Illouse un novo tipo de bacterias gramnegativas, aeróbicas, tolerantes ao sal, activas, en forma de bastón e depredadoras ASxL5T dun estanque de esterco de vaca en Nottinghamshire, Inglaterra, e utilizou Campylobacter como presa. Posteriormente, outras especies de Campylobacter e membros da familia Enterobacteriaceae foron descubertas como presas. Despois do subcultivo sen células hóspedes, conseguiuse un débil crecemento aséptico en Brain Heart Infusion Agar. As condicións óptimas de crecemento son 37 °C e o pH é 7. A microscopía electrónica de transmisión revelou algunhas características morfolóxicas moi pouco habituais relacionadas coa dispoñibilidade de presas. A análise filoxenética mediante a secuencia do xene do ARNr 16S indicou que o illado está relacionado cun membro da familia da espirulina mariña, pero non se pode clasificar claramente como membro de ningún xénero coñecido. A secuenciación do xenoma completo de ASxL5T confirmou a relación cos membros das espiroquetas mariñas. Unha busca na base de datos revelou que varios ASxL5T comparten secuencias de xenes de ARNr 16S con varias bacterias sen cultivar do océano, da superficie terrestre e das augas subterráneas. Suxerimos que a cepa ASxL5T representa unha nova especie nun novo xénero. Recomendamos o nome Venatorbacter cucullus gen. novembro, sp. En novembro, utilizouse ASxL5T como cepa tipo.
As bacterias depredadoras son bacterias que presentan a capacidade de cazar e matar outras bacterias vivas para obter materiais biosintéticos e enerxía. Isto é diferente da recuperación xeral de nutrientes de microorganismos mortos, e tamén é diferente das interaccións parasitarias, nas que as bacterias forman unha estreita relación co seu hóspede sen matalos. As bacterias depredadoras desenvolveron diferentes ciclos de vida para aproveitar abundantes fontes de alimento nos nichos onde se atopan (como os hábitats mariños). Son un grupo taxonómicamente diverso, que só están conectados polo seu único ciclo de vida de esterilización1. Atopáronse exemplos de bacterias depredadoras en varios filos diferentes, incluíndo: Proteobacterias, Bacteroides e Chlorella.3. Porén, as bacterias depredadoras máis ben estudadas son os organismos Bdellovibrio e Bdellovibrio e similares (BALOs4). As bacterias depredadoras son unha fonte prometedora de novos compostos bioloxicamente activos e axentes antibacterianos5.
Crese que as bacterias depredadoras melloran a diversidade microbiana e teñen un impacto positivo na saúde, produtividade e estabilidade dos ecosistemas6. A pesar destes atributos positivos, hai poucos estudos sobre novas bacterias depredadoras debido á dificultade de cultivar bacterias e á necesidade de observar coidadosamente as interaccións celulares para comprender os seus complexos ciclos vitais. Esta información non é fácil de obter da análise informática.
Nunha era de aumento da resistencia aos antimicrobianos, estanse estudando novas estratexias para dirixirse aos patóxenos bacterianos, como o uso de bacteriófagos e bacterias depredadoras7,8. As bacterias ASxL5T illáronse en 2019 mediante tecnoloxía de illamento de fagos a partir de esterco de vaca recollido do Centro de produtos lácteos da Universidade de Nottingham, Nottinghamshire. O obxectivo da investigación é illar organismos con potencial como axentes de control biolóxico. Campylobacter hyointestinalis é un patóxeno zoonótico, que se asocia cada vez máis con enfermidades intestinais humanas10. É omnipresente no soro e úsase como hóspede obxectivo.
A bacteria ASxL5T illouse da marmelada de carne porque se observou que as placas que formaba no céspede de C. hyointestinalis eran similares ás producidas polos bacteriófagos. Este é un achado inesperado, porque parte do proceso de illamento do fago implica filtrar a través dun filtro de 0,2 µm, que está deseñado para eliminar células bacterianas. O exame microscópico do material extraído da placa revelou que as pequenas bacterias gramnegativas curvas en forma de vara non acumulaban polihidroxibutirato (PHB). O cultivo aséptico independente das células da presa realízase en medio sólido rico (como agar de infusión de corazón cerebral (BHI) e agar sangue (BA)), e o seu crecemento é débil. Obtense despois do subcultivo con inóculo pesado mellorar. Crece igual de ben en condicións microaeróbicas (7% v/v de osíxeno) e de osíxeno atmosférico, pero non nunha atmosfera anaeróbica. Despois de 72 horas, o diámetro da colonia era moi pequeno, chegando aos 2 mm, e era beis, translúcido, redondo, convexo e brillante. As probas bioquímicas estándar dificultan porque ASxL5T non se pode cultivar de forma fiable en medios líquidos, o que suxire que pode depender do complexo ciclo de vida da formación de biopelículas. Non obstante, a suspensión de placas mostrou que ASxL5T é aeróbica, positiva para oxidase e catalase e pode tolerar un 5% de NaCl. ASxL5T é resistente a 10 µg de estreptomicina, pero é sensible a todos os outros antibióticos probados. As células bacterianas ASxL5T foron examinadas por TEM (Figura 1). Cando se cultivan sen células de presa no BA, as células ASxL5T son pequenas Campylobacter, cunha lonxitude media de 1,63 μm (± 0,4), un ancho de 0,37 μm (± 0,08) e un só polo longo (ata 5 μm). Flaxelos sexuais. Aproximadamente o 1,6% das células parecen ter un ancho inferior a 0,2 μm, o que permitirá o paso polo dispositivo de filtro. Observouse unha extensión estrutural inusual na parte superior dalgunhas células, semellante a un carenado (cucullus en latín) (ver as frechas en 1D, E, G). Este parece estar composto por exceso de membrana externa, que pode deberse á rápida redución do tamaño da envoltura periplásmica, mentres que a membrana externa permanece intacta, mostrando un aspecto "solto". O cultivo de ASxL5T en ausencia de nutrientes (en PBS) durante moito tempo a 4 ° C deu lugar a que a maioría das células (pero non todas) mostrasen unha morfoloxía coco (Figura 1C). Cando ASxL5T crece con Campylobacter jejuni como presa durante 48 horas, o tamaño medio das células é significativamente máis longo e estreito que as células cultivadas sen un hóspede (táboa 1 e figura 1E). Pola contra, cando ASxL5T crece con E. coli como presa durante 48 horas, o tamaño medio da célula é máis longo e ancho que cando crece sen presa (táboa 1), e a lonxitude celular é variable, mostrando normalmente filamentosas (figura 1F). Cando se incubaron con Campylobacter jejuni ou E. coli como presa durante 48 horas, as células ASxL5T non mostraban ningún flaxelo. A táboa 1 resume as observacións dos cambios no tamaño das células en función da presenza, ausencia e tipo de presa de ASxL5T.
Pantalla TEM de ASx5LT: (A) ASx5LT mostra un látego longo; (B) batería ASx5LT típica; (C) células cocos ASx5LT despois dunha longa incubación sen nutrientes; (D) un grupo de células ASx5LT mostra anormalidade (E) O grupo de células ASx5LT incubadas con presas de Campylobacter mostrou un aumento da lonxitude celular en comparación con aquelas sen crecemento da presa (D) tamén mostrou estrutura apical; (F) Grandes flaxelos filamentosos, células ASx5LT, despois da incubación con presas de E. coli; (G) Unha única célula ASx5LT despois da incubación con E. coli, que mostra unha estrutura superior inusual. A barra representa 1 μm.
A determinación da secuencia do xene do ARNr 16S (número de acceso MT636545.1) permite que as buscas de bases de datos establezan secuencias similares ás da clase Gammaproteobacteria, e que están máis próximas ás bacterias mariñas da familia mariña spirillum (Figura 2) e son membros do xénero Thalassolituus. O parente máis próximo ao bacilo mariño. A secuencia do xene do ARNr 16S é claramente diferente das bacterias depredadoras pertencentes á familia Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria). As comparacións por parellas de B. bacteriovorus HD100T (cepa tipo, DSM 50701) e B. bacteriovorus DM11A foron do 48,4% e do 47,7%, e para B. exovorus JSS foi do 46,7%. As bacterias ASxL5T teñen 3 copias do xene do ARNr 16S, dúas das cales son idénticas entre si, e a terceira está separada por 3 bases. Outros dous illados bacterianos depredadores (ASx5S e ASx5O; os números de acceso ao xene de ARNr 16S son MT636546.1 e MT636547.1, respectivamente) con características morfolóxicas e fenotípicas similares da mesma localización non son iguais, pero son diferentes de ASxL5T e de bacterias sen cultivar. as secuencias de bases de datos están agrupadas con outros xéneros en Oceanospirillaceae (Figura 2). Determinouse e gardouse toda a secuencia do xenoma de ASxL5T na base de datos NCBI, e o número de acceso é CP046056. O xenoma de ASxL5T consiste nun cromosoma circular de 2.831.152 pb cunha relación G + C do 56,1%. A secuencia do xenoma contén 2653 CDS (total), dos cales 2567 están previstos para codificar proteínas, dos cales 1596 poden asignarse como funcións supostas (60,2%). O xenoma contén 67 xenes que codifican ARN, incluíndo 9 ARNr (3 cada un para 5S, 16S e 23S) e 57 ARNt. Comparáronse as características xenómicas de ASxL5T cos xenomas dispoñibles das cepas do tipo relativo máis próximo identificado a partir da secuencia do xene do ARNr 16S (táboa 2). Use a identidade de aminoácidos (AAI) para comparar todos os xenomas de Thalassolituus dispoñibles con ASxL5T. A secuencia do xenoma dispoñible (incompleta) máis próxima determinada pola AAI é Thalassolituus sp. C2-1 (engadir NZ_VNIL01000001). Esta cepa foi illada dos sedimentos mariños profundos da fosa das Marianas, pero actualmente non hai información fenotípica sobre esta cepa para comparar. En comparación cos 2,82 Mb de ASxL5T, o xenoma do organismo é maior con 4,36 Mb. O tamaño medio do xenoma das espiroquetas mariñas é duns 4,16 Mb (± 1,1; n = 92 xenomas de referencia completos investigados desde https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), polo que o xenoma de ASxL5T está en liña co orde En comparación cos outros membros, é bastante pequeno. Use GToTree 1.5.54 para xerar unha árbore filoxenética de máxima probabilidade estimada baseada no xenoma (Figura 3A), utilizando as secuencias de aminoácidos aliñadas e ligadas de 172 xenes dunha soa copia específicos de Gammaproteobacteria 11,12,13,14,15,16, 17,18. A análise mostrou que está moi relacionado con Thalassolituus, Bacterial Plane e Marine Bacterium. Non obstante, estes datos indican que ASxL5T é diferente dos seus parentes na espirulina mariña e están dispoñibles os datos da súa secuencia do xenoma.
A árbore filoxenética que utiliza a secuencia do xene de ARNr 16S destaca a posición das cepas ASxL5T, ASxO5 e ASxS5 (coas tripas) en relación ás cepas de bacterias mariñas e non cultivadas nas Spirulinaceae mariñas. O número de acceso Genbank segue o nome da cepa entre parénteses. Use ClustalW para aliñar secuencias e use o método de máxima verosimilitud e o modelo Tamura-Nei para inferir relacións filoxenéticas e realice 1000 replicacións guiadas no programa MEGA X. O número da rama indica que o valor da copia guiada é superior ao 50%. Escherichia coli U/541T utilizouse como grupo externo.
(A) Unha árbore filoxenética baseada no xenoma, que mostra a relación entre a bacteria mariña Spirospiraceae ASxL5T e os seus parentes próximos, E. coli U 5/41T como grupo externo. (B) En comparación con T. oleivorans MIL-1T, a distribución das categorías funcionales dos xenes prevese en función do grupo ortólogo (COG) da proteína ASx5LT. A figura da esquerda mostra o número de xenes en cada categoría de COG funcional en cada xenoma. O gráfico da dereita mostra a porcentaxe de xenomas contidos en cada grupo COG funcional. (C) En comparación con T. oleiverans MIL-1T, a análise da vía modular completa KEGG (Enciclopedia de xenes e xenomas de Kioto) de ASxL5T.
Usando a base de datos KEGG para examinar os xenes compoñentes presentes no xenoma ASxL5T revelou a vía metabólica típica do Proteus gamma aerobio. ASxL5T contén un total de 75 xenes asignados a proteínas motoras bacterianas, incluíndo xenes implicados na quimiotaxis, ensamblaxe de flaxelos e sistema de fimbrias tipo IV. Na última categoría, 9 de cada 10 xenes son responsables do movemento de contraccións doutros organismos. O xenoma de ASxL5T contén unha vía biosintética completa de tetrahidropirimidina que participa na resposta protectora ao estrés osmótico20, como se esperaba para os halófilos. O xenoma tamén contén moitas vías completas de cofactores e vitaminas, incluíndo as vías de síntese de riboflavina. Aínda que o xene da alcano 1-monooxixenase (alkB2) está presente en ASxL5T, a vía de utilización de hidrocarburos non está completa. Na secuencia do xenoma de ASxL5T, homólogos de xenes identificados como os principais responsables da degradación dos hidrocarburos en T. oleiverans MIL-1T21, como TOL_2658 (alkB) e TOL_2772 (alcohol deshidroxenase) están obviamente ausentes. A figura 3B mostra a comparación da distribución xenética na categoría COG entre ASxL5T e o aceite de oliva MIL-1T. En xeral, o xenoma ASxL5T máis pequeno contén proporcionalmente menos xenes de cada categoría COG en comparación co xenoma relacionado máis grande. Cando o número de xenes de cada categoría funcional se expresa como unha porcentaxe do xenoma, obsérvanse diferenzas na porcentaxe de xenes nas categorías de tradución, estrutura ribosómica e bioxénese e as categorías de funcións de produción e conversión de enerxía, que constitúen o ASxL5T máis grande. xenoma A porcentaxe compárase co mesmo grupo presente no xenoma MIL-1T de T. oleiverans. Pola contra, en comparación co xenoma ASxL5T, T. oleivorans MIL-1T ten unha maior porcentaxe de xenes nas categorías de replicación, recombinación e reparación e transcrición. Curiosamente, a maior diferenza no contido de cada categoría funcional dos dous xenomas é o número de xenes descoñecidos presentes en ASxL5T (Figura 3B). Realizouse unha análise de enriquecemento dos módulos KEGG, onde cada módulo KEGG representa un conxunto de unidades funcionais definidas manualmente para a anotación e interpretación biolóxica dos datos da secuencia do xenoma. A comparación da distribución xenética na vía completa do módulo KOG de ASxL5T e a oliva MIL-1T móstrase na figura 3C. Esta análise mostra que aínda que ASxL5T ten unha vía metabólica completa de xofre e nitróxeno, T. oleiverans MIL-1T non. Pola contra, T. oleiverans MIL-1T ten unha vía metabólica completa de cisteína e metionina, pero está incompleta en ASxL5T. Polo tanto, ASxL5T ten un módulo característico para a asimilación de sulfatos (definido como un conxunto de xenes que se poden utilizar como marcadores fenotípicos, como a capacidade metabólica ou a patoxenicidade; https://www.genome.jp/kegg/module.html) En T . Oleiveranos MIL-1T. Comparar o contido xenético de ASxL5T coa lista de xenes que suxiren un estilo de vida depredador non é concluínte. Aínda que o xene waaL que codifica a ligase asociada ao polisacárido do antíxeno O no núcleo está presente no xenoma ASxL5T (pero é común en moitas bacterias Gram negativas), os xenes da triptófano 2,3-dioxixenase (TDO) poden incluír os 60 aminoácidos. rexións ácidas que se atopan habitualmente en bacterias depredadoras que non están presentes. Non hai outros xenes característicos depredadores no xenoma ASxL5T, incluídos os que codifican encimas implicados na biosíntese dos isoprenoides na vía do mevalonato. Teña en conta que non hai xene regulador transcripcional gntR no grupo de depredadores examinado, pero pódense identificar tres xenes similares a gntR en ASxL5T.
As características fenotípicas de ASxL5T resúmense na táboa 3 e compáranse coas características fenotípicas dos xéneros relacionados 23, 24, 25, 26 e 27 informados na literatura. Os illados de T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis e Oceanobacter kriegii son corpos activos, tolerantes ao sal e positivos á oxidase, pero case non teñen outras características fenotípicas con ASxL5T. O pH medio do océano é de 8,1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77), que se reflicte en T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis e O. kriegii. ASxL5T é axeitado para o intervalo de pH máis amplo (4-9) típico das especies non mariñas. Características fenotípicas de Thalassolituus sp. C2-1. Descoñecido. O intervalo de temperatura de crecemento de ASxL5T é xeralmente máis amplo que o das cepas mariñas (4–42 °C), aínda que algúns, pero non todos, illados de T. marinus son tolerantes á calor. A incapacidade de cultivar ASxL5T en medios de caldo impediu unha maior caracterización fenotípica. Use API 20E para probar os materiais raspados da placa BA, ONPG, arginina dihidrolase, lisina descarboxilase, ornitina descarboxilase, utilización de citrato, urease, triptófano desaminase, hidrólise de xelatina Enzima, os resultados das probas foron todos negativos, pero ningún indol, acetoína e H2S. foron producidos. Os carbohidratos non fermentados inclúen: glicosa, manosa, inositol, sorbitol, ramnose, sacarosa, melibiósa, amigdalina e arabinosa. En comparación coas cepas de referencia relacionadas publicadas, o perfil de ácidos graxos celulares da cepa ASxL5T móstrase na táboa 4. Os principais ácidos graxos celulares son C16:1ω6c e/ou C16:1ω7c, C16:0 e C18:1ω9. Tamén existen ácidos graxos hidroxi C12:0 3-OH e C10:0 3-OH. A proporción de C16:0 en ASxL5T é superior ao valor informado dos xéneros relacionados. Pola contra, en comparación co IMCC1826TT de T. marinus informado, a proporción de C18:1ω7c e/ou C18:1ω6c en ASxL5T redúcese. oleivorans MIL-1T e O. kriegii DSM 6294T, pero non se detectaron en B. sanyensis KCTC 32220T. A comparación dos perfís de ácidos graxos de ASxL5T e ASxLS revelou diferenzas sutís na cantidade de ácidos graxos individuais entre as dúas cepas, que son consistentes coa secuencia de ADN xenómico da mesma especie. Non se detectaron partículas de poli-3-hidroxibutirato (PHB) mediante a proba do negro de Sudán.
Estudou a actividade de depredación das bacterias ASxL5T para determinar o rango de presas. Esta bacteria pode formar placas nas especies de Campylobacter, incluíndo: Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T; Escherichia coli NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; C lari NCTC 11458 e C. upsaliensis NCTC 11541T. Use os cultivos indicados na sección de determinación do intervalo de hóspedes do método para probar unha gama máis ampla de bacterias Gram negativas e Gram positivas. Os resultados mostran que ASxL5T tamén se pode usar en Escherichia coli NCTC 86 e Citrobacter freundii NCTC 9750T. As placas formadas en Klebsiella oxytoca 11466. A interacción TEM con E. coli NCTC 86 móstrase na Figura 4A-D, e a interacción con Campylobacter jejuni PT14 e Campylobacter suis S12 móstrase na Figura 4E-H medio. O mecanismo de ataque parece ser diferente entre os tipos de presas probados, cunha ou máis células de E. coli unidas a cada célula ASxL5T e situadas lateralmente ao longo da célula estendida antes da adsorción. Pola contra, ASxL5T parece unirse a Campylobacter a través dun único punto de contacto, normalmente en contacto co ápice da célula depredadora e preto do ápice da célula de Campylobacter (Figura 4H).
TEM que mostra a interacción entre ASx5LT e presas: (AD) e presas de E. coli; (EH) e C. jejuni presa. (A) Unha célula ASx5LT típica conectada a unha única célula de E. coli (EC); (B) Un ASx5LT filamentoso unido a unha única célula EC; (C) Unha célula ASx5LT filamentosa conectada a varias células EC; (D) Anexo de células ASx5LT máis pequenas nunha única célula de E. coli (EC); (E) unha única célula ASx5LT conectada a unha célula de Campylobacter jejuni (CJ); (F) ASx5LT ataca as células de C. hyointestinalis (CH); (G) dúas células One ASx5LT atacaron unha célula CJ; (H) Unha vista en primeiro plano do punto de unión ASx5LT, preto do vértice da célula CJ (bar 0,2 μm). A barra representa 1 μm en (A–G).
As bacterias depredadoras evolucionaron para aproveitar abundantes fontes de presas. Obviamente, están moi presentes en moitos ambientes diferentes. Debido ao reducido tamaño dos membros da poboación, é posible illar as bacterias ASxL5T da suspensión mