla 1 resume las observaciones de cambios en el tamaño de las células según la presencia, ausencia y tipo de presa de ASxL5T.
Visualización TEM de ASx5LT: (A) ASx5LT muestra un látigo largo; (B) batería ASx5LT típica; (C) células cocos ASx5LT después de una larga incubación sin nutrientes; (D) un grupo de células ASx5LT muestra anomalía (E) el grupo de células ASx5LT incubadas con presas de Campylobacter mostró una mayor longitud celular en comparación con aquellas sin crecimiento de presas (D) también mostró una estructura apical; (F) Flagelos filamentosos grandes, células ASx5LT, después de la incubación con presas de E. coli; (G) Una única célula ASx5LT después de la incubación con E. coli, que muestra una estructura superior inusual. La barra representa 1 μm.
La determinación de la secuencia del gen 16S rRNA (número de acceso MT636545.1) permite búsquedas en bases de datos para establecer secuencias similares a las de la clase Gammaproteobacteria, y son las más cercanas a las bacterias marinas de la familia Spirillum marino (Figura 2), y son miembros del género Thalassolituus. El pariente más cercano al Marine Bacillus. La secuencia del gen 16S rRNA es claramente diferente de la de las bacterias depredadoras pertenecientes a la familia Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria). Las comparaciones por pares de B. bacteriovorus HD100T (cepa tipo, DSM 50701) y B. bacteriovorus DM11A fueron del 48,4 % y 47,7 %, y para B. exovorus JSS fue del 46,7 %. Las bacterias ASxL5T tienen 3 copias del gen 16S rRNA, dos de las cuales son idénticas entre sí y la tercera está separada por 3 bases. Otros dos aislados de bacterias depredadoras (ASx5S y ASx5O; los números de acceso del gen 16S rRNA son MT636546.1 y MT636547.1, respectivamente) con características morfológicas y fenotípicas similares de la misma ubicación no son iguales, pero son diferentes de ASxL5T y de bacterias no cultivadas. Las secuencias de la base de datos están agrupadas junto con otros géneros en Oceanospirillaceae (Figura 2). La secuencia completa del genoma de ASxL5T se determinó y guardó en la base de datos del NCBI, y el número de acceso es CP046056. El genoma de ASxL5T consta de un cromosoma circular de 2.831.152 pb con una relación G + C del 56,1%. La secuencia del genoma contiene 2653 CDS (total), de los cuales se prevé que 2567 codifiquen proteínas, de las cuales 1596 pueden asignarse como funciones putativas (60,2%). El genoma contiene 67 genes codificadores de ARN, incluidos 9 ARNr (3 de cada uno para 5S, 16S y 23S) y 57 ARNt. Las características genómicas de ASxL5T se compararon con los genomas disponibles de cepas del tipo relativo más cercano identificado a partir de la secuencia del gen 16S rRNA (Tabla 2). Utilice la identidad de aminoácidos (AAI) para comparar todos los genomas de Thalassolituus disponibles con ASxL5T. La secuencia del genoma disponible más cercana (incompleta) determinada por AAI es Thalassolituus sp. C2-1 (agregar NZ_VNIL01000001). Esta cepa fue aislada de los sedimentos de aguas profundas de la Fosa de las Marianas, pero actualmente no hay información fenotípica sobre esta cepa para comparar. En comparación con los 2,82 Mb de ASxL5T, el genoma del organismo es más grande con 4,36 Mb. El tamaño promedio del genoma de las espiroquetas marinas es de aproximadamente 4,16 Mb (± 1,1; n = 92 genomas de referencia completos investigados en https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), por lo que el genoma de ASxL5T está en línea con el orden Comparado con los otros miembros, es bastante pequeño. Utilice GToTree 1.5.54 para generar un árbol filogenético de máxima probabilidad estimado basado en el genoma (Figura 3A), utilizando las secuencias de aminoácidos alineadas y vinculadas de 172 genes de copia única específicos de Gammaproteobacteria 11,12,13,14,15,16. 17, 18. El análisis mostró que está estrechamente relacionado con Thalassolituus, Bacterial Plane y Marine Bacterium. Sin embargo, estos datos indican que ASxL5T es diferente de sus parientes en la espirulina marina y los datos de la secuencia de su genoma están disponibles.
El árbol filogenético que utiliza la secuencia del gen 16S rRNA resalta la posición de las cepas ASxL5T, ASxO5 y ASxS5 (con las tripas) en relación con las cepas de bacterias marinas y no cultivadas en las Spirulinaceae marinas. El número de acceso de Genbank sigue al nombre de la cepa entre paréntesis. Utilice ClustalW para alinear secuencias y utilice el método de máxima verosimilitud y el modelo Tamura-Nei para inferir relaciones filogenéticas y realice 1000 replicaciones guiadas en el programa MEGA X. El número en la rama indica que el valor de copia guiada es superior al 50%. Se utilizó Escherichia coli U/541T como grupo externo.
(A) Un árbol filogenético basado en el genoma, que muestra la relación entre la bacteria marina Spirospiraceae ASxL5T y sus parientes cercanos, E. coli U 5/41T como grupo externo. (B) En comparación con T. oleivorans MIL-1T, la distribución de la categoría funcional de los genes se predice en función del grupo ortólogo (COG) de la proteína ASx5LT. La figura de la izquierda muestra la cantidad de genes en cada categoría funcional COG en cada genoma. El gráfico de la derecha muestra el porcentaje de genomas contenidos en cada grupo COG funcional. (C) En comparación con T. oleiverans MIL-1T, el análisis de la vía modular completa KEGG (Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto) de ASxL5T.
El uso de la base de datos KEGG para examinar los genes componentes presentes en el genoma ASxL5T reveló la vía metabólica típica del gamma Proteus aeróbico. ASxL5T contiene un total de 75 genes asignados a proteínas motoras bacterianas, incluidos genes implicados en la quimiotaxis, el ensamblaje de flagelos y el sistema de fimbrias tipo IV. En la última categoría, 9 de cada 10 genes son responsables del movimiento de contracción de una variedad de otros organismos. El genoma de ASxL5T contiene una ruta biosintética completa de tetrahidropirimidina que participa en la respuesta protectora al estrés osmótico20, como se esperaba para los halófilos. El genoma también contiene muchas vías completas para cofactores y vitaminas, incluidas las vías de síntesis de riboflavina. Aunque el gen de la alcano 1-monooxigenasa (alkB2) está presente en ASxL5T, la vía de utilización de hidrocarburos no está completa. En la secuencia del genoma de ASxL5T, los homólogos de genes identificados como principales responsables de la degradación de hidrocarburos en T. oleiverans MIL-1T21, como TOL_2658 (alkB) y TOL_2772 (alcohol deshidrogenasa), están obviamente ausentes. La Figura 3B muestra la comparación de la distribución de genes en la categoría COG entre ASxL5T y aceite de oliva MIL-1T. En general, el genoma ASxL5T más pequeño contiene proporcionalmente menos genes de cada categoría COG en comparación con el genoma relacionado más grande. Cuando el número de genes en cada categoría funcional se expresa como porcentaje del genoma, se observan diferencias en el porcentaje de genes en las categorías de traducción, estructura ribosómica y biogénesis, y en las categorías de función de conversión y producción de energía, que constituyen el ASxL5T más grande. genoma El porcentaje se compara con el mismo grupo presente en el genoma MIL-1T de T. oleiverans. Por el contrario, en comparación con el genoma ASxL5T, T. oleivorans MIL-1T tiene un mayor porcentaje de genes en las categorías de replicación, recombinación y reparación, y transcripción. Curiosamente, la mayor diferencia en el contenido de cada categoría funcional de los dos genomas es la cantidad de genes desconocidos presentes en ASxL5T (Figura 3B). Se realizó un análisis de enriquecimiento de los módulos KEGG, donde cada módulo KEGG representa un conjunto de unidades funcionales definidas manualmente para la anotación e interpretación biológica de los datos de la secuencia del genoma. La comparación de la distribución de genes en la vía completa del módulo KOG de ASxL5T y oliva MIL-1T se muestra en la Figura 3C. Este análisis muestra que aunque ASxL5T tiene una vía metabólica completa de azufre y nitrógeno, T. oleiverans MIL-1T no la tiene. Por el contrario, T. oleiverans MIL-1T tiene una vía metabólica completa de cisteína y metionina, pero es incompleta en ASxL5T. Por tanto, ASxL5T tiene un módulo característico para la asimilación de sulfatos (definido como un conjunto de genes que pueden usarse como marcadores fenotípicos, como la capacidad metabólica o la patogenicidad; https://www.genome.jp/kegg/module.html) En T . oliverans MIL-1T. Comparar el contenido genético de ASxL5T con la lista de genes que sugieren un estilo de vida depredador no es concluyente. Aunque el gen waaL que codifica la ligasa asociada con el polisacárido del antígeno O al núcleo está presente en el genoma ASxL5T (pero es común en muchas bacterias Gram negativas), los genes de la triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO) pueden incluir los 60 aminoácidos. Regiones ácidas que se encuentran comúnmente en bacterias depredadoras que no están presentes. No hay otros genes característicos depredadores en el genoma ASxL5T, incluidos los que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis de isoprenoides en la vía del mevalonato. Tenga en cuenta que no hay ningún gen regulador transcripcional gntR en el grupo de depredadores examinado, pero se pueden identificar tres genes similares a gntR en ASxL5T.
Las características fenotípicas de ASxL5T se resumen en la Tabla 3 y se comparan con las características fenotípicas de los géneros relacionados 23, 24, 25, 26 y 27 informados en la literatura. Los aislados de T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis y Oceanobacter kriegii son cuerpos en forma de bastoncillos activos, tolerantes a la sal y oxidasa positivos, pero casi no tienen otras características fenotípicas con ASxL5T. El pH promedio del océano es 8,1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77), lo que se refleja en T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis y O. kriegi. ASxL5T es adecuado para el rango de pH más amplio (4-9) típico de especies no marinas. Características fenotípicas de Thalassolituus sp. C2-1. Desconocido. El rango de temperatura de crecimiento de ASxL5T es generalmente más amplio que el de las cepas marinas (4–42 °C), aunque algunos, pero no todos, los aislados de T. marinus son tolerantes al calor. La incapacidad de cultivar ASxL5T en caldo impidió una mayor caracterización fenotípica. Utilice API 20E para probar los materiales raspados de la placa BA, ONPG, arginina dihidrolasa, lisina descarboxilasa, ornitina descarboxilasa, utilización de citrato, ureasa, triptófano desaminasa, enzima de hidrólisis de gelatina, todos los resultados de la prueba fueron negativos, pero no indol, acetoína ni H2S. fueron producidos. Los carbohidratos no fermentados incluyen: glucosa, manosa, inositol, sorbitol, ramnosa, sacarosa, melibiosa, amígdala y arabinosa. En comparación con las cepas de referencia relacionadas publicadas, el perfil de ácidos grasos celulares de la cepa ASxL5T se muestra en la Tabla 4. Los principales ácidos grasos celulares son C16:1ω6c y/o C16:1ω7c, C16:0 y C18:1ω9. También existen ácidos hidroxigrasos C12:0 3-OH y C10:0 3-OH. La proporción de C16:0 en ASxL5T es mayor que el valor informado de géneros relacionados. Por el contrario, en comparación con el T. marinus IMCC1826TT informado, la proporción de C18:1ω7c y/o C18:1ω6c en ASxL5T se reduce. oleivorans MIL-1T y O. kriegii DSM 6294T, pero no detectado en B. sanyensis KCTC 32220T. La comparación de los perfiles de ácidos grasos de ASxL5T y ASxLS reveló diferencias sutiles en la cantidad de ácidos grasos individuales entre las dos cepas, que son consistentes con la secuencia de ADN genómico de la misma especie. No se detectaron partículas de poli-3-hidroxibutirato (PHB) mediante la prueba del negro de Sudán.
Se estudió la actividad depredatoria de las bacterias ASxL5T para determinar la variedad de presas. Esta bacteria puede formar placas en especies de Campylobacter, que incluyen: Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T; Escherichia coli NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; Clari NCTC 11458 y C. upsaliensis NCTC 11541T. Utilice los cultivos enumerados en la sección de determinación del rango de huéspedes del método para analizar una gama más amplia de bacterias Gram negativas y Gram positivas. Los resultados muestran que ASxL5T también se puede utilizar en Escherichia coli NCTC 86 y Citrobacter freundii NCTC 9750T. Se formaron placas en Klebsiella oxytoca 11466. La interacción TEM con E. coli NCTC 86 se muestra en la Figura 4A-D, y la interacción con Campylobacter jejuni PT14 y Campylobacter suis S12 se muestra en la Figura 4E-H central. El mecanismo de ataque parece ser diferente entre los tipos de presas probados, con una o más células de E. coli unidas a cada célula ASxL5T y posicionadas lateralmente a lo largo de la célula extendida antes de la adsorción. Por el contrario, ASxL5T parece unirse a Campylobacter a través de un único punto de contacto, generalmente en contacto con el ápice de la célula depredadora y cerca del ápice de la célula de Campylobacter (Figura 4H).
TEM que muestra la interacción entre ASx5LT y presa: (AD) y presa de E. coli; (EH) y presa de C. jejuni. (A) Una célula ASx5LT típica conectada a una única célula de E. coli (EC); (B) Un ASx5LT filamentoso unido a una única célula EC; (C) Una célula ASx5LT filamentosa conectada a múltiples células EC; (D) Adjunto Células ASx5LT más pequeñas en una sola célula de E. coli (EC); (E) una única célula ASx5LT conectada a una célula Campylobacter jejuni (CJ); (F) ASx5LT ataca a las células de C. hyointestinalis (CH); (G) dos células One ASx5LT atacaron a una célula CJ; (H) Una vista de primer plano del punto de conexión ASx5LT, cerca del vértice de la celda CJ (barra de 0,2 μm). La barra representa 1 μm en (A – G).
Las bacterias depredadoras han evolucionado para aprovechar abundantes fuentes de presas. Obviamente, están ampliamente presentes en muchos entornos diferentes. Debido al reducido tamaño de los miembros de la población, es posible aislar bacterias ASxL5T de la suspensión utilizando el método de separación de fagos. La relevancia genómica de ASxL5T para los miembros de la familia de bacterias marinas oceanospirillaceae es sorprendente, aunque el organismo es tolerante a la sal y puede crecer en un medio que contenga un 5% de sal. El análisis de la calidad del agua de la suspensión mostró que el contenido de cloruro de sodio era inferior al 0,1%. Por lo tanto, el lodo está muy alejado del medio marino, tanto geográfica como químicamente. La presencia de tres aislamientos relacionados pero diferentes de la misma fuente proporciona evidencia de que estos depredadores están prosperando en este ambiente no marino. Además, el análisis del microbioma (archivos de datos disponibles en https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990) mostró que la misma secuencia del gen 16S rRNA se encuentra en los 50 taxones operativos más abundantes (OTU). ) En algunos intervalos de muestreo del lodo. Se encontraron varias bacterias no cultivadas en la base de datos Genbank, que tienen secuencias del gen 16S rRNA similares a las bacterias ASxL5T. Estas secuencias, junto con las secuencias de ASxL5T, ASxS5 y ASxO5, parecen representar diferentes clados separados de Thalassolituus y Oceanobacter (Figura 2). Se aislaron tres tipos de bacterias no cultivadas (GQ921362, GQ921357 y GQ921396) del agua de fisura a una profundidad de 1,3 kilómetros en la mina de oro de Sudáfrica en 2009, y las otras dos (DQ256320 y DQ337006) procedían de aguas subterráneas (también en Sudáfrica). en 2005). La secuencia del gen 16S rRNA más estrechamente relacionada con ASxL5T es parte de la secuencia del gen 16S rRNA obtenida del cultivo de enriquecimiento de sedimentos arenosos obtenidos de las playas del norte de Francia en 2006 (número de acceso AM29240828). Otra secuencia del gen 16S rRNA estrechamente relacionada de la bacteria no cultivada HQ183822.1 se obtuvo de un tanque de recolección lixiviado de un vertedero municipal en China. Obviamente, las bacterias ASxL5T no son muy representativas en las bases de datos taxonómicas, pero es probable que estas secuencias de bacterias no cultivadas representen organismos similares a ASxL5T, que se distribuyen por todo el mundo, generalmente en entornos difíciles. Del análisis filogenético del genoma completo, el pariente más cercano a ASxL5T es Thalassolituus sp. C2-1, T. marinus, T. oleivorans. Y O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus es un miembro de la bacteria marina obligada de fragmentación de hidrocarburos (OHCB), que está muy extendida en ambientes marinos y terrestres, y generalmente se vuelve dominante después de incidentes de contaminación por hidrocarburos30,31. Las bacterias marinas no son miembros del grupo OHCB, pero están aisladas del medio marino.
Los datos fenotípicos indican que ASxL5T es una especie nueva y un miembro de un género previamente no reconocido en la familia de las espirospiráceas marinas. Actualmente no existe un estándar claro para clasificar las cepas recién aisladas en un nuevo género. Se han realizado intentos para determinar los límites universales de los géneros; por ejemplo, basándose en el porcentaje del genoma de una proteína conservadora (POCP), se recomienda que el valor de corte sea 50% idéntico a la cepa de referencia33. Otros sugieren utilizar valores de AAI, que tienen ventajas sobre POCP porque pueden obtenerse a partir de genomas incompletos34. El autor cree que si el valor del AAI es inferior al 74% en comparación con la cepa modelo de la especie modelo, la cepa es representativa de un género diferente. El género modelo de las espirilos marinas es el espirilo marino y la cepa modelo es O. linum ATCC 11336T. El valor de AAI entre ASxL5T y O. linum ATCC 11336T es 54,34%, y el valor de AAI entre ASxL5T y T. oleivorans MIL-1T (cepas tipo género) es 67,61%, lo que indica que ASxL5T representa un nuevo género diferente a Thalassolituus. Utilizando la secuencia del gen 16S rRNA como estándar de clasificación, el límite de delimitación de género sugerido es del 94,5%35. ASxL5T puede ubicarse en el género Thalassolituus, mostrando un 95,03% de identidad de secuencia de ARNr 16S con T. oleivorans MIL-1T y un 96,17%. marinus IMCC1826T. Sin embargo, también se ubicará en el género Bacteroides que tiene una identidad del gen 16S rRNA del 94,64% con B. sanyensis NV9, lo que indica que el uso de un solo gen como el gen 16S rRNA puede conducir a una clasificación y asignación arbitrarias. Otro método sugerido utiliza ANI y Genome Alignment Score (AF) para examinar la agrupación de puntos de datos de todos los tipos y cepas no tipo de géneros existentes. El autor recomienda combinar el límite del género con el punto de inflexión del género estimado específico de los taxones que se analizan. Sin embargo, si no hay suficientes secuencias genómicas completas de los aislados de Thalassolituus, es imposible determinar si ASxL5T pertenece al género Thalassolituus mediante este método. Debido a la disponibilidad limitada de secuencias completas del genoma para su análisis, el árbol filogenético del genoma completo debe interpretarse con precaución. En segundo lugar, los métodos de comparación del genoma completo no pueden explicar diferencias sustanciales en el tamaño de los genomas comparados. Midieron la similitud de genes centrales conservados de copia única entre géneros relacionados, pero no tuvieron en cuenta la gran cantidad de genes que no están presentes en el genoma mucho más pequeño de ASxL5T. Obviamente, ASxL5T y grupos como Thalassolituus, Oceanobacter y Bacterioplanes tienen un ancestro común, pero la evolución ha tomado un camino diferente, lo que ha llevado a una reducción del genoma, que puede deberse a la adaptación a un estilo de vida depredador. Esto contrasta con T. oleivorans MIL-1T, que es un 28 % más grande y ha evolucionado bajo diferentes presiones ambientales para utilizar hidrocarburos23,30. Se puede hacer una comparación interesante con parásitos intracelulares obligados y simbiontes, como Rickettsia, Chlamydia y Buchnera. El tamaño de su genoma es de aproximadamente 1 Mb. La capacidad de utilizar metabolitos de la célula huésped conduce a la pérdida de genes, por lo que sufrió una degradación genómica evolutiva significativa. Los cambios evolutivos desde organismos marinos que se alimentan de nutrientes químicos hasta estilos de vida depredadores pueden dar como resultado una reducción similar en el tamaño del genoma. El análisis COG y KEGG destaca la cantidad de genes utilizados para funciones específicas y las diferencias globales en las vías genómicas entre ASxL5T y T. oleivorans MIL-1T, que no se deben a la disponibilidad generalizada de elementos genéticos móviles. La diferencia en la relación G+C del genoma completo de ASxL5T es del 56,1%, y la de T. oleivorans MIL-1T es del 46,6%, lo que también indica que está segregado.
El examen del contenido codificante del genoma ASxL5T proporciona información funcional sobre las características fenotípicas. La presencia de genes que codifican las fimbrias de tipo IV (Tfp) es de particular interés porque promueven el movimiento celular, llamado deslizamiento social o convulsiones, sin flagelos en la superficie. Según los informes, Tfp tiene otras funciones, incluida la depredación, patogénesis, formación de biopelículas, captación natural de ADN, agregación y desarrollo celular automático38. El genoma ASxL5T contiene 18 genes que codifican la diguanilato ciclasa (una enzima que cataliza la conversión de 2 guanosina trifosfato en guanosina 2 fosfato y diGMP cíclico) y 6 genes que codifican el correspondiente diguanilato de diguanilato ciclasa fosfato. El gen de la esterasa (que cataliza la degradación del di-GMP cíclico a monofosfato de guanosina) es interesante porque el ciclo-di-GMP es un segundo mensajero importante involucrado en el desarrollo y separación de biopelículas, el movimiento, la unión celular y la virulencia 39, 40 en el proceso. También cabe señalar que en Bdellovibrio bacteriovorus se ha demostrado que el doble GMP cíclico controla la transición entre la vida libre y el estilo de vida depredador41.
La mayor parte de la investigación sobre bacterias depredadoras se ha centrado en Bdellovibrio, organismos similares a Bdellovibrio y especies de Myxococcus. Estos y otros ejemplos conocidos de bacterias depredadoras forman un grupo diverso. A pesar de esta diversidad, se han identificado un conjunto de familias de proteínas características que reflejan los fenotipos de 11 bacterias depredadoras conocidas3,22. Sin embargo, sólo se han identificado genes que codifican el antígeno O ligasa (waaL), lo cual es particularmente común en bacterias Gram-negativas. Esta forma de análisis no es útil para designar a ASxL5T como depredador, probablemente porque utiliza una estrategia de ataque novedosa. La disponibilidad de genomas bacterianos depredadores más diversos ayudará a desarrollar análisis de resolución más precisa que tengan en cuenta la evidencia de diferencias funcionales y ambientales entre los miembros del grupo. Ejemplos de bacterias depredadoras no incluidas en este análisis incluyen miembros de Cupriavidus necator42 y Bradymonabacteria43, porque a medida que los investigadores investigan diferentes comunidades microbianas, se establecen más taxones depredadores.
La característica más notable de las bacterias ASxL5T capturadas por imágenes TEM es su morfología única y flexible, que puede promover la interacción con las bacterias presa. El tipo de interacción observada es diferente al de otras bacterias depredadoras y no ha sido descubierta ni reportada previamente. El ciclo de vida depredador ASxL5T propuesto se muestra en la Figura 5. Hay pocos ejemplos en la literatura con estructuras apicales similares a las que informamos aquí, pero estos ejemplos incluyen Terasakiispira papahanaumokuakeensis, una bacteria marina spirillum con agrandamiento ocasional del ápice 44, y Alphaproteobacteria, Terasakiella pusilla. , antiguamente perteneciente al género Oceanospirillum, exhibiendo la llamada "película polar" 45. Las formas cocos se observan a menudo en cultivos más antiguos, especialmente en el caso de bacterias con formas curvas, como Vibrio, Campylobacter y Helicobacter 46, 47, 48, que pueden representar un estado degradado. Es necesario seguir trabajando para aclarar el ciclo de vida preciso de las bacterias ASxL5T. Determinar cómo captura y presa, y si su genoma codifica compuestos biológicamente activos que puedan usarse con fines médicos o biotecnológicos.
Descripción del gen Venatorbacter. Noviembre Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. se compone de venators de L. n. venator,'cazador' y Gr. n. bacter,'una vara'. Venatorbacter,'una vara de caza' Las células son aeróbicas, tolerantes a la sal, tienen tinción de Gram curvada negativa, la actividad de catalasa y oxidasa es positiva en el rango de temperatura de 4 a 42 °C. El rango de pH de 4-9 es inusual. En los caracoles marinos, la mayoría son intolerantes al pH ácido. Los principales ácidos grasos son C16:1ω6c y/o C16:1ω7c, C16:0 y C18:1ω9; y C10:0 3-OH se encuentran como ácidos grasos hidroxi. No crecen en medios de caldo. El contenido de ADN G + C es. 56,1% molar Los miembros de este género muestran resistencia a Campylobacter y el comportamiento de depredación de los miembros de la familia Enterobacteriaceae. La posición filogenética de este género es en la familia.
Descripción de Venatorbacter cucullus sp. Noviembre Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus significa carenado).
Además, la característica descriptiva de este género es que cuando se cultivan en BA o BHI, las células miden 1,63 µm de largo y 0,37 µm de ancho. Las colonias en agar BHI son muy pequeñas y alcanzan 2 mm de diámetro después de 72 horas. Son de color beige, traslúcidos, redondos, convexos y brillantes. Los miembros de esta especie pueden utilizar Escherichia coli y Klebsiella. Campylobacter y varias otras bacterias gramnegativas sirven de presa.
La cepa típica ASxL5T se aisló de la leche de vacuno en Nottinghamshire, Reino Unido, y se depositó en la Colección Nacional de Cultivos Tipo (Reino Unido): número de acceso NCTC 14397 y en la Colección de Cultivos Bacterianos de los Países Bajos (NCCB), número de acceso NCCB 100775. La secuencia completa del genoma de ASxL5T ha sido depositado en Genbank según adición de CP046056.
Las bacterias ASxL5T se aislaron de la leche de res utilizando tecnología de aislamiento de fagos9,49. La suspensión se diluyó 1:9 (p/v) en tampón SM (Tris-HCl 50 mM [pH 7,5], NaCl 0,1 M, MgSO4,7H2O 8 mM y gelatina al 0,01 %; Sigma Aldrich, Gillingham, Reino Unido). Luego se incubó. a 4°C durante 24 horas, rotando lentamente para eluir a los depredadores en el buffer. La suspensión se centrifugó a 3000 g durante 3 minutos. El sobrenadante se recogió y se centrifugó a 13.000 g por segunda vez durante 5 minutos. Luego se pasó el sobrenadante a través de un filtro de membrana de 0,45 µm (Minisart; Sartorius, Gottingen, Alemania) y un filtro de membrana de 0,2 µm (Minisart) para eliminar las células bacterianas restantes. ASxL5T puede pasar estos filtros. Se preparó una capa de agar blando de Campylobacter enterosus S12 (número de acceso del NCBI CP040464) a partir de la misma suspensión utilizando técnicas estándar. La suspensión filtrada se distribuyó en cada una de estas placas de células huésped en gotitas de 10 µl por triplicado y se dejó secar. La placa se incubó en un tanque microaerófilo a 37°C durante 48 horas en condiciones microaeróbicas (5% O2, 5% H2, 10% CO2 y 80% N2). La placa visible obtenida se extrajo en tampón SM y se transfirió al césped fresco de C. hyointestinalis S12 para propagar aún más los organismos lisados. Una vez que se determina que las bacterias son la causa de la placa lítica y no el fago, intente hacer crecer el organismo independientemente del huésped y caracterizarlo más. El cultivo aeróbico se realizó a 37 °C con sangre de caballo desfibrinada al 5% v/v (TCS Biosciences Lt, Buckingham, Reino Unido, suplemento). Según las directrices del Comité Nacional de Normas Clínicas, el método de difusión en disco se utiliza para las pruebas de susceptibilidad a los antibacterianos. Se cultivó agar BHI a 37 °C utilizando un disco que contenía los siguientes antibióticos (Oxoid) para cultivo aeróbico: amoxicilina y ácido clavulánico 30 µg; cefotaxima 30 µg; estreptomicina 10 µg; ciprofloxacina 5 µg; Ceftazidima 30 µg Ácido nalidíxico 30 µg; imipenem 10 µg; Azitromicina 15 µg; Cloranfenicol 30 µg; cefoxitina 30 µg; tetraciclina 30 µg; Nitrofurantoína 300 µg; Aztreonam 30 µg; ampicilina 10 µg; cefpodoxima 10 µg; Trimetoprim-Sulfametoxazol 25 µg. La tolerancia a la sal se estableció mediante incubación aeróbica en placas de agar BHI a 37 °C. Se añadió NaCl adicional a las placas de agar BHI para proporcionar un rango de concentración de hasta el 10 % p/v. El rango de pH se determina mediante cultivo aeróbico en placas de agar BHI a 37 °C, donde el rango de pH se ha ajustado entre 4 y 9 con HCl estéril o NaOH estéril, y el valor de pH objetivo se verifica antes de verter la placa. Para el análisis de ácidos grasos celulares, se cultivó ASxL5T en agar BHI durante 3 días y en condiciones aeróbicas a 37 °C. Según el protocolo estándar MIDI (Sherlock Microbial Identification System, versión 6.10) de FERA Science Ltd, (York, Reino Unido), se extrajeron, prepararon y analizaron los ácidos grasos celulares.
Para TEM, se cultivó ASxL5T en forma aeróbica extendiéndolo uniformemente sobre BA a 37 °C durante 24 horas y luego se recogió en 1 ml de glutaraldehído al 3 % (v/v) en tampón de cacodilato 0,1 M a temperatura ambiente. Se fijó durante 1 hora y luego se centrifugó. a 10.000 g durante 3 minutos. Luego resuspender suavemente el sedimento en 600 l de tampón cacodilato 0,1 M. Transfiera la suspensión ASxL5T fija a la película Formvar/carbono en una rejilla de cobre de malla 200. Las bacterias se tiñeron con acetato de uranilo al 0,5% (p/v) durante 1 minuto y se examinaron mediante TEM utilizando un microscopio TEI Tecnai G2 12 Biotwin. Como se mencionó anteriormente, combine la misma cantidad de presas y depredadores en caldo NZCYM (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) e incube durante 48 horas en condiciones microaeróbicas de Campylobacter o Campylobacter a 37°C. La interacción de depredador y presa También fue examinado por TEM. Condiciones aeróbicas para Escherichia coli. Examine de forma independiente presas y bacterias depredadoras para determinar cualquier cambio en la morfología celular debido a la depredación. Se utilizó el método del negro de Sudán para la microscopía óptica de la acumulación de PHB.
Cultivar cultivos ASxL5T durante la noche untando el crecimiento en placas BHI o BA con un hisopo estéril. Recoger células ASxL5T y suspenderlas en MRD (CM0733, Oxoid) y luego colocarlas a 4 ° C durante 7 días para matar de hambre a las células. El cultivo bacteriano de referencia o de laboratorio del NCTC se inoculó en caldo BHI o caldo nutritivo n.º 2 (CM007, Oxoid), se incubó durante la noche, se centrifugó a 13.000 gy se resuspendió en MRD hasta que la DO600 fue de 0,4. Cultivo: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, Klebsiella oxytoca 11466, Leuconostoc NCTC 10817, Listeria Special bacteria NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, Rhodococcus hamburguesa submarina NCTC 1621T, Salmonella bacteria intestinal Mondeville NCTC 5747, mucílago NCTC 10861, Staphylococcus aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. El huésped Campylobacter se incubó microaeróbicamente en placas BA a 37 °C y se suspendió en caldo NZCYM. Los hospedadores de Campylobacter probados son: C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11458, C. lari NCTC 11458, C. jejuni PT14 , C... Recoge células en MRD, centrifugar a 13.000 gy resuspender en MRD hasta que la DO600 sea 0,4. Agregue una alícuota de 0,5 ml de suspensión a 5 ml de agar superior NZCYM derretido (0,6% de agar) y viértalo en una placa inferior de NZCYM al 1,2%. Después del curado y secado, el ASxL5T diluido en serie se distribuyó en forma de gotas de 20 µl en cada tabla de césped por triplicado. La temperatura y la atmósfera del cultivo dependen de los requisitos de las bacterias de prueba.
Utilice el kit de ADN genómico bacteriano GenElute™ (Sigma Aldridge) para preparar ADN a partir de aislados bacterianos. Se utilizaron métodos estándar para la amplificación por PCR del gen 16S rRNA y la determinación de la secuencia del producto mediante química de terminación con tinte (Eurofins Value Read Service, Alemania). Utilice el programa BLAST-N para comparar estas secuencias con otras secuencias del gen 16S rRNA para identificar y recopilar especies estrechamente relacionadas. Estos se alinean usando ClustalW en el programa MEGA X. El árbol filogenético fue reconstruido mediante MEGA X mediante el método de máxima verosimilitud basado en el modelo Tamura-Nei, con 1000 copias guiadas54. Utilice el kit de ADN genómico PureLink™ (Fisher Scientific, Loughborough, Reino Unido) para extraer ADN para la secuenciación del genoma completo. La secuencia del genoma de ASxL5T se determinó utilizando la combinación Illumina MiSeq, que consta de lecturas de doble extremo de 250 pb compuestas por una biblioteca preparada con el kit de etiquetado Nextera y lecturas de 2 a 20 kb de longitud de la plataforma PacBio. Centro de investigación de secuenciación de ADN genómico de la Universidad de Sembia. El genoma se ensambló utilizando CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen, Aarhus, Dinamarca). Los cultivos ASxL5T se depositan en la Colección Nacional de Cultivos Tipo (Reino Unido) y en la Colección de Cultivos Bacterianos de los Países Bajos (NCCB). Los genomas de organismos relacionados utilizados para comparación son: Thalassolituus oleivorans MIL-1T (número de acceso HF680312, completo); Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (número de acceso BMYY01000001, incompleto); Oceanobacter kriegii DSM 6294T (número de acceso NZ_AUGV00000000, incompleto); Comunidad Marinamonas DSM 5604T (agregado ASM436330v1, incompleto), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (agregado MTSD02000001, incompleto) y Thalassolituus sp. C2-1 (agregar NZ_VNIL01000001, incompleto). Utilice JGI Genome Portal36 en https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page= para determinar la puntuación de alineación (AF) y la identidad promedio de ácido nucleico (ANI). En parejas. Se utilizó el método de Rodriguez-R & Konstantinidis55 para determinar la identidad de aminoácidos (AAI). Utilice GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 para generar un árbol filogenético de máxima probabilidad estimado. El genoma de entrada que representa el genoma de referencia disponible se selecciona de géneros de referencia identificados como relacionados con ASxL5T de la filogenia del ARNr 16S. Anotó el árbol utilizando la herramienta interactiva en línea del árbol de la vida (https://itol.embl.de/). La anotación funcional y el análisis del genoma ASxL5T se llevan a cabo utilizando la herramienta en línea BlastKOALA KEGG utilizando la distribución de enriquecimiento del módulo KEGG (Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto). La distribución de las categorías COG (grupos ortólogos) se determina utilizando la herramienta en línea eggNOG-mapper.
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