نوع جدیدی از باکتری های گرم منفی، هوازی، مقاوم به نمک، فعال، میله ای شکل و شکارگر ASxL5T از یک حوضچه مدفوع گاوی در ناتینگهام شایر انگلستان جدا شد و از کمپیلوباکتر به عنوان طعمه خود استفاده کرد. پس از آن، گونه های دیگر کمپیلوباکتر و اعضای خانواده انتروباکتریاسه به عنوان طعمه کشف شدند. پس از کشت بدون سلول‌های میزبان، رشد آسپتیک ضعیفی روی Brain Heart Infusion Agar حاصل شد. شرایط بهینه رشد 37 درجه سانتیگراد و pH برابر با 7 است. میکروسکوپ الکترونی عبوری برخی از ویژگی‌های مورفولوژیکی بسیار غیرعادی مربوط به در دسترس بودن طعمه را نشان داد. تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک با استفاده از توالی ژن 16S rRNA نشان داد که ایزوله مربوط به عضوی از خانواده Spirulina دریایی است، اما نمی تواند به وضوح به عنوان عضوی از هیچ جنس شناخته شده طبقه بندی شود. توالی یابی کل ژنوم ASxL5T ارتباط با اعضای اسپیروکت های دریایی را تایید کرد. جستجوی پایگاه داده نشان داد که چندین ASxL5T توالی های ژن 16S rRNA را با چندین باکتری کشت نشده از اقیانوس، سطح زمین و آب های زیرزمینی به اشتراک می گذارند. ما پیشنهاد می کنیم که سویه ASxL5T یک گونه جدید در یک جنس جدید را نشان می دهد. ما نام Venatorbacter cucullus gen را توصیه می کنیم. نوامبر، sp. در ماه نوامبر، ASxL5T به عنوان سویه نوع استفاده شد.
باکتری های شکارچی باکتری هایی هستند که توانایی شکار و کشتن سایر باکتری های زنده را برای به دست آوردن مواد و انرژی بیوسنتزی از خود نشان می دهند. این با بازیابی کلی مواد مغذی از میکروارگانیسم‌های مرده متفاوت است و همچنین با فعل و انفعالات انگلی که در آن باکتری‌ها بدون کشتن آن‌ها رابطه نزدیکی با میزبان خود برقرار می‌کنند، متفاوت است. باکتری های شکارچی چرخه های زندگی متفاوتی را تکامل داده اند تا از منابع غذایی فراوان در طاقچه هایی که در آن یافت می شوند (مانند زیستگاه های دریایی) استفاده کنند. آنها یک گروه از نظر طبقه بندی متنوع هستند که فقط توسط چرخه زندگی عقیم سازی منحصر به فرد خود به یکدیگر متصل می شوند. نمونه‌هایی از باکتری‌های شکارگر در چندین شاخه مختلف یافت شده‌اند، از جمله: Proteobacteria، Bacteroides، و Chlorella.3. با این حال، باکتری های شکارچی که به خوبی مورد مطالعه قرار گرفته اند، موجودات بدلوویبریو و بدلوویبریو و مشابه (BALOs4) هستند. باکتری های شکارچی منبع امیدوار کننده ای از ترکیبات فعال بیولوژیکی جدید و عوامل ضد باکتری هستند.
اعتقاد بر این است که باکتری های شکارچی تنوع میکروبی را افزایش می دهند و تأثیر مثبتی بر سلامت، بهره وری و ثبات اکوسیستم دارند. علی‌رغم این ویژگی‌های مثبت، به دلیل دشواری کشت باکتری‌ها و نیاز به مشاهده دقیق فعل و انفعالات سلولی برای درک چرخه زندگی پیچیده آنها، مطالعات کمی در مورد باکتری‌های شکارگر جدید وجود دارد. به دست آوردن این اطلاعات از تجزیه و تحلیل کامپیوتری آسان نیست.
در عصر افزایش مقاومت ضد میکروبی، استراتژی‌های جدیدی برای هدف قرار دادن پاتوژن‌های باکتریایی مانند استفاده از باکتریوفاژها و باکتری‌های شکارگر در حال مطالعه است. باکتری ASxL5T در سال 2019 با استفاده از فناوری جداسازی فاژ از فضولات گاو جمع‌آوری‌شده از مرکز لبنیات دانشگاه ناتینگهام، ناتینگهام‌شایر جدا شد. هدف از این تحقیق جداسازی موجودات با پتانسیل به عنوان عوامل کنترل بیولوژیکی است. کمپیلوباکتر هیوینستینالیس یک پاتوژن مشترک بین انسان و دام است که به طور فزاینده ای با بیماری های روده انسان در ارتباط است. در سرم همه جا وجود دارد و به عنوان میزبان هدف استفاده می شود.
باکتری ASxL5T از ژله گوشت گاو جدا شد، زیرا مشاهده شد که پلاک هایی که در چمن C. hyointestinalis ایجاد می کند شبیه به پلاک های تولید شده توسط باکتریوفاژها است. این یک یافته غیرمنتظره است، زیرا بخشی از فرآیند جداسازی فاژ شامل فیلتر کردن از طریق فیلتر 0.2 میکرومتری است که برای حذف سلول های باکتریایی طراحی شده است. بررسی میکروسکوپی مواد استخراج‌شده از پلاک نشان داد که باکتری‌های کوچک گرم منفی میله‌ای شکل، پلی هیدروکسی بوتیرات (PHB) را تجمع نمی‌کنند. کشت آسپتیک مستقل از سلول های طعمه روی محیط جامد غنی (مانند انفوزیون قلب مغزی آگار (BHI) و خون آگار (BA)) انجام می شود و رشد آن ضعیف است. پس از اصلاح زیر کشت با تلقیح سنگین بدست می آید. در شرایط میکروهوازی (7% حجم اکسیژن) و اکسیژن اتمسفر به همان اندازه خوب رشد می کند، اما نه در جو بی هوازی. بعد از 72 ساعت قطر کلنی بسیار کوچک بود و به 2 میلی متر می رسید و به رنگ بژ، نیمه شفاف، گرد، محدب و براق بود. آزمایش استاندارد بیوشیمیایی با مشکل مواجه می شود زیرا ASxL5T نمی تواند به طور قابل اعتماد در محیط مایع کشت شود، که نشان می دهد ممکن است به چرخه زندگی پیچیده تشکیل بیوفیلم متکی باشد. با این حال، سوسپانسیون صفحه نشان داد که ASxL5T هوازی است، برای اکسیداز و کاتالاز مثبت است و می تواند 5٪ NaCl را تحمل کند. ASxL5T به 10 میکروگرم استرپتومایسین مقاوم است، اما به سایر آنتی بیوتیک های آزمایش شده حساس است. سلول های باکتریایی ASxL5T توسط TEM مورد بررسی قرار گرفتند (شکل 1). هنگامی که سلول‌های ASxL5T بدون سلول‌های طعمه روی BA رشد می‌کنند، کمپیلوباکتر کوچک هستند، با طول متوسط ​​1.63 میکرومتر (0.4 ±)، عرض 0.37 میکرومتر (0.08 ±) و یک قطب منفرد طولانی (تا 5 میکرومتر). تاژک های جنسی. تقریباً 1.6 درصد از سلول‌ها دارای عرض کمتر از 0.2 میکرومتر هستند که امکان عبور از دستگاه فیلتر را فراهم می‌کند. یک امتداد ساختاری غیرمعمول در بالای برخی از سلول‌ها مشاهده شد، شبیه به فیرینگ (کوکولوس لاتین) (به فلش‌های 1D، E، G مراجعه کنید). به نظر می رسد که از غشای خارجی اضافی تشکیل شده است، که ممکن است به دلیل کاهش سریع اندازه پوشش پری پلاسمیک باشد، در حالی که غشای خارجی دست نخورده باقی می ماند و ظاهری "شل" نشان می دهد. کشت ASxL5T در غیاب مواد مغذی (در PBS) برای مدت طولانی در دمای 4 درجه سانتیگراد منجر به این شد که اکثر سلولها (اما نه همه) مورفولوژی کوکسی را نشان دهند (شکل 1C). هنگامی که ASxL5T با کمپیلوباکتر ژژونی به عنوان طعمه به مدت 48 ساعت رشد می کند، متوسط ​​اندازه سلول به طور قابل توجهی طولانی تر و باریک تر از سلول هایی است که بدون میزبان رشد می کنند (جدول 1 و شکل 1E). در مقابل، هنگامی که ASxL5T با E. coli به عنوان طعمه به مدت 48 ساعت رشد می کند، اندازه سلول متوسط ​​طولانی تر و گسترده تر از زمانی است که بدون شکار رشد می کند (جدول 1)، و طول سلول متغیر است، معمولا رشته ای را نشان می دهد (شکل 1F). هنگامی که با Campylobacter jejuni یا E. coli به عنوان طعمه به مدت 48 ساعت انکوبه شدند، سلول‌های ASxL5T هیچ تاژکی را نشان ندادند. جدول 1 مشاهدات تغییرات اندازه سلول را بر اساس وجود، عدم حضور و نوع طعمه ASxL5T خلاصه می کند.
