Un nouveau type de bactérie Gram-négative, aérobie, tolérante au sel, active, en forme de bâtonnet et prédatrice, ASxL5T, a été isolée d'un étang de bouse de vache dans le Nottinghamshire, en Angleterre, et a utilisé Campylobacter comme proie. Par la suite, d’autres espèces de Campylobacter et des membres de la famille des Enterobacteriaceae ont été découverts comme proies. Après une sous-culture sans cellules hôtes, une faible croissance aseptique a été obtenue sur la gélose Brain Heart Infusion. Les conditions de croissance optimales sont de 37 °C et le pH est de 7. La microscopie électronique à transmission a révélé des caractéristiques morphologiques très inhabituelles liées à la disponibilité des proies. L'analyse phylogénétique utilisant la séquence du gène de l'ARNr 16S a indiqué que l'isolat est apparenté à un membre de la famille des spirulines marines, mais ne peut être clairement classé comme membre d'un genre connu. Le séquençage du génome entier d'ASxL5T a confirmé la relation avec les membres des spirochètes marins. Une recherche dans la base de données a révélé que plusieurs ASxL5T partagent des séquences génétiques d’ARNr 16S avec plusieurs bactéries non cultivées provenant de l’océan, de la surface terrestre et des eaux souterraines. Nous suggérons que la souche ASxL5T représente une nouvelle espèce dans un nouveau genre. Nous recommandons le nom Venatorbacter cucullus gen. Novembre, sp. En novembre, ASxL5T a été utilisée comme souche type.
Les bactéries prédatrices sont des bactéries qui présentent la capacité de traquer et de tuer d’autres bactéries vivantes pour obtenir des matériaux biosynthétiques et de l’énergie. Ceci est différent de la récupération générale des nutriments à partir de micro-organismes morts, et également des interactions parasitaires, dans lesquelles les bactéries nouent une relation étroite avec leur hôte sans les tuer. Les bactéries prédatrices ont développé différents cycles de vie pour profiter des sources de nourriture abondantes dans les niches où elles se trouvent (comme les habitats marins). Il s’agit d’un groupe taxonomiquement diversifié, qui n’est relié que par son cycle de vie de stérilisation unique1. Des exemples de bactéries prédatrices ont été trouvés dans plusieurs phylums différents, notamment : les protéobactéries, les Bacteroides et la Chlorella.3. Cependant, les bactéries prédatrices les plus étudiées sont les organismes Bdellovibrio et Bdellovibrio-and-like (BALO4). Les bactéries prédatrices constituent une source prometteuse de nouveaux composés biologiquement actifs et d’agents antibactériens5.
On pense que les bactéries prédatrices améliorent la diversité microbienne et ont un impact positif sur la santé, la productivité et la stabilité des écosystèmes6. Malgré ces attributs positifs, il existe peu d’études sur les nouvelles bactéries prédatrices en raison de la difficulté de cultiver les bactéries et de la nécessité d’observer attentivement les interactions cellulaires pour comprendre leurs cycles de vie complexes. Cette information n’est pas facile à obtenir à partir d’une analyse informatique.
À une époque où la résistance aux antimicrobiens augmente, de nouvelles stratégies de ciblage des bactéries pathogènes sont étudiées, comme l’utilisation de bactériophages et de bactéries prédatrices7,8. Les bactéries ASxL5T ont été isolées en 2019 à l'aide de la technologie d'isolement des phages à partir de bouse de vache collectée au centre laitier de l'université de Nottingham, dans le Nottinghamshire. Le but de l'enquête est d'isoler les organismes susceptibles de servir d'agents de lutte biologique. Campylobacter hyointestinalis est un agent pathogène zoonotique, de plus en plus associé aux maladies intestinales humaines10. Il est omniprésent dans le sérum et utilisé comme hôte cible.
La bactérie ASxL5T a été isolée de la gelée de bœuf car il a été observé que les plaques qu'elle formait sur la pelouse de C. hyointestinalis étaient similaires à celles produites par les bactériophages. Il s’agit d’une découverte inattendue, car une partie du processus d’isolement des phages implique une filtration à travers un filtre de 0,2 µm, conçu pour éliminer les cellules bactériennes. L'examen microscopique du matériel extrait de la plaque a révélé que les petites bactéries Gram négatives en forme de bâtonnet incurvé n'accumulaient pas de polyhydroxybutyrate (PHB). La culture aseptique indépendante des cellules proies est réalisée sur un milieu solide riche (tel que la gélose à infusion cœur-cerveau (BHI) et la gélose au sang (BA)), et sa croissance est faible. Il est obtenu après repiquage avec une amélioration de l'inoculum lourd. Il pousse aussi bien dans des conditions microaérobies (7 % v/v d’oxygène) que dans des conditions d’oxygène atmosphérique, mais pas dans une atmosphère anaérobie. Après 72 heures, le diamètre de la colonie était très petit, atteignant 2 mm, et elle était beige, translucide, ronde, convexe et brillante. Les tests biochimiques standard sont entravés car ASxL5T ne peut pas être cultivé de manière fiable dans des milieux liquides, ce qui suggère qu'il peut s'appuyer sur le cycle de vie complexe de la formation de biofilm. Cependant, la suspension sur plaque a montré que l'ASxL5T est aérobie, positif pour l'oxydase et la catalase et peut tolérer 5 % de NaCl. ASxL5T est résistant à 10 µg de streptomycine, mais est sensible à tous les autres antibiotiques testés. Les cellules bactériennes ASxL5T ont été examinées par TEM (Figure 1). Lorsqu'elles sont cultivées sans cellules proies sur le BA, les cellules ASxL5T sont de petits Campylobacter, avec une longueur moyenne de 1,63 μm (± 0,4), une largeur de 0,37 μm (± 0,08) et un seul pôle long (jusqu'à 5 μm). Flagelles sexuels. Environ 1,6 % des cellules semblent avoir une largeur inférieure à 0,2 µm, ce qui permettra le passage à travers le dispositif filtrant. Une extension structurelle inhabituelle a été observée au sommet de certaines cellules, semblable à un carénage (du latin cucullus) (voir les flèches en 1D, E, G). Celle-ci semble être composée d'un excès de membrane externe, qui peut être dû à la réduction rapide de la taille de l'enveloppe périplasmique, tandis que la membrane externe reste intacte, montrant un aspect « lâche ». La culture d’ASxL5T en l’absence de nutriments (dans du PBS) pendant une longue période à 4 °C a abouti à ce que la plupart (mais pas toutes) des cellules présentent une morphologie coccale (Figure 1C). Lorsque ASxL5T se développe avec Campylobacter jejuni comme proie pendant 48 heures, la taille moyenne des cellules est significativement plus longue et plus étroite que celle des cellules cultivées sans hôte (Tableau 1 et Figure 1E). En revanche, lorsque ASxL5T se développe avec E. coli comme proie pendant 48 heures, la taille moyenne des cellules est plus longue et plus large que lorsqu'elle se développe sans proie (Tableau 1), et la longueur des cellules est variable, montrant généralement des filaments (Figure 1F). Lorsqu'elles sont incubées avec Campylobacter jejuni ou E. coli comme proie pendant 48 heures, les cellules ASxL5T ne présentent aucun flagelle. Le tableau 1 résume les observations de changements dans la taille des cellules en fonction de la présence, de l'absence et du type de proie d'ASxL5T.