صفحه نمایش TEM ASx5LT: (الف) ASx5LT شلاق طولانی را نشان می دهد. (ب) باتری معمولی ASx5LT؛ (C) سلول های کوکسی ASx5LT پس از انکوباسیون طولانی بدون مواد مغذی. (D) گروهی از سلول‌های ASx5LT ناهنجاری را نشان می‌دهند (E) گروه سلولی ASx5LT انکوبه‌شده با طعمه کمپیلوباکتر طول سلولی را در مقایسه با آن‌هایی که رشد طعمه نداشتند افزایش یافته است (D) همچنین ساختار آپیکالی را نشان داد. (F) تاژک های رشته ای بزرگ، سلول های ASx5LT، پس از انکوباسیون با طعمه E. coli. (G) یک سلول ASx5LT منفرد پس از انکوباسیون با E. coli، که ساختار بالایی غیرمعمول را نشان می‌دهد. نوار نشان دهنده 1 میکرومتر است.
تعیین توالی ژن 16S rRNA (شماره دسترسی MT636545.1) جستجوهای پایگاه داده را قادر می‌سازد تا توالی‌هایی مشابه آنهایی که در کلاس Gammaproteobacteria قرار دارند ایجاد کنند و نزدیک‌ترین آنها به باکتری‌های دریایی در خانواده اسپیریلوم دریایی هستند (شکل 2) و اعضای خانواده Thalassolituus هستند. نزدیک ترین خویشاوند به باسیلوس دریایی. توالی ژن 16S rRNA به وضوح با باکتری های شکارچی متعلق به خانواده Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria) متفاوت است. مقایسه زوجی B. bacteriovorus HD100T (نوع سویه، DSM 50701) و B. bacteriovorus DM11A 48.4٪ و 47.7٪ و برای B. exovorus JSS 46.7٪ بود. باکتری ASxL5T دارای 3 نسخه از ژن 16S rRNA است که دو نسخه از آن ها با یکدیگر یکسان هستند و نسخه سوم با 3 باز فاصله دارد. دو جدایه باکتری شکارگر دیگر (ASx5S و ASx5O؛ شماره های الحاق ژن 16S rRNA به ترتیب MT636546.1 و MT636547.1 هستند) با خصوصیات مورفولوژیکی و فنوتیپی مشابه از یک مکان یکسان نیستند، اما با ASxL5T و غیر کشت متفاوت هستند. توالی های پایگاه داده با سایر جنس ها در خوشه بندی می شوند Oceanospirillaceae (شکل 2). کل توالی ژنوم ASxL5T تعیین و در پایگاه داده NCBI ذخیره شده است و شماره دسترسی CP046056 است. ژنوم ASxL5T از یک کروموزوم دایره ای 2,831,152 جفت باز با نسبت G + C 56.1٪ تشکیل شده است. توالی ژنوم حاوی 2653 CDS (مجموع) است که از این تعداد 2567 برای کدگذاری پروتئین ها پیش بینی می شود که 1596 مورد آن را می توان به عنوان توابع فرضی (60.2٪) اختصاص داد. ژنوم شامل 67 ژن کدکننده RNA، شامل 9 rRNA (هر کدام 3 برای 5S، 16S و 23S) و 57 tRNA است. ویژگی های ژنومی ASxL5T با ژنوم های موجود سویه های نزدیک ترین نوع نسبی شناسایی شده از توالی ژن 16S rRNA مقایسه شد (جدول 2). از هویت اسید آمینه (AAI) برای مقایسه تمام ژنوم های موجود تالاسولیتووس با ASxL5T استفاده کنید. نزدیکترین توالی ژنوم موجود (ناقص) تعیین شده توسط AAI Thalassolituus sp است. C2-1 (NZ_VNIL01000001 را اضافه کنید). این سویه از رسوبات اعماق دریای ترانشه ماریانا جدا شد، اما در حال حاضر هیچ اطلاعات فنوتیپی در مورد این سویه برای مقایسه وجود ندارد. در مقایسه با 2.82 مگابایت ASxL5T، ژنوم ارگانیسم بزرگتر و 4.36 مگابایت است. میانگین اندازه ژنوم اسپیروکت‌های دریایی حدود 4.16 مگابایت (1.1 ± n = 92 ژنوم مرجع کامل بررسی شده از https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly) است، بنابراین ژنوم ASxL5T مطابق با سفارش در مقایسه با سایر اعضا، بسیار کوچک است. از GToTree 1.5.54 برای تولید درخت فیلوژنتیک حداکثر احتمال تخمینی مبتنی بر ژنوم (شکل 3A)، با استفاده از توالی اسید آمینه تراز و مرتبط 172 ژن تک کپی مخصوص گاماپروتئوباکتری 11،12،13،14،15،16، استفاده کنید. 17،18. تجزیه و تحلیل نشان داد که ارتباط نزدیکی با تالاسولیتووس، هواپیمای باکتریایی و باکتری دریایی دارد. با این حال، این داده ها نشان می دهد که ASxL5T با بستگان خود در Spirulina دریایی متفاوت است و داده های توالی ژنوم آن در دسترس است.
درخت فیلوژنتیک با استفاده از توالی ژن 16S rRNA موقعیت سویه های ASxL5T، ASxO5 و ASxS5 (با روده) را نسبت به سویه های باکتری های کشت نشده و دریایی در Spirulinaceae دریایی برجسته می کند. شماره دسترسی Genbank از نام سویه در پرانتز پیروی می کند. از ClustalW برای تراز کردن توالی ها استفاده کنید و از روش حداکثر درستنمایی و مدل Tamura-Nei برای استنتاج روابط فیلوژنتیکی استفاده کنید و 1000 تکرار هدایت شده را در برنامه MEGA X انجام دهید. عدد روی شاخه نشان می دهد که مقدار کپی هدایت شده بیشتر از 50٪ است. اشرشیاکلی U/541T به عنوان یک گروه برون گروهی استفاده شد.
(الف) یک درخت فیلوژنتیک بر اساس ژنوم، که رابطه بین باکتری Spirospiraceae دریایی ASxL5T و خویشاوندان نزدیک آن، E. coli U 5/41T را به عنوان یک گروه برون‌گروه نشان می‌دهد. (B) در مقایسه با T. oleivorans MIL-1T، توزیع دسته عملکردی ژن‌ها بر اساس گروه ارتولوگ (COG) از پروتئین ASx5LT پیش‌بینی می‌شود. شکل سمت چپ تعداد ژن ها را در هر دسته COG عملکردی در هر ژنوم نشان می دهد. نمودار سمت راست درصد ژنوم های موجود در هر گروه COG عملکردی را نشان می دهد. (C) در مقایسه با T. oleiverans MIL-1T، تجزیه و تحلیل مسیر مدولار KEGG کامل (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) ASxL5T.
استفاده از پایگاه داده KEGG برای بررسی ژن های جزء موجود در ژنوم ASxL5T مسیر متابولیک معمولی پروتئوس گاما هوازی را نشان داد. ASxL5T در مجموع شامل 75 ژن است که به پروتئین های حرکتی باکتریایی اختصاص داده شده اند، از جمله ژن های دخیل در کموتاکسی، مونتاژ تاژک ها و سیستم فیمبریای نوع IV. در دسته آخر، 9 ژن از 10 ژن مسئول حرکت انقباض طیفی از موجودات دیگر هستند. ژنوم ASxL5T حاوی یک مسیر بیوسنتزی کامل تتراهیدروپیریمیدین است که همانطور که برای هالوفیل ها انتظار می رود در پاسخ محافظتی به استرس اسمزی شرکت می کند. ژنوم همچنین شامل بسیاری از مسیرهای کامل برای کوفاکتورها و ویتامین ها از جمله مسیرهای سنتز ریبوفلاوین است. اگرچه ژن alkane 1-monooxygenase (alkB2) در ASxL5T وجود دارد، مسیر استفاده از هیدروکربن کامل نیست. در توالی ژنوم ASxL5T، همولوگ‌های ژن‌هایی که عمدتاً مسئول تخریب هیدروکربن‌ها در T. oleiverans MIL-1T21 هستند، مانند TOL_2658 (alkB) و TOL_2772 (الکل دهیدروژناز) آشکارا وجود ندارند. شکل 3B مقایسه توزیع ژن در دسته COG را بین ASxL5T و روغن زیتون MIL-1T نشان می دهد. به طور کلی، ژنوم کوچکتر ASxL5T حاوی ژن های کمتری از هر دسته COG در مقایسه با ژنوم بزرگتر مرتبط است. وقتی تعداد ژن‌ها در هر دسته عملکردی به صورت درصدی از ژنوم بیان می‌شود، تفاوت‌هایی در درصد ژن‌ها در دسته‌های ترجمه، ساختار ریبوزومی و بیوژنز و دسته‌های تابع تولید و تبدیل انرژی که ASxL5T بزرگ‌تر را تشکیل می‌دهند، مشخص می‌شود. ژنوم این درصد با همان گروه موجود در ژنوم MIL-1T T. oleiverans مقایسه می شود. در مقابل، در مقایسه با ژنوم ASxL5T، T. oleivorans MIL-1T دارای درصد بالاتری از ژن ها در دسته های همانندسازی، نوترکیبی و تعمیر و رونویسی است. جالب توجه است، بزرگترین تفاوت در محتوای هر دسته عملکردی از دو ژنوم، تعداد ژن‌های ناشناخته موجود در ASxL5T است (شکل 3B). تجزیه و تحلیل غنی‌سازی ماژول‌های KEGG انجام شد، که در آن هر ماژول KEGG مجموعه‌ای از واحدهای عملکردی تعریف‌شده دستی برای حاشیه‌نویسی و تفسیر بیولوژیکی داده‌های توالی ژنوم را نشان می‌دهد. مقایسه توزیع ژن در مسیر کامل ماژول KOG ASxL5T و زیتون MIL-1T در شکل 3C نشان داده شده است. این تجزیه و تحلیل نشان می دهد که اگرچه ASxL5T دارای مسیر متابولیک کامل گوگرد و نیتروژن است، T. oleiverans MIL-1T ندارد. در مقابل، T. oleiverans MIL-1T یک مسیر متابولیک سیستئین و متیونین کامل دارد، اما در ASxL5T ناقص است. بنابراین، ASxL5T دارای یک ماژول مشخصه برای جذب سولفات است (تعریف شده به عنوان مجموعه ای از ژن ها که می توانند به عنوان نشانگرهای فنوتیپی، مانند ظرفیت متابولیک یا بیماری زایی استفاده شوند؛ https://www.genome.jp/kegg/module.html) در T oleiverans MIL-1T. مقایسه محتوای ژنی ASxL5T با لیستی از ژن‌هایی که سبک زندگی درنده را نشان می‌دهند بی‌نتیجه است. اگرچه ژن waaL که لیگاز مرتبط با پلی ساکارید آنتی ژن O به هسته را کد می کند در ژنوم ASxL5T وجود دارد (اما در بسیاری از باکتری های گرم منفی رایج است)، ژن های تریپتوفان 2،3-دیاکسیژناز (TDO) ممکن است شامل 60 آمینو باشند. نواحی اسیدی که معمولاً در باکتری های شکارچی یافت می شوند که وجود ندارند. هیچ ژن مشخصه شکارچی دیگری در ژنوم ASxL5T وجود ندارد، از جمله آنزیم هایی که کد کننده آنزیم های دخیل در بیوسنتز ایزوپرنوئید در مسیر موالونات هستند. توجه داشته باشید که هیچ ژن تنظیم کننده رونویسی gntR در گروه شکارچی مورد بررسی وجود ندارد، اما سه ژن شبیه gntR را می توان در ASxL5T شناسایی کرد.
ویژگی های فنوتیپی ASxL5T در جدول 3 خلاصه شده و با ویژگی های فنوتیپی جنس های مرتبط 23، 24، 25، 26 و 27 گزارش شده در ادبیات مقایسه شده است. جدا شده از T. marinus، T. olevorans، B. sanyensis و Oceanobacter kriegii اجسام میله ای شکل فعال، مقاوم به نمک و اکسیداز مثبت هستند، اما تقریباً هیچ ویژگی فنوتیپی دیگری با ASxL5T ندارند. میانگین pH اقیانوس 8.1 است (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77) که در T. marinus، T. olevorans، B. sanyensis و O منعکس شده است. kriegii. ASxL5T برای محدوده pH بزرگتر (4-9) معمولی گونه های غیر دریایی مناسب است. خصوصیات فنوتیپی Thalassolituus sp. C2-1. ناشناس. دامنه دمای رشد ASxL5T عموماً وسیع‌تر از سویه‌های دریایی (4-42 درجه سانتی‌گراد) است، اگرچه برخی از جدایه‌های T. marinus به گرما متحمل نیستند اما نه همه. ناتوانی در رشد ASxL5T در محیط های براث مانع از شناسایی بیشتر فنوتیپی شد. از API 20E برای آزمایش مواد خراشیده شده از صفحه BA، ONPG، آرژنین دی هیدرولاز، لیزین دکربوکسیلاز، اورنیتین دکربوکسیلاز، استفاده از سیترات، اوره آز، تریپتوفان دآمیناز، آنزیم هیدرولیز ژلاتین استفاده کنید، نتایج آزمایش همه منفی بود، اما ایندول و H2S تواس وجود نداشت تولید شدند. کربوهیدرات های تخمیر نشده عبارتند از: گلوکز، مانوز، اینوزیتول، سوربیتول، رامنوز، ساکارز، ملیبیوز، آمیگدالین و آرابینوز. در مقایسه با سویه های مرجع مرتبط منتشر شده، پروفایل اسیدهای چرب سلولی سویه ASxL5T در جدول 4 نشان داده شده است. اسیدهای چرب سلولی اصلی عبارتند از C16:1ω6c و/یا C16:1ω7c، C16:0 و C18:1ω9. اسیدهای چرب هیدروکسی C12:0 3-OH و C10:0 3-OH نیز وجود دارند. نسبت C16:0 در ASxL5T بالاتر از مقدار گزارش شده جنس های مرتبط است. در مقابل، در مقایسه با T. marinus IMCC1826TT گزارش شده، نسبت C18:1ω7c و/یا C18:1ω6c در ASxL5T کاهش می یابد. oleivorans MIL-1T و O. kriegii DSM 6294T، اما در B. sanyensis KCTC 32220T شناسایی نشد. مقایسه پروفایل اسیدهای چرب ASxL5T و ASxLS تفاوت های ظریفی را در میزان اسیدهای چرب منفرد بین دو سویه نشان داد که با توالی DNA ژنومی همان گونه سازگار است. با استفاده از تست سیاه سودان، هیچ ذره پلی 3 هیدروکسی بوتیرات (PHB) شناسایی نشد.
فعالیت شکارگری باکتری ASxL5T برای تعیین محدوده طعمه مورد مطالعه قرار گرفت. این باکتری می تواند روی گونه های کمپیلوباکتر پلاک ایجاد کند، از جمله: Campylobacter suis 11608T، Campylobacter jejuni PT14، Campylobacter jejuni 12662، Campylobacter jejuni NCTC 11168T; اشرشیاکلی NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; C لاری NCTC 11458 و C. upsaliensis NCTC 11541T. از کشت های فهرست شده در بخش تعیین محدوده میزبان روش برای آزمایش طیف وسیع تری از باکتری های گرم منفی و گرم مثبت استفاده کنید. نتایج نشان می دهد که ASxL5T می تواند در اشریشیا کلی NCTC 86 و Citrobacter freundii NCTC 9750T نیز استفاده شود. پلاک های تشکیل شده روی کلبسیلا اکسیتوکا ​​11466. برهمکنش TEM با E. coli NCTC 86 در شکل 4A-D نشان داده شده است، و برهمکنش با Campylobacter jejuni PT14 و Campylobacter suis S12 در شکل 4E-H وسط نشان داده شده است. به نظر می رسد مکانیسم حمله بین انواع طعمه های آزمایش شده متفاوت است، با یک یا چند سلول E. coli به هر سلول ASxL5T متصل شده و قبل از جذب در امتداد سلول توسعه یافته قرار گرفته اند. در مقابل، به نظر می رسد ASxL5T از طریق یک نقطه تماس به کمپیلوباکتر متصل می شود، معمولاً در تماس با راس سلول شکارچی و نزدیک به راس سلول کمپیلوباکتر (شکل 4H).
TEM نشان دهنده تعامل بین ASx5LT و طعمه: (AD) و E. coli طعمه. (EH) و طعمه C. jejuni. (الف) یک سلول ASx5LT معمولی متصل به یک سلول E. coli (EC). (ب) یک ASx5LT رشته ای متصل به یک سلول EC منفرد. (C) یک سلول رشته ای ASx5LT متصل به چندین سلول EC. (D) اتصال سلول های کوچکتر ASx5LT روی یک سلول E. coli (EC). (E) یک سلول ASx5LT منفرد متصل به یک سلول کمپیلوباکتر ژژونی (CJ). (F) ASx5LT به سلول های C. hyointestinalis (CH) حمله می کند. (ز) دو سلول One ASx5LT به یک سلول CJ حمله کردند. (H) نمای نزدیک از نقطه اتصال ASx5LT، نزدیک به راس سلول CJ (نوار 0.2 میکرومتر). نوار نشان دهنده 1 میکرومتر در (A-G) است.
باکتری های شکارچی تکامل یافته اند تا از منابع فراوان طعمه بهره ببرند. بدیهی است که آنها به طور گسترده در محیط های مختلف وجود دارند. با توجه به اندازه باریک اعضای جمعیت، امکان جداسازی باکتری ASxL5T از دوغاب با استفاده از روش جداسازی فاژ وجود دارد. ارتباط ژنومی ASxL5T با اعضای خانواده باکتری‌های دریایی oceanospirillaceae شگفت‌انگیز است، اگرچه این ارگانیسم به نمک مقاوم است و می‌تواند در محیطی حاوی 5٪ نمک رشد کند. تجزیه و تحلیل کیفیت آب دوغاب نشان داد که محتوای کلرید سدیم کمتر از 0.1٪ است. بنابراین، گل و لای هم از نظر جغرافیایی و هم از نظر شیمیایی از محیط دریایی بسیار دور است. وجود سه جدایه مرتبط اما متفاوت از یک منبع شواهدی را نشان می دهد که این شکارچیان در این محیط غیر دریایی رشد می کنند. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل میکروبیوم (فایل های داده موجود از https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990) نشان داد که همان توالی ژن 16S rRNA در 50 تاکسون عملیاتی برتر (OTU) قرار دارد. ) در چند فواصل نمونه برداری از گل. چندین باکتری کشت نشده در پایگاه داده Genbank یافت شد که دارای توالی ژن 16S rRNA مشابه باکتری ASxL5T است. به نظر می‌رسد این توالی‌ها همراه با توالی‌های ASxL5T، ASxS5 و ASxO5، کلادهای مختلف جدا شده از تالاسولیتووس و اقیانوس‌باکتر را نشان می‌دهند (شکل 2). سه نوع باکتری کشت‌نشده (GQ921362، GQ921357 و GQ921396) از آب شکاف در عمق 1.3 کیلومتری معدن طلای آفریقای جنوبی در سال 2009، و دو نوع دیگر (DQ256320 و DQ337006 از آفریقای جنوبی (از آفریقای جنوبی) جدا شدند. در سال 2005). توالی ژن 16S rRNA که بیشترین ارتباط را با ASxL5T دارد بخشی از توالی ژن 16S rRNA است که از فرهنگ غنی‌سازی رسوبات شنی به‌دست‌آمده از سواحل شمال فرانسه در سال 2006 (شماره دسترسی AM29240828) به دست آمده است. توالی ژن 16S rRNA نزدیک دیگر از باکتری کشت نشده HQ183822.1 از یک مخزن جمع آوری شسته شده از یک محل دفن زباله شهری در چین به دست آمد. بدیهی است که باکتری‌های ASxL5T در پایگاه‌های داده طبقه‌بندی چندان نماینده نیستند، اما این توالی‌ها از باکتری‌های کشت‌نشده احتمالاً ارگانیسم‌هایی شبیه به ASxL5T را نشان می‌دهند که در سراسر جهان معمولاً در محیط‌های چالش‌برانگیز توزیع شده‌اند. از کل آنالیز فیلوژنتیکی ژنوم، نزدیکترین نسبت به ASxL5T Thalassolituus sp است. C2-1، T. marinus، T. oleivorans. و O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus عضوی از باکتری های تکه تکه شدن هیدروکربن های اجباری دریایی (OHCB) است که در محیط های دریایی و خشکی گسترده است و معمولاً پس از حوادث آلودگی هیدروکربنی غالب می شود30،31. باکتری های دریایی از اعضای گروه OHCB نیستند، اما از محیط های دریایی جدا شده اند.
داده های فنوتیپی نشان می دهد که ASxL5T یک گونه جدید و عضوی از یک جنس ناشناخته قبلی در خانواده spirospiraceae دریایی است. در حال حاضر هیچ استاندارد روشنی برای طبقه بندی سویه های تازه جدا شده به یک جنس جدید وجود ندارد. تلاش هایی برای تعیین مرزهای جنس جهانی انجام شده است، به عنوان مثال، بر اساس درصد ژنوم یک پروتئین محافظه کار (POCP)، توصیه می شود که مقدار برش 50٪ با سویه مرجع 33 یکسان باشد. برخی دیگر استفاده از مقادیر AAI را پیشنهاد می‌کنند که مزایایی نسبت به POCP دارند، زیرا می‌توان آن‌ها را از ژنوم‌های ناقص به‌دست آورد. نویسنده معتقد است که اگر مقدار AAI در مقایسه با سویه مدل گونه مدل کمتر از 74٪ باشد، سویه نماینده یک جنس متفاوت است. جنس مدل در spirillaceae دریایی، spirillum دریایی، و سویه مدل O. linum ATCC 11336T است. مقدار AAI بین ASxL5T و O. linum ATCC 11336T 54.34٪ است، و مقدار AAI بین ASxL5T و T. oleivorans MIL-1T (سویه های نوع جنس) 67.61٪ است که نشان می دهد ASxL5T یک جنس جدید متفاوت از Thalas است. با استفاده از توالی ژن 16S rRNA به عنوان استاندارد طبقه بندی، مرز تعیین حدود جنس پیشنهادی 94.5٪ 35 است. ASxL5T ممکن است در جنس Thalassolituus قرار گیرد، که 95.03٪ هویت توالی 16S rRNA را با T. oleivorans MIL-1T و 96.17٪ نشان می دهد. مارینوس IMCC1826T. با این حال، همچنین در جنس Bacteroides قرار می گیرد که دارای 94.64٪ هویت ژن 16S rRNA با B. sanyensis NV9 است، که نشان می دهد استفاده از یک ژن منفرد مانند ژن 16S rRNA می تواند منجر به طبقه بندی و تخصیص دلخواه شود. روش پیشنهادی دیگر از ANI و امتیاز همترازی ژنوم (AF) برای بررسی خوشه‌بندی نقاط داده از همه انواع و سویه‌های غیر نوع از جنس‌های موجود استفاده می‌کند. نویسنده توصیه می کند که مرز جنس را با نقطه عطف جنس تخمین زده مخصوص گونه مورد تجزیه و تحلیل ترکیب کنید. با این حال، اگر توالی ژنوم کامل به اندازه کافی از جدایه های Thalassolituus وجود نداشته باشد، تعیین اینکه آیا ASxL5T متعلق به جنس Thalassolituus با این روش است، غیرممکن است. با توجه به محدودیت در دسترس بودن توالی ژنوم کامل برای تجزیه و تحلیل، کل درخت فیلوژنتیک ژنوم باید با احتیاط تفسیر شود. ثانیاً، روش‌های مقایسه کل ژنوم نمی‌توانند تفاوت‌های اساسی در اندازه ژنوم‌های مقایسه شده را توضیح دهند. آنها شباهت ژن‌های تک نسخه‌ای هسته حفاظت‌شده را بین جنس‌های مرتبط اندازه‌گیری کردند، اما تعداد زیادی از ژن‌هایی را که در ژنوم بسیار کوچک‌تر ASxL5T وجود ندارند، در نظر نگرفتند. بدیهی است که ASxL5T و گروه‌هایی از جمله تالاسولیتووس، اقیانوس‌باکتر و باکتریوپلانز جد مشترکی دارند، اما تکامل مسیر متفاوتی را در پیش گرفته است که منجر به کاهش ژنوم می‌شود که ممکن است سازگاری با سبک زندگی درنده باشد. این برخلاف T. oleivorans MIL-1T است که 28 درصد بزرگتر است و تحت فشارهای محیطی مختلف برای استفاده از هیدروکربن ها تکامل یافته است23،30. مقایسه جالبی را می توان با انگل ها و همزیست های اجباری درون سلولی مانند ریکتزیا، کلامیدیا و بوچنرا انجام داد. اندازه ژنوم آنها حدود 1 مگابایت است. توانایی استفاده از متابولیت های سلول میزبان منجر به از دست رفتن ژن می شود، بنابراین تحت تخریب ژنومی تکاملی قابل توجهی قرار گرفت. تغییرات تکاملی از موجودات مغذی شیمیایی دریایی به سبک زندگی درنده ممکن است منجر به کاهش مشابه در اندازه ژنوم شود. تجزیه و تحلیل COG و KEGG تعداد ژن‌های مورد استفاده برای عملکردهای خاص و تفاوت‌های کلی در مسیرهای ژنومی بین ASxL5T و T. oleivorans MIL-1T را برجسته می‌کند، که به دلیل در دسترس بودن گسترده عناصر ژنتیکی متحرک نیست. تفاوت در نسبت G + C کل ژنوم ASxL5T 56.1٪ و T. oleivorans MIL-1T 46.6٪ است که همچنین نشان دهنده جداسازی آن است.
بررسی محتوای کدگذاری ژنوم ASxL5T بینش های کاربردی را در مورد ویژگی های فنوتیپی ارائه می دهد. وجود ژن‌های کدکننده فیمبریای نوع IV (Tfp) از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است، زیرا آنها حرکت سلولی را که سر خوردن اجتماعی یا تشنج نامیده می‌شود، بدون تاژک روی سطح، ترویج می‌کنند. طبق گزارشات، Tfp عملکردهای دیگری نیز دارد، از جمله شکار، پاتوژنز، تشکیل بیوفیلم، جذب طبیعی DNA، تجمع خودکار سلولی و توسعه38. ژنوم ASxL5T شامل 18 ژن کد کننده دیگوانیلات سیکلاز (آنزیمی که تبدیل 2 گوانوزین تری فسفات به گوانوزین 2 فسفات و diGMP حلقوی را کاتالیز می کند) و 6 ژن کد کننده دیگوانیلات سیکلاز فسفات مربوطه است. ژن استراز (کاتالیزکننده تجزیه دی-GMP حلقوی به گوانوزین مونوفسفات) جالب است زیرا cycl-di-GMP دومین پیام رسان مهمی است که در توسعه و جداسازی بیوفیلم، حرکت، اتصال سلولی و حدت 39، 40 در این فرآیند نقش دارد. همچنین لازم به ذکر است که در Bdellovibrio bacteriovorus، GMP دوگانه چرخه ای نشان داده شده است که انتقال بین زندگی آزاد و سبک زندگی درنده را کنترل می کند.
بیشتر تحقیقات روی باکتری های شکارچی بر روی Bdellovibrio، موجودات شبیه Bdellovibrio و گونه های Myxococcus متمرکز شده است. این و سایر نمونه های شناخته شده از باکتری های شکارگر گروه متنوعی را تشکیل می دهند. علی‌رغم این تنوع، مجموعه‌ای از خانواده‌های پروتئینی مشخصه که منعکس‌کننده فنوتیپ‌های ۱۱ باکتری شکارچی شناخته‌شده هستند، شناسایی شده‌اند. با این حال، تنها ژن‌هایی که آنتی ژن لیگاز O (waaL) را کد می‌کنند، شناسایی شده‌اند که به ویژه در باکتری‌های گرم منفی رایج است. این شکل از تجزیه و تحلیل در تعیین ASxL5T به عنوان یک شکارچی مفید نیست، احتمالاً به این دلیل که از یک استراتژی حمله جدید استفاده می کند. در دسترس بودن ژنوم‌های باکتری‌های شکارچی متنوع‌تر به توسعه تجزیه و تحلیل‌های با وضوح دقیق‌تر کمک می‌کند که شواهدی از تفاوت‌های عملکردی و محیطی بین اعضای گروه را در نظر می‌گیرد. نمونه‌هایی از باکتری‌های شکارچی که در این تجزیه و تحلیل گنجانده نشده‌اند شامل اعضای Cupriavidus necator42 و Bradymonabacteria43 هستند، زیرا با بررسی جوامع میکروبی مختلف، گونه‌های شکارچی بیشتری ایجاد می‌شوند.
قابل توجه ترین ویژگی باکتری ASxL5T که توسط تصویر TEM گرفته شده است، مورفولوژی منحصر به فرد و انعطاف پذیر آن است که می تواند تعامل با باکتری های طعمه را تقویت کند. نوع برهمکنش مشاهده شده با سایر باکتری های شکارچی متفاوت است و قبلاً کشف یا گزارش نشده است. چرخه حیات شکارچی پیشنهادی ASxL5T در شکل 5 نشان داده شده است. نمونه های کمی در ادبیات با ساختارهای آپیکال مشابهی وجود دارد که در اینجا گزارش می کنیم، اما این نمونه ها عبارتند از Terasakiispira papahanaumokuakeensis، یک باکتری اسپیریلوم دریایی با بزرگ شدن گاه به گاه راس 44، و Terasakiispira papahanaumokuakeensis، و Terasakiispira papahanaumokuakeensis. ، قبلا متعلق به جنس Oceanospirillum، به اصطلاح «فیلم قطبی» را نشان می‌دهد. 45. اشکال کوکسی اغلب در فرهنگ‌های قدیمی‌تر مشاهده می‌شود، به‌ویژه برای باکتری‌هایی با اشکال منحنی، مانند ویبریو، کمپیلوباکتر، و هلیکوباکتر 46، 47، 48، که ممکن است نشان‌دهنده وضعیت تخریب‌شده باشد. . کار بیشتری برای روشن شدن چرخه زندگی دقیق باکتری ASxL5T مورد نیاز است. برای تعیین چگونگی شکار و شکار و اینکه آیا ژنوم آن ترکیبات فعال بیولوژیکی را رمزگذاری می کند که می توانند برای اهداف پزشکی یا بیوتکنولوژیکی استفاده شوند.
توضیحات Venatorbacter gen. نوامبر Venatorbacter (Ven.a.tor، ba'c.ter، L. متشکل از ونتاتورهای L. n. venator، 'hunter' و Gr. n. bacter،'a rod'. Venatorbacter،'a Hunting Rod' سلول ها هوازی، تحمل به نمک، منحنی رنگ آمیزی گرم، میله ورزش و PHB مثبت نیست انباشته شدن در محدوده دمایی 4 تا 42 درجه سانتی گراد در حلزون های دریایی غیرعادی است. اسیدهای چرب اصلی عبارتند از: C16:0 و C18:1ω9 ; اسیدهای چرب هیدروکسی در محیط های گوشتی رشد نمی کنند. محتوای G + C 56.1 مول است خانواده
شرح Venatorbacter cucullus sp. نوامبر Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.؛ L. n. cucullus به معنی پر کردن).
علاوه بر این، ویژگی توصیفی این جنس این است که وقتی روی BA یا BHI رشد می کنند، سلول ها 1.63 میکرومتر طول و 0.37 میکرومتر عرض دارند. کلنی های روی آگار BHI بسیار کوچک هستند و بعد از 72 ساعت به قطر 2 میلی متر می رسند. آنها بژ، شفاف، گرد، محدب و براق هستند. اعضای این گونه می توانند از اشریشیا کلی و کلبسیلا استفاده کنند. کمپیلوباکتر و چندین باکتری گرم منفی دیگر به عنوان طعمه عمل می کنند.
سویه معمولی ASxL5T از شیر گاو در ناتینگهام شایر انگلستان جدا شد و در مجموعه ملی نوع فرهنگ (بریتانیا): شماره پیوست NCTC 14397 و مجموعه کشت باکتریایی هلند (NCCB) شماره پیوست NCCB 100775. توالی ژنوم کامل ASxL با توجه به اضافه شدن در بانک ژن سپرده شده است CP046056.
باکتری ASxL5T از شیر گاو با استفاده از فناوری جداسازی فاژ 9،49 جدا شد. دوغاب 1:9 (w/v) در بافر SM (50 میلی مولار Tris-HCl [pH 7.5]، 0.1 مولار NaCl، 8 میلی مولار MgSO4.7H2O و 0.01 درصد ژلاتین رقیق شد؛ Sigma Aldrich، Gillingham، UK)، سپس انکوبه شد. در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت، چرخش آهسته برای شستشو شکارچیان به بافر سوسپانسیون در 3000 گرم به مدت 3 دقیقه سانتریفیوژ شد. مایع رویی جمع آوری شد و در 13000 گرم برای بار دوم به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس مایع رویی از یک فیلتر غشایی 0.45 میکرومتر (Minisart؛ Sartorius، Gottingen، آلمان) و یک فیلتر غشایی 0.2 میکرومتر (Minisart) عبور داده شد تا سلول های باکتریایی باقیمانده حذف شوند. ASxL5T می تواند از این فیلترها عبور کند. یک چمن آگار نرم از کمپیلوباکتر انتروسوس S12 (شماره دسترسی NCBI CP040464) از همان دوغاب با استفاده از تکنیک‌های استاندارد تهیه شد. دوغاب فیلتر شده در هر یک از این صفحات سلول میزبان در قطرات 10 میکرولیتری در سه تکرار توزیع شد و اجازه داده شد تا خشک شود. این پلیت در یک تانک میکروآئروفیل در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت تحت شرایط میکروآروبی (5% O2، 5% H2، 10% CO2 و 80% N2) انکوبه شد. پلاک قابل مشاهده به دست آمده در بافر SM استخراج شد و به چمن تازه C. hyointestinalis S12 برای تکثیر بیشتر ارگانیسم های لیز شده منتقل شد. هنگامی که مشخص شد که باکتری ها عامل پلاک لیتیک هستند و نه فاژ، سعی کنید ارگانیسم را مستقل از میزبان رشد دهید و آن را بیشتر مشخص کنید. کشت هوازی در دمای 37 درجه سانتیگراد با 5% حجم / حجم خون اسب دیفیبرینه شده انجام شد (TCS Biosciences Lt، باکینگهام، انگلستان، مکمل). طبق دستورالعمل کمیته ملی استانداردهای بالینی، از روش انتشار دیسک برای تست حساسیت آنتی باکتریال استفاده می شود. آگار BHI در دمای 37 درجه سانتی گراد با استفاده از دیسک حاوی آنتی بیوتیک های زیر (Oxoid) برای کشت هوازی کشت داده شد: آموکسی سیلین و اسید کلاوولانیک 30 میکروگرم. سفوتاکسیم 30 میکروگرم؛ استرپتومایسین 10 میکروگرم؛ سیپروفلوکساسین 5 میکروگرم؛ سفتازیدیم 30 میکروگرم نالیدیکسیک اسید 30 میکروگرم. ایمی پنم 10 میکروگرم؛ آزیترومایسین 15 میکروگرم؛ کلرامفنیکل 30 میکروگرم؛ سفوکسیتین 30 میکروگرم؛ تتراسایکلین 30 میکروگرم؛ نیتروفورانتوئین 300 میکروگرم؛ آزترونام 30 میکروگرم؛ آمپی سیلین 10 میکروگرم؛ سفپودوکسیم 10 میکروگرم؛ تری متوپریم- سولفامتوکسازول 25 میکروگرم. تحمل نمک با انکوباسیون هوازی روی صفحات آگار BHI در دمای 37 درجه سانتی گراد ایجاد شد. NaCl اضافی به صفحات BHI آگار اضافه شد تا محدوده غلظتی تا 10% w/v را فراهم کند. محدوده pH توسط کشت هوازی روی صفحات آگار BHI در دمای 37 درجه سانتیگراد تعیین می شود، جایی که محدوده pH با HCl استریل یا NaOH استریل بین 4 و 9 تنظیم شده است، و مقدار pH هدف قبل از ریختن پلیت تأیید می شود. برای تجزیه و تحلیل اسیدهای چرب سلولی، ASxL5T به مدت 3 روز در آگار BHI و در دمای 37 درجه سانتیگراد هوازی کشت داده شد. بر اساس پروتکل استاندارد MIDI (سیستم شناسایی میکروبی شرلوک، نسخه 6.10) شرکت FERA Science Ltd، (یورک، انگلستان)، اسیدهای چرب سلول استخراج، تهیه و آنالیز شدند.
برای TEM، ASxL5T با پخش یکنواخت روی BA در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت هوازی کشت شد و سپس در 1 میلی لیتر گلوتارآلدئید 3 درصد (v/v) در بافر کاکودیلات 0.1 مولار در دمای اتاق به مدت 1 ساعت ثابت شد، سپس سانتریفیوژ شد. در 10000 گرم به مدت 3 دقیقه. سپس به آرامی گلوله را در 600 میکرولیتر بافر کاکودیلات 0.1 مولار معلق کنید. تعلیق ثابت ASxL5T را به فیلم Formvar/carbon روی شبکه مسی 200 مش انتقال دهید. باکتری ها با 0.5% (w/v) اورانیل استات به مدت 1 دقیقه رنگ آمیزی شدند و توسط TEM با استفاده از میکروسکوپ TEI Tecnai G2 12 Biotwin مورد بررسی قرار گرفتند. همانطور که در بالا ذکر شد، همان تعداد طعمه و شکارچی را در آبگوشت NZCYM (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) ترکیب کنید و به مدت 48 ساعت در شرایط میکروآروبی کمپیلوباکتر یا کمپیلوباکتر در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید. همچنین توسط TEM مورد بررسی قرار گرفت. شرایط هوازی برای اشریشیا کلی به طور مستقل طعمه و باکتری های شکارگر را برای تعیین هرگونه تغییر در مورفولوژی سلولی به دلیل شکار بررسی کنید. روش سیاه سودان برای میکروسکوپ نوری تجمع PHB استفاده شد.
کشت های ASxL5T را یک شبه با آغشته کردن رشد روی صفحات BHI یا BA با سواب استریل رشد دهید. سلول های ASxL5T را جمع آوری کنید و آنها را در MRD (CM0733، Oxoid) معلق کنید و سپس آنها را به مدت 7 روز در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار دهید تا سلول ها گرسنه بمانند. کشت باکتری مرجع NCTC یا ذخیره آزمایشگاهی به براث BHI یا براث مواد مغذی شماره 2 (CM007، Oxoid) تلقیح شد، یک شب انکوبه شد، در 13000 گرم سانتریفیوژ شد و تا زمانی که OD600 0.4 شد، مجدداً در MRD معلق شد. کشت: Bacillus subtilis NCTC 3610T، Citrobacter freundii NCTC 9750T، Enterobacter aerogenes NCTC 10006T، Enterococcus faecalis NCTC 775T، Escherichia coli NCTC 86، Klebsiella NCTCu6114oxy. 10817، باکتری لیستریا خاص NCTC 4885، Bacillus macerans NCTC 6355T، Providencia stuartsii NCTC 10318، Pseudomonas fluorescens SMDL، Rhodococcus زیردریایی همبرگر NCTC 1621T، باکتری Salmonellage57Test. NCTC 10861، استافیلوکوکوس اورئوس NCTC 8532T، استرپتوکوکوس پنومونیه NCTC 7465T، یرسینیا انتروکولیتیکا NCTC 10460. میزبان کمپیلوباکتر به صورت میکروآروبی بر روی پلیت های BA و در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه شد. میزبان های کمپیلوباکتر آزمایش شده عبارتند از: C. coli 12667 NCTC، C. jejuni 12662، C. jejuni PT14، C. jejuni NCTC 11168T، C. helveticus NCTC 12472، C. lari NCTC 111458، C.lari NCTC 111458. jejuni PT14, C... سلول ها را در MRD جمع آوری کنید، در 13000 گرم سانتریفیوژ کنید و مجدداً در MRD معلق کنید تا OD600 0.4 شود. مقدار کمی از سوسپانسیون 0.5 میلی‌لیتری را به 5 میلی‌لیتر بالا آگار NZCYM ذوب شده (0.6 درصد آگار) اضافه کنید و آن را روی صفحه زیرین NZCYM 1.2 درصد بریزید. پس از پخت و خشک شدن، ASxL5T رقیق شده به صورت 20 میکرولیتر به صورت قطرات بر روی هر تخته چمن در سه تکرار توزیع شد. دمای کشت و اتمسفر به نیازهای باکتری مورد آزمایش بستگی دارد.
از کیت ژنومیک DNA باکتری GenElute™ (سیگما آلدریج) برای تهیه DNA از ایزوله های باکتریایی استفاده کنید. روش‌های استاندارد برای تکثیر PCR ژن 16S rRNA و تعیین توالی محصول با استفاده از شیمی پایان رنگ (Eurofins Value Read Service، آلمان) استفاده شد. از برنامه BLAST-N برای مقایسه این توالی ها با سایر توالی های ژن 16S rRNA برای شناسایی و جمع آوری گونه های نزدیک به هم استفاده کنید. اینها با استفاده از ClustalW در برنامه MEGA X تراز می شوند. درخت فیلوژنتیک با استفاده از MEGA X با استفاده از روش حداکثر درستنمایی بر اساس مدل Tamura-Nei با 1000 نسخه هدایت شده بازسازی شد54. از کیت DNA ژنومیک PureLink™ (Fisher Scientific, Loughborough, UK) برای استخراج DNA برای توالی یابی کل ژنوم استفاده کنید. توالی ژنوم ASxL5T با استفاده از ترکیب Illumina MiSeq تعیین شد، که شامل 250 جفت باز خواندن دو انتهایی متشکل از یک کتابخانه تهیه‌شده با استفاده از کیت برچسب‌گذاری Nextera و خواندن‌های طولانی 2 تا 20 کیلوبایت از پلتفرم PacBio است. مرکز تحقیقات توالی DNA ژنومیکس در دانشگاه سمبیا. ژنوم با استفاده از CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen، Aarhus، دانمارک) مونتاژ شد. کشت‌های ASxL5T در مجموعه کشت ملی نوع (بریتانیا) و مجموعه کشت باکتریایی هلند (NCCB) ذخیره شده‌اند. ژنوم ارگانیسم های مرتبط مورد استفاده برای مقایسه عبارتند از: Thalassolituus oleivorans MIL-1T (شماره دسترسی HF680312، کامل). Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (شماره دسترسی BMYY01000001، ناقص)؛ Oceanobacter kriegii DSM 6294T (شماره دسترسی NZ_AUGV00000000، ناقص)؛ Marinamonas Community DSM 5604T (اضافه شده ASM436330v1، ناقص)، Oceanospirullum linum ATCC 11336T (اضافه شده MTSD02000001، ناقص) و Thalassolituus sp. C2-1 (NZ_VNIL01000001 را اضافه کنید، ناقص). از JGI Genome Portal36 در https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page= برای تعیین امتیاز تراز (AF) و میانگین هویت اسید نوکلئیک (ANI) استفاده کنید. به صورت جفت. برای تعیین هویت اسید آمینه (AAI) از روش Rodriguez-R & Konstantinidis55 استفاده شد. از GToTree 1.5.5411،12،13،14،15،16،17،18 برای تولید درخت فیلوژنتیک حداکثر احتمال تخمینی استفاده کنید. ژنوم ورودی که نشان دهنده ژنوم مرجع موجود است از جنس های مرجع شناسایی شده به عنوان مرتبط با ASxL5T از فیلوژنی 16S rRNA انتخاب شده است. با استفاده از ابزار آنلاین تعاملی درخت زندگی (https://itol.embl.de/) درخت را حاشیه نویسی کرد. حاشیه نویسی و تجزیه و تحلیل عملکردی ژنوم ASxL5T با استفاده از ابزار آنلاین BlastKOALA KEGG با استفاده از توزیع غنی سازی ماژول KEGG (دانشنامه کیوتو ژن ها و ژنوم ها) انجام می شود. توزیع دسته‌های COG (گروه‌های ارتولوگ) با استفاده از ابزار آنلاین eggNOG-mapper تعیین می‌شود.
پرز، جی، مورالدا-مونوز، آ.، مارکوس-تورس، اف جی و مونوز-دورادو، جی. شکار باکتریایی: 75 سال و همچنان ادامه دارد! . محیط زیست میکروارگانیسم 18, 766-779 (2016).
Linares-Otoya، L. و غیره. تنوع و پتانسیل ضد باکتریایی باکتری های شکارچی در خط ساحلی پرو. داروهای اسفند. 15. E308. https://doi.org/10.3390/md15100308 (2017).
پاسترناک، ز و همکاران. از طریق ژن های آنها، آنها را درک خواهید کرد: ویژگی های ژنومی باکتری های شکارچی. ISME J. 7، 756-769 (2013).
Sockett, RE سبک زندگی شکارچی باکتریوفاژ Bdellovibrio. نصب کنید. میکروب های کشیش 63, 523-539 (2009).
Korp, J., Vela Gurovic, MS & Nett, M. آنتی بیوتیک ها از باکتری های شکارچی. Beilstein J. Histochemistry 12، 594-607 (2016).
Johnke، J.، Fraune، S.، Bosch، TCG، Hentschel، U. & Schulenburg، H. Bdellovibrio و ارگانیسم های مشابه پیش بینی کننده تنوع میکروبیوم در جمعیت های مختلف میزبان هستند. میکروارگانیسم اکولوژی. 79، 252-257 (2020).
Vila, J., Moreno-Morales, J. and Ballesté-Delpierre, C. وضعیت فعلی عوامل ضد باکتری جدید را کشف کنید. بالینی میکروارگانیسم آلوده کردن https://doi.org/10.1016/j.cmi.2019.09.015 (2019).
هابلی، ال. و همکاران. شکار دوگانه فاژ و فاژ می تواند طعمه E. coli را بدون شکار واحد ریشه کن کند. J. باکتری. 202، e00629-19. https://doi.org/10.1128/JB.00629-19 (2020).
El-Shibiny, A., Connerton, PL & Connerton, IF تعداد و تنوع کمپیلوباکتر و باکتریوفاژهای جدا شده در طول چرخه تغذیه جوجه های آزاد و ارگانیک. محیط برنامه میکروارگانیسم 71، 1259-1266 (2005).
Wilkinson، DA و غیره. طبقه بندی ژنومی و اپیدمیولوژی کمپیلوباکتر خوکی را به روز کنید. علم نماینده 8, 2393. https://doi.org/10.1038/s41598-018-20889-x (2018).
Lee, MD GToTree: گردش کار کاربر پسند برای ژنومیک سیستم. بیوانفورماتیک 35، 4162-4164 (2019).
Edgar, RC MUSCLE: یک روش تراز چند سکانسی که پیچیدگی زمان و مکان را کاهش می دهد. اطلاعات بیولوژیکی BMC 5, 113 (2004).
Capella-Gutiérrez, S., Silla-Martínez, JM & Gabaldón, T. TrimAl: ابزاری برای تراز و برش خودکار در تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک در مقیاس بزرگ. بیوانفورماتیک 25، 1972-1973 (2009).
Hyatt، D.، LoCascio، PF، Hauser، LJ & Uberbacher، ژن EC و توالی متاژنومی شروع ترجمه سایت پیش بینی. بیوانفورماتیک 28، 2223-2230 (2012).
Shen, W. & Xiong, J. TaxonKit: جعبه ابزار طبقه بندی NCBI بین پلتفرمی و کارآمد. Bio Rxiv. (دسترسی در 1 ژوئن 2021)؛ https://www.biorxiv.org/content/10.1101/513523v1 (2019).
قیمت، MN، Dehal، PS & Arkin، AP FastTree 2-درخت حداکثر احتمال تقریبی با تراز بزرگ. PLoS One 5, e9490 (2010).
Tange، O. GNU Parallel. (دسترسی در 1 ژوئن 2021)؛ https://zenodo.org/record/1146014#.YOHaiJhKiUk (2018).
Kanehisa، M. & Goto، S. KEGG: کیوتو دایره المعارف ژن ها و ژنوم ها. تحقیقات اسید نوکلئیک 28، 27-30 (2000).
جمهوری چک، L. و غیره. نقش اکسترمولیت های اکتوئین و هیدروکسی اکتوئین به عنوان محافظ استرس و مواد مغذی: ژنتیک، ژنومیک سیستم، بیوشیمی، و تجزیه و تحلیل ساختاری. ژن (بازل). 9. E177. https://doi.org/10.3390/genes9040177 (2018).
Gregson, BH, Metodieva, G., Metodiev, MV, Golyshin, PN & McKew, BA بیان متفاوت پروتئین در طول رشد باکتری اجباری تجزیه کننده هیدروکربن های دریایی Thalassolituus oleivorans MIL-1 در طول رشد آلکان های زنجیره متوسط ​​و بلند. جلو میکروارگانیسم 9, 3130 (2018).
Pasternak, Z., Ben Sasson, T., Cohen, Y., Segev, E., and Jurkevitch, E. یک روش مقایسه ای ژنومیک جدید برای تعریف شاخص های خاص فنوتیپی وراثت خاصی را در علامت باکتری های شکارچی نشان می دهد. کتابخانه علوم عمومی یک. 10. e0142933. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142933 (2015).
یاکیموف، MM و غیره ژن Thalassolituus oleivorans. نوامبر، sp. نوامبر، نوع جدیدی از باکتری های دریایی است که در استفاده از هیدروکربن ها تخصص دارد. بین المللی بودن سیستم جی. تکامل میکروارگانیسم 54، 141-148 (2004).
Wang، Y.، Yu، M.، Liu، Y.، Yang، X. و Zhang، XH Bacterioplanoides pacificum gen. نوامبر، sp. در ماه نوامبر از آب دریا که در اقیانوس آرام جنوبی در گردش بود جدا شد. بین المللی بودن سیستم جی. تکامل میکروارگانیسم 66, 5010–5015 (2016).