Affichage TEM de l'ASx5LT : (A) ASx5LT affiche un long fouet ; (B) batterie ASx5LT typique ; (C) cellules cocci ASx5LT après une longue incubation sans nutriments ; (D) un groupe de cellules ASx5LT présente une anomalie (E) Le groupe de cellules ASx5LT incubé avec des proies de Campylobacter a montré une longueur de cellule accrue par rapport à celles sans croissance de proies (D) a également montré une structure apicale ; (F) Grands flagelles filamenteux, cellules ASx5LT, après incubation avec des proies d'E. coli ; (G) Une seule cellule ASx5LT après incubation avec E. coli, montrant une structure supérieure inhabituelle. La barre représente 1 µm.
La détermination de la séquence du gène de l'ARNr 16S (numéro d'accès MT636545.1) permet aux recherches dans les bases de données d'établir des séquences similaires à celles de la classe des gammaprotéobactéries, et sont les plus proches des bactéries marines de la famille des spirilles marines (Figure 2) et sont membres du genre Thalassolituus. Le parent le plus proche du bacille marin. La séquence du gène de l’ARNr 16S est clairement différente de celle des bactéries prédatrices appartenant à la famille des Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria). Les comparaisons par paires de B. bacteriovorus HD100T (souche type, DSM 50701) et de B. bacteriovorus DM11A étaient de 48,4 % et 47,7 %, et pour B. exovorus JSS, de 46,7 %. Les bactéries ASxL5T possèdent 3 copies du gène de l'ARNr 16S, dont deux sont identiques et la troisième est distante de 3 bases. Deux autres isolats de bactéries prédatrices (ASx5S et ASx5O ; les numéros d'accès au gène de l'ARNr 16S sont respectivement MT636546.1 et MT636547.1) avec des caractéristiques morphologiques et phénotypiques similaires provenant du même endroit ne sont pas les mêmes, mais ils sont différents de ASxL5T et des bactéries non cultivées. les séquences de la base de données sont regroupées avec d'autres genres d'Océanospirillacées (Figure 2). La séquence complète du génome d'ASxL5T a été déterminée et enregistrée dans la base de données NCBI, et le numéro d'accès est CP046056. Le génome de ASxL5T est constitué d'un chromosome circulaire de 2 831 152 pb avec un ratio G+C de 56,1 %. La séquence du génome contient 2 653 CDS (au total), dont 2 567 devraient coder pour des protéines, dont 1 596 peuvent être attribuées à des fonctions putatives (60,2 %). Le génome contient 67 gènes codant pour l'ARN, dont 9 ARNr (3 chacun pour 5S, 16S et 23S) et 57 ARNt. Les caractéristiques génomiques d'ASxL5T ont été comparées aux génomes disponibles des souches du type relatif le plus proche identifié à partir de la séquence du gène de l'ARNr 16S (Tableau 2). Utilisez l’identité des acides aminés (AAI) pour comparer tous les génomes Thalassolituus disponibles à ASxL5T. La séquence génomique disponible (incomplète) la plus proche déterminée par AAI est Thalassolituus sp. C2-1 (ajouter NZ_VNIL01000001). Cette souche a été isolée des sédiments des grands fonds de la fosse des Mariannes, mais il n'existe actuellement aucune information phénotypique sur cette souche à des fins de comparaison. Comparé aux 2,82 Mo d’ASxL5T, le génome de l’organisme est plus grand à 4,36 Mo. La taille moyenne du génome des spirochètes marins est d'environ 4,16 Mb (± 1,1 ; n = 92 génomes de référence complets étudiés à partir de https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), de sorte que le génome d'ASxL5T est conforme à la ordre Par rapport aux autres membres, il est assez petit. Utilisez GToTree 1.5.54 pour générer un arbre phylogénétique de vraisemblance maximale estimé basé sur le génome (Figure 3A), en utilisant les séquences d'acides aminés alignées et liées de 172 gènes à copie unique spécifiques aux gammaprotéobactéries 11,12,13,14,15,16, 17,18. L'analyse a montré qu'il est étroitement lié au Thalassolituus, au plan bactérien et à la bactérie marine. Cependant, ces données indiquent que l'ASxL5T est différent de ses parents dans la spiruline marine et que ses données sur la séquence génomique sont disponibles.
L'arbre phylogénétique utilisant la séquence du gène de l'ARNr 16S met en évidence la position des souches ASxL5T, ASxO5 et ASxS5 (avec les tripes) par rapport aux souches de bactéries incultes et marines des Spirulinaceae marines. Le numéro d'accès Genbank suit le nom de la souche entre parenthèses. Utilisez ClustalW pour aligner les séquences, utilisez la méthode du maximum de vraisemblance et le modèle Tamura-Nei pour déduire les relations phylogénétiques et effectuez 1 000 réplications guidées dans le programme MEGA X. Le numéro sur la branche indique que la valeur de copie guidée est supérieure à 50 %. Escherichia coli U/541T a été utilisée comme groupe externe.
(A) Un arbre phylogénétique basé sur le génome, montrant la relation entre la bactérie marine Spirospiraceae ASxL5T et ses proches parents, E. coli U 5/41T en tant qu'exogroupe. (B) Par rapport à T. oleivorans MIL-1T, la distribution des catégories fonctionnelles des gènes est prédite sur la base du groupe orthologue (COG) de la protéine ASx5LT. La figure de gauche montre le nombre de gènes dans chaque catégorie fonctionnelle COG de chaque génome. Le graphique de droite montre le pourcentage de génomes contenus dans chaque groupe fonctionnel COG. (C) Par rapport à T. oleiverans MIL-1T, l’analyse de la voie modulaire complète KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) d’ASxL5T.
L’utilisation de la base de données KEGG pour examiner les gènes composants présents dans le génome ASxL5T a révélé la voie métabolique typique du gamma aérobie Proteus. ASxL5T contient un total de 75 gènes attribués aux protéines motrices bactériennes, y compris des gènes impliqués dans la chimiotaxie, l'assemblage des flagelles et le système fimbriae de type IV. Dans la dernière catégorie, 9 gènes sur 10 sont responsables du mouvement de contraction de divers autres organismes. Le génome de l'ASxL5T contient une voie biosynthétique complète de la tétrahydropyrimidine qui participe à la réponse protectrice au stress osmotique20, comme prévu pour les halophiles. Le génome contient également de nombreuses voies complètes pour les cofacteurs et les vitamines, notamment les voies de synthèse de la riboflavine. Bien que le gène de l'alcane 1-monooxygénase (alkB2) soit présent dans ASxL5T, la voie d'utilisation des hydrocarbures n'est pas complète. Dans la séquence génomique d'ASxL5T, les homologues des gènes identifiés comme principalement responsables de la dégradation des hydrocarbures chez T. oleiverans MIL-1T21, tels que TOL_2658 (alkB) et TOL_2772 (alcool déshydrogénase) sont évidemment absents. La figure 3B montre la comparaison de la distribution des gènes dans la catégorie COG entre ASxL5T et l'huile d'olive MIL-1T. Dans l’ensemble, le génome ASxL5T plus petit contient proportionnellement moins de gènes de chaque catégorie COG que le génome apparenté plus grand. Lorsque le nombre de gènes dans chaque catégorie fonctionnelle est exprimé en pourcentage du génome, des différences sont notées dans le pourcentage de gènes dans les catégories de traduction, de structure ribosomale et de biogenèse, ainsi que dans les catégories de fonctions de production et de conversion d'énergie, qui constituent le plus grand ASxL5T. génome Le pourcentage est comparé au même groupe présent dans le génome MIL-1T de T. oleiverans. En revanche, par rapport au génome ASxL5T, T. oleivorans MIL-1T possède un pourcentage plus élevé de gènes dans les catégories de réplication, de recombinaison et de réparation et de transcription. Il est intéressant de noter que la plus grande différence dans le contenu de chaque catégorie fonctionnelle des deux génomes est le nombre de gènes inconnus présents dans ASxL5T (Figure 3B). Une analyse d'enrichissement des modules KEGG a été réalisée, chaque module KEGG représentant un ensemble d'unités fonctionnelles définies manuellement pour l'annotation et l'interprétation biologique des données de séquence du génome. La comparaison de la distribution des gènes dans la voie complète du module KOG d'ASxL5T et d'olive MIL-1T est présentée à la figure 3C. Cette analyse montre que bien que ASxL5T ait une voie métabolique complète pour le soufre et l’azote, ce n’est pas le cas de T. oleiverans MIL-1T. En revanche, T. oleiverans MIL-1T possède une voie métabolique complète pour la cystéine et la méthionine, mais elle est incomplète dans ASxL5T. Par conséquent, ASxL5T possède un module caractéristique pour l'assimilation des sulfates (défini comme un ensemble de gènes pouvant être utilisés comme marqueurs phénotypiques, tels que la capacité métabolique ou la pathogénicité ; https://www.genome.jp/kegg/module.html). .oliverons MIL-1T. La comparaison du contenu génétique d’ASxL5T avec la liste des gènes suggérant un mode de vie prédateur n’est pas concluante. Bien que le gène waaL codant pour la ligase associée au polysaccharide de l'antigène O jusqu'au noyau soit présent dans le génome ASxL5T (mais il est courant chez de nombreuses bactéries à Gram négatif), les gènes de la tryptophane 2,3-dioxygénase (TDO) peuvent inclure les 60 acides aminés. régions acides que l'on trouve couramment dans les bactéries prédatrices qui ne sont pas présentes. Il n'existe aucun autre gène caractéristique prédateur dans le génome ASxL5T, y compris ceux codant pour les enzymes impliquées dans la biosynthèse des isoprénoïdes dans la voie du mévalonate. Notez qu'il n'y a pas de gène de régulation transcriptionnelle gntR dans le groupe de prédateurs examiné, mais trois gènes de type gntR peuvent être identifiés dans ASxL5T.
Les caractéristiques phénotypiques de ASxL5T sont résumées dans le tableau 3 et comparées aux caractéristiques phénotypiques des genres apparentés 23, 24, 25, 26 et 27 rapportées dans la littérature. Les isolats de T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis et Oceanobacter kriegii sont des corps en forme de bâtonnet actifs, tolérants au sel et oxydase-positives, mais n'ont presque aucune autre caractéristique phénotypique avec ASxL5T. Le pH moyen de l'océan est de 8,1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77), ce qui se reflète dans T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis et O. kriegii. ASxL5T convient à la plage de pH plus large (4-9) typique des espèces non marines. Caractéristiques phénotypiques de Thalassolituus sp. C2-1. Inconnu. La plage de températures de croissance de ASxL5T est généralement plus large que celle des souches marines (4 à 42 °C), bien que certains isolats de T. marinus, mais pas tous, soient tolérants à la chaleur. L’incapacité de cultiver ASxL5T dans un bouillon a empêché une caractérisation phénotypique plus approfondie. Utilisez API 20E pour tester les matériaux grattés de la plaque BA, ONPG, arginine dihydrolase, lysine décarboxylase, ornithine décarboxylase, utilisation du citrate, uréase, tryptophane désaminase, enzyme d'hydrolyse de la gélatine, les résultats des tests étaient tous négatifs, mais pas d'indole, d'acétoïne et de H2S. ont été produits. Les glucides non fermentés comprennent : le glucose, le mannose, l'inositol, le sorbitol, le rhamnose, le saccharose, le mélibiose, l'amygdaline et l'arabinose. Comparé aux souches de référence apparentées publiées, le profil d'acides gras cellulaires de la souche ASxL5T est présenté dans le tableau 4. Les principaux acides gras cellulaires sont C16: 1ω6c et/ou C16: 1ω7c, C16: 0 et C18: 1ω9. Il existe également des acides gras hydroxylés C12:0 3-OH et C10:0 3-OH. Le rapport C16: 0 dans ASxL5T est supérieur à la valeur rapportée des genres apparentés. En revanche, par rapport au T. marinus IMCC1826TT signalé, le rapport C18: 1ω7c et / ou C18: 1ω6c dans ASxL5T est réduit. oleivorans MIL-1T et O. kriegii DSM 6294T, mais non détectés dans B. sanyensis KCTC 32220T. La comparaison des profils d'acides gras d'ASxL5T et d'ASxLS a révélé des différences subtiles dans la quantité d'acides gras individuels entre les deux souches, qui concordent avec la séquence d'ADN génomique de la même espèce. Aucune particule de poly-3-hydroxybutyrate (PHB) n’a été détectée à l’aide du test au noir du Soudan.
L'activité de prédation de la bactérie ASxL5T a été étudiée pour déterminer la gamme de proies. Cette bactérie peut former des plaques sur les espèces de Campylobacter, notamment : Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T ; Escherichia coliNCTC 12667 ; C. helveticus NCTC 12472 ; C lari NCTC 11458 et C. upsaliensis NCTC 11541T. Utilisez les cultures répertoriées dans la section Détermination de la gamme d’hôtes de la méthode pour tester une gamme plus large de bactéries Gram-négatives et Gram-positives. Les résultats montrent que ASxL5T peut également être utilisé dans Escherichia coli NCTC 86 et Citrobacter freundii NCTC 9750T. Plaques formées sur Klebsiella oxytoca 11466. L'interaction TEM avec E. coli NCTC 86 est illustrée sur les figures 4A-D et l'interaction avec Campylobacter jejuni PT14 et Campylobacter suis S12 est illustrée sur la figure 4E-H du milieu. Le mécanisme d'attaque semble être différent selon les types de proies testés, avec une ou plusieurs cellules d'E. coli attachées à chaque cellule ASxL5T et positionnées latéralement le long de la cellule étendue avant l'adsorption. En revanche, ASxL5T semble s'attacher à Campylobacter via un seul point de contact, généralement en contact avec le sommet de la cellule prédatrice et près du sommet de la cellule Campylobacter (Figure 4H).
TEM montrant l'interaction entre ASx5LT et les proies : (AD) et les proies d'E. coli ; (EH) et C. jejuni comme proie. (A) Une cellule ASx5LT typique connectée à une seule cellule E. coli (EC); (B) Un ASx5LT filamenteux attaché à une seule cellule EC ; (C) Une cellule filamenteuse ASx5LT connectée à plusieurs cellules EC ; (D) Attachement de petites cellules ASx5LT sur une seule cellule E. coli (EC) ; (E) une seule cellule ASx5LT connectée à une cellule Campylobacter jejuni (CJ) ; (F) ASx5LT attaque les cellules de C. hyointestinalis (CH); (G) deux cellules One ASx5LT ont attaqué une cellule CJ ; (H) Une vue rapprochée du point d’attache ASx5LT, près du sommet de la cellule CJ (barre 0,2 μm). La barre représente 1 µm en (A – G).
Les bactéries prédatrices ont évolué pour profiter des sources abondantes de proies. Évidemment, ils sont largement présents dans de nombreux environnements différents. En raison de la taille étroite des membres de la population, il est possible d’isoler les bactéries ASxL5T de la suspension en utilisant la méthode de séparation des phages. La pertinence génomique de l'ASxL5T pour les membres de la famille des bactéries marines océanospirillacées est surprenante, bien que l'organisme soit tolérant au sel et puisse se développer sur un milieu contenant 5 % de sel. L'analyse de la qualité de l'eau du lisier a montré que la teneur en chlorure de sodium était inférieure à 0,1 %. La boue est donc très éloignée du milieu marin, tant géographiquement que chimiquement. La présence de trois isolats apparentés mais différents provenant de la même source prouve que ces prédateurs prospèrent dans cet environnement non marin. De plus, l'analyse du microbiome (fichiers de données disponibles sur https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990) a montré que la même séquence génétique de l'ARNr 16S se trouve dans les 50 taxons opérationnels les plus abondants (OTU ) Dans quelques intervalles d'échantillonnage de la boue. Plusieurs bactéries non cultivées ont été trouvées dans la base de données Genbank, qui possèdent des séquences génétiques d’ARNr 16S similaires à celles des bactéries ASxL5T. Ces séquences, ainsi que les séquences de ASxL5T, ASxS5 et ASxO5, semblent représenter différents clades séparés de Thalassolituus et Oceanobacter (Figure 2). Trois types de bactéries non cultivées (GQ921362, GQ921357 et GQ921396) ont été isolées de l'eau de fissure à une profondeur de 1,3 kilomètres dans la mine d'or sud-africaine en 2009, et les deux autres (DQ256320 et DQ337006) provenaient des eaux souterraines (également en Afrique du Sud). en 2005). La séquence du gène de l'ARNr 16S la plus étroitement apparentée à ASxL5T fait partie de la séquence du gène de l'ARNr 16S obtenue à partir de la culture d'enrichissement de sédiments sableux obtenue sur les plages du nord de la France en 2006 (numéro d'accession AM29240828). Une autre séquence génétique d’ARNr 16S étroitement apparentée provenant de la bactérie non cultivée HQ183822.1 a été obtenue à partir d’un réservoir de collecte lessivé d’une décharge municipale en Chine. Évidemment, les bactéries ASxL5T ne sont pas très représentatives dans les bases de données taxonomiques, mais ces séquences provenant de bactéries non cultivées sont susceptibles de représenter des organismes similaires à ASxL5T, répartis partout dans le monde, généralement dans des environnements difficiles. D'après l'analyse phylogénétique du génome entier, le parent le plus proche d'ASxL5T est Thalassolituus sp. C2-1, T. marinus, T. oleivorans. Et O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus fait partie des bactéries marines obligatoires de fragmentation des hydrocarbures (OHCB), largement répandues dans les environnements marins et terrestres, et qui deviennent généralement dominantes après des incidents de pollution par les hydrocarbures . Les bactéries marines ne font pas partie du groupe OHCB, mais sont isolées du milieu marin.
Les données phénotypiques indiquent que ASxL5T est une nouvelle espèce et membre d'un genre jusqu'alors non reconnu de la famille des spirospiracées marines. Il n’existe actuellement aucune norme claire permettant de classer les souches nouvellement isolées dans un nouveau genre. Des tentatives ont été faites pour déterminer les limites universelles des genres, par exemple, sur la base du pourcentage du génome d'une protéine conservatrice (POCP), il est recommandé que la valeur seuil soit identique à 50 % à celle de la souche de référence33. D’autres suggèrent d’utiliser les valeurs AAI, qui présentent des avantages par rapport au POCP car elles peuvent être obtenues à partir de génomes incomplets34. L'auteur estime que si la valeur de l'AAI est inférieure à 74 % par rapport à la souche modèle de l'espèce modèle, la souche est représentative d'un genre différent. Le genre modèle des spirillacées marines est le spirillum marin et la souche modèle est O. linum ATCC 11336T. La valeur AAI entre ASxL5T et O. linum ATCC 11336T est de 54,34 % et la valeur AAI entre ASxL5T et T. oleivorans MIL-1T (souches de type genre) est de 67,61 %, ce qui indique que ASxL5T représente un nouveau genre différent de Thalassolituus. En utilisant la séquence du gène de l’ARNr 16S comme norme de classification, la limite de délimitation du genre suggérée est de 94,5 %35. ASxL5T peut être placé dans le genre Thalassolituus, montrant 95,03 % d'identité de séquence d'ARNr 16S avec T. oleivorans MIL-1T et 96,17 %. marinus IMCC1826T. Cependant, il sera également placé dans le genre Bacteroides qui possède 94,64 % d'identité génétique de l'ARNr 16S avec B. sanyensis NV9, ce qui indique que l'utilisation d'un seul gène tel que le gène de l'ARNr 16S peut conduire à une classification et une attribution arbitraires. Une autre méthode suggérée utilise l’ANI et le Genome Alignment Score (AF) pour examiner le regroupement des points de données de tous les types et souches non-types des genres existants. L’auteur recommande de combiner la limite du genre avec le point d’inflexion du genre estimé propre aux taxons analysés. Cependant, s’il n’y a pas suffisamment de séquences génomiques complètes provenant des isolats de Thalassolituus, il est impossible de déterminer si ASxL5T appartient au genre Thalassolituus par cette méthode. En raison de la disponibilité limitée de séquences complètes du génome à analyser, l’ensemble de l’arbre phylogénétique du génome doit être interprété avec prudence. Deuxièmement, les méthodes de comparaison du génome entier ne peuvent pas tenir compte des différences substantielles dans la taille des génomes comparés. Ils ont mesuré la similarité des gènes centraux conservés à copie unique entre des genres apparentés, mais n'ont pas pris en compte le grand nombre de gènes qui ne sont pas présents dans le génome beaucoup plus petit d'ASxL5T. De toute évidence, ASxL5T et des groupes comprenant Thalassolituus, Oceanobacter et Bacterioplanes ont un ancêtre commun, mais l'évolution a pris un chemin différent, conduisant à une réduction du génome, qui pourrait être une adaptation à un mode de vie prédateur. Cela contraste avec T. oleivorans MIL-1T, qui est 28 % plus grand et a évolué sous différentes pressions environnementales pour utiliser les hydrocarbures23,30. Une comparaison intéressante peut être faite avec les parasites et symbiotes intracellulaires obligatoires, tels que Rickettsia, Chlamydia et Buchnera. La taille de leur génome est d'environ 1 Mo. La capacité à utiliser les métabolites des cellules hôtes entraîne une perte de gènes, ce qui entraîne une dégradation génomique évolutive importante. Les changements évolutifs des organismes marins nutritifs chimiques vers des modes de vie prédateurs peuvent entraîner une réduction similaire de la taille du génome. L'analyse COG et KEGG met en évidence le nombre de gènes utilisés pour des fonctions spécifiques et les différences globales dans les voies génomiques entre ASxL5T et T. oleivorans MIL-1T, qui ne sont pas dues à la disponibilité généralisée d'éléments génétiques mobiles. La différence dans le rapport G + C de l'ensemble du génome d'ASxL5T est de 56,1 %, et celui de T. oleivorans MIL-1T est de 46,6 %, ce qui indique également qu'il est ségrégué.
L'examen du contenu codant du génome ASxL5T fournit des informations fonctionnelles sur les caractéristiques phénotypiques. La présence de gènes codant pour les fimbriae de type IV (Tfp) est particulièrement intéressante car ils favorisent le mouvement cellulaire, appelé glissement social ou convulsions, sans flagelles à la surface. Selon les rapports, le Tfp a d'autres fonctions, notamment la prédation, la pathogenèse, la formation de biofilm, l'absorption naturelle de l'ADN, l'agrégation et le développement automatiques des cellules38. Le génome ASxL5T contient 18 gènes codant pour la diguanylate cyclase (une enzyme qui catalyse la conversion du 2 guanosine triphosphate en guanosine 2 phosphate et diGMP cyclique) et 6 gènes codant pour le diguanylate cyclase phosphate correspondant. Le gène de l'estérase (catalysant la dégradation du di-GMP cyclique en guanosine monophosphate) est intéressant car le cycl-di-GMP est un deuxième messager important impliqué dans le développement et la séparation du biofilm, le mouvement, l'attachement cellulaire et la virulence 39, 40 dans le processus. Il convient également de noter que chez Bdellovibrio bacteriovorus, il a été démontré que le double GMP cyclique contrôle la transition entre la vie libre et le mode de vie prédateur41.
La plupart des recherches sur les bactéries prédatrices se sont concentrées sur les espèces de Bdellovibrio, de type Bdellovibrio et de Myxococcus. Ces exemples et d’autres exemples connus de bactéries prédatrices forment un groupe diversifié. Malgré cette diversité, un ensemble de familles de protéines caractéristiques reflétant les phénotypes de 11 bactéries prédatrices connues ont été identifiées3,22. Cependant, seuls les gènes codant pour l’antigène O ligase (waaL) ont été identifiés, ce qui est particulièrement fréquent chez les bactéries Gram-négatives. Cette forme d’analyse n’est pas utile pour désigner ASxL5T comme prédateur, probablement parce qu’elle utilise une nouvelle stratégie d’attaque. La disponibilité de génomes bactériens prédateurs plus diversifiés aidera à développer des analyses à résolution plus fine qui prendront en compte les preuves des différences fonctionnelles et environnementales entre les membres du groupe. Parmi les exemples de bactéries prédatrices non incluses dans cette analyse figurent les membres de Cupriavidus necator42 et de Bradymonabacteria43, car à mesure que les chercheurs étudient différentes communautés microbiennes, davantage de taxons prédateurs sont établis.
La caractéristique la plus remarquable des bactéries ASxL5T capturées par l’image TEM est sa morphologie unique et flexible, qui peut favoriser l’interaction avec les bactéries proies. Le type d’interaction observé est différent de celui d’autres bactéries prédatrices et n’a jamais été découvert ni signalé auparavant. Le cycle de vie prédateur ASxL5T proposé est illustré à la figure 5. Il existe peu d'exemples dans la littérature avec des structures apicales similaires à celles que nous rapportons ici, mais ces exemples incluent Terasakiispira papahanaumokuakeensis, une bactérie spirille marine avec un élargissement occasionnel de l'apex 44, et Alphaproteobacteria, Terasakiella pusilla. , appartenant autrefois au genre Oceanospirillum, présentant ce qu'on appelle le « film polaire » 45. Les formes de cocci sont souvent observées dans les cultures plus anciennes, en particulier pour les bactéries aux formes courbes, telles que Vibrio, Campylobacter et Helicobacter 46, 47, 48, qui peuvent représenter un état dégradé. Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour clarifier le cycle de vie précis des bactéries ASxL5T. Déterminer comment il capture et chasse, et si son génome code pour des composés biologiquement actifs qui peuvent être utilisés à des fins médicales ou biotechnologiques.
Description de Venatorbacter gen. Novembre Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. est composé de venators de L. n. venator, « chasseur » et Gr. n. bacter, « un bâtonnet ». Venatorbacter, « un bâtonnet de chasse » Les cellules sont aérobies, tolérantes au sel, coloration de Gram incurvée négative, l'activité catalase et oxydase ne s'accumule pas dans la plage de température de 4 à 42 °C. Incarnés. La plage de pH de 4 à 9 est inhabituelle. Chez les escargots marins, la plupart sont intolérants au pH acide. Les principaux acides gras sont C16:1ω6c et/ou C16:1ω7c, C16:0 et C18:1ω9 ; -OH et C10:0 3-OH se trouvent sous forme d'acides gras hydroxylés. Ils ne poussent pas dans les milieux en bouillon. La teneur en ADN G + C. est de 56,1% en moles. Les membres de ce genre présentent une résistance à Campylobacter Et le comportement de prédation des membres de la famille des Enterobacteriaceae. La position phylogénétique de ce genre est dans la famille.
Description de Venatorbacter cucullus sp. Novembre Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus signifie carénage).
De plus, la caractéristique descriptive de ce genre est que lorsqu'elles sont cultivées sur BA ou BHI, les cellules mesurent 1,63 µm de long et 0,37 µm de large. Les colonies sur gélose BHI sont très petites, atteignant 2 mm de diamètre après 72 heures. Ils sont beiges, translucides, ronds, convexes et brillants. Les membres de cette espèce peuvent utiliser Escherichia coli et Klebsiella. Campylobacter et plusieurs autres bactéries à Gram négatif servent de proies.
La souche typique ASxL5T a été isolée du lait de bœuf dans le Nottinghamshire, au Royaume-Uni, et déposée dans la National Type Culture Collection (Royaume-Uni) : numéro d'accès NCTC 14397 et dans la Dutch Bacterial Culture Collection (NCCB), numéro d'accès NCCB 100775. La séquence complète du génome d'ASxL5T a été déposé à Genbank selon l'ajout du CP046056.
Les bactéries ASxL5T ont été isolées du lait de bœuf à l’aide de la technologie d’isolement des phages9,49. La suspension a été diluée au 1:9 (p/v) dans un tampon SM (Tris-HCl 50 mM [pH 7,5], NaCl 0,1 M, MgSO4,7H2O 8 mM et 0,01 % de gélatine ; Sigma Aldrich, Gillingham, Royaume-Uni), puis incubée. à 4°C pendant 24 heures, en tournant lentement pour éluer les prédateurs dans le tampon. La suspension a été centrifugée à 3 000 g pendant 3 minutes. Le surnageant a été collecté et centrifugé à 13 000 g une seconde fois pendant 5 minutes. Le surnageant a ensuite été passé à travers un filtre à membrane de 0,45 µm (Minisart ; Sartorius, Göttingen, Allemagne) et un filtre à membrane de 0,2 µm (Minisart) pour éliminer toutes les cellules bactériennes restantes. ASxL5T peut passer ces filtres. Une pelouse de gélose molle de Campylobacter enterosus S12 (numéro d'accès NCBI CP040464) à partir de la même suspension a été préparée en utilisant des techniques standards. La suspension filtrée a été distribuée sur chacune de ces plaques de cellules hôtes en gouttelettes de 10 µl en triple et laissée sécher. La plaque a été incubée dans une cuve microaérophile à 37°C pendant 48 heures dans des conditions microaérobies (5 % O2, 5 % H2, 10 % CO2 et 80 % N2). La plaque visible obtenue a été extraite dans un tampon SM et transférée sur la pelouse fraîche de C. hyointestinalis S12 pour propager davantage les organismes lysés. Une fois qu’il est déterminé que les bactéries sont à l’origine de la plaque lytique et non du phage, essayez de faire croître l’organisme indépendamment de l’hôte et de le caractériser davantage. La culture aérobie a été réalisée à 37 ° C avec 5 % v/v de sang de cheval défibriné (TCS Biosciences Lt, Buckingham, Royaume-Uni, supplément). Selon les directives du Comité national des normes cliniques, la méthode de diffusion sur disque est utilisée pour les tests de sensibilité aux antibactériens. La gélose BHI a été cultivée à 37 ° C en utilisant un disque contenant les antibiotiques suivants (Oxoid) pour la culture aérobie : amoxicilline et acide clavulanique 30 µg ; céfotaxime 30 µg ; streptomycine 10 µg ; ciprofloxacine 5 µg ; Ceftazidime 30 µg Acide nalidixique 30 µg ; Imipénème 10 µg ; Azithromycine 15 µg ; Chloramphénicol 30 µg ; Céfoxitine 30 µg ; Tétracycline 30 µg ; Nitrofurantoïne 300 µg ; Aztréonam 30 µg ; Ampicilline 10 µg ; Céfpodoxime 10 µg ; Triméthoprime-Sulfaméthoxazole 25 µg. La tolérance au sel a été établie par incubation aérobie sur des plaques de gélose BHI à 37 °C. Du NaCl supplémentaire a été ajouté aux plaques de gélose BHI pour fournir une plage de concentrations allant jusqu'à 10 % p/v. La plage de pH est déterminée par culture aérobie sur des plaques de gélose BHI à 37°C, où la plage de pH a été ajustée entre 4 et 9 avec du HCl stérile ou du NaOH stérile, et la valeur de pH cible est vérifiée avant de verser la plaque. Pour l'analyse des acides gras cellulaires, ASxL5T a été cultivé sur gélose BHI pendant 3 jours en aérobie à 37 ° C. Selon le protocole standard MIDI (Sherlock Microbial Identification System, version 6.10) de FERA Science Ltd (York, Royaume-Uni), les acides gras cellulaires ont été extraits, préparés et analysés.
Pour le TEM, ASxL5T a été cultivé en aérobie en étalant uniformément sur BA à 37 ° C pendant 24 heures, puis récolté dans 1 ml de glutaraldéhyde à 3% (v / v) dans un tampon cacodylate 0, 1 M à température ambiante. Fixer pendant 1 heure, puis centrifuger. à 10 000 g pendant 3 minutes. Puis remettre délicatement le culot dans 600 ul de tampon cacodylate 0,1 M. Transférer la suspension fixe ASxL5T sur le film Formvar/carbone sur une grille en cuivre de 200 mesh. Les bactéries ont été colorées avec 0,5 % (p/v) d'acétate d'uranyle pendant 1 minute et examinées par TEM à l'aide d'un microscope TEI Tecnai G2 12 Biotwin. Comme mentionné ci-dessus, combiner le même nombre de proies et de prédateurs dans un bouillon NZCYM (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) et incuber pendant 48 heures dans des conditions microaérobies de Campylobacter ou Campylobacter à 37°C. L'interaction du prédateur et de la proie a également été examiné par TEM. Conditions aérobies pour Escherichia coli. Examinez indépendamment les proies et les bactéries prédatrices pour déterminer tout changement dans la morphologie cellulaire dû à la prédation. La méthode du noir du Soudan a été utilisée pour la microscopie optique de l’accumulation de PHB.
Cultivez des cultures ASxL5T pendant la nuit en étalant la croissance sur des plaques BHI ou BA avec un écouvillon stérile. Recueillir les cellules ASxL5T et les suspendre dans MRD (CM0733, Oxoid), puis les placer à 4°C pendant 7 jours pour affamer les cellules. La culture bactérienne de référence NCTC ou de laboratoire a été inoculée dans un bouillon BHI ou un bouillon nutritif n ° 2 (CM007, Oxoid), incubée pendant la nuit, centrifugée à 13 000 g et remise en suspension dans du MRD jusqu'à ce que la DO600 soit de 0,4. Culture : Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, Klebsiella oxytoca 11466, Leuconostoc NCTC 10817, Listeria Special bactéries NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, Hamburger sous-marin Rhodococcus NCTC 1621T, Bactéries intestinales Salmonella Mondeville NCTC 5747, mucilage NCTC 10861, Staphylococcus aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. L'hôte Campylobacter a été incubé en microaérobie sur des plaques BA à 37 ° C et mis en suspension dans un bouillon NZCYM. Les hôtes Campylobacter testés sont : C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11458, C. lari NCTC 11458, C. jejuni PT14 , C... Recueillir des cellules dans MRD, centrifuger à 13 000 g et remettre en suspension dans MRD jusqu'à ce que la DO600 soit de 0,4. Ajouter une aliquote de 0,5 ml de suspension à 5 ml de gélose supérieure NZCYM fondue (agar à 0,6 %) et verser sur une plaque inférieure à 1,2 % NZCYM. Après durcissement et séchage, l'ASxL5T dilué en série a été distribué sous forme de gouttelettes de 20 µl sur chaque planche de pelouse en triple. La température et l'atmosphère de culture dépendent des exigences des bactéries testées.
Utilisez le kit d’ADN génomique bactérien GenElute™ (Sigma Aldridge) pour préparer l’ADN à partir d’isolats bactériens. Des méthodes standard ont été utilisées pour l'amplification PCR du gène de l'ARNr 16S et la détermination de la séquence du produit à l'aide d'une chimie de terminaison de colorant (Eurofins Value Read Service, Allemagne). Utilisez le programme BLAST-N pour comparer ces séquences avec d’autres séquences génétiques d’ARNr 16S afin d’identifier et de collecter des espèces étroitement apparentées. Ceux-ci sont alignés à l'aide de ClustalW dans le programme MEGA X. L'arbre phylogénétique a été reconstruit à l'aide de MEGA X en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance basée sur le modèle Tamura-Nei, avec 1000 copies guidées54. Utilisez le kit PureLink™ Genomic DNA (Fisher Scientific, Loughborough, Royaume-Uni) pour extraire l’ADN en vue du séquençage du génome entier. La séquence génomique d'ASxL5T a été déterminée à l'aide de la combinaison Illumina MiSeq, qui consiste en des lectures doubles de 250 pb composées d'une bibliothèque préparée à l'aide du kit de marquage Nextera et de lectures longues de 2 à 20 kb à partir de la plateforme PacBio. Centre de recherche sur le séquençage de l'ADN génomique de l'Université de Sembia. Le génome a été assemblé à l'aide de CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen, Aarhus, Danemark). Les cultures ASxL5T sont déposées auprès de la National Type Culture Collection (Royaume-Uni) et de la Nederland Bacterial Culture Collection (NCCB). Les génomes d'organismes apparentés utilisés à des fins de comparaison sont : Thalassolituus oleivorans MIL-1T (numéro d'accès HF680312, complet) ; Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (numéro d'accession BMYY01000001, incomplet); Oceanobacter kriegii DSM 6294T (numéro d'accès NZ_AUGV00000000, incomplet) ; Communauté Marinamonas DSM 5604T (ajouté ASM436330v1, incomplet), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (ajouté MTSD02000001, incomplet) et Thalassolituus sp. C2-1 (ajouter NZ_VNIL01000001, incomplet). Utilisez JGI ​​Genome Portal36 sur https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page= pour déterminer le score d'alignement (AF) et l'identité moyenne de l'acide nucléique (ANI). Par paires. La méthode de Rodriguez-R & Konstantinidis55 a été utilisée pour déterminer l'identité des acides aminés (AAI). Utilisez GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 pour générer un arbre phylogénétique estimé à maximum de vraisemblance. Le génome d'entrée représentant le génome de référence disponible est sélectionné parmi les genres de référence identifiés comme étant liés à ASxL5T de la phylogénie de l'ARNr 16S. Annotation de l'arbre à l'aide de l'outil interactif en ligne de l'arbre de vie (https://itol.embl.de/). L'annotation fonctionnelle et l'analyse du génome ASxL5T sont réalisées à l'aide de l'outil en ligne BlastKOALA KEGG utilisant la distribution d'enrichissement du module KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). La répartition des catégories COG (groupes orthologues) est déterminée à l'aide de l'outil en ligne eggNOG-mapper.
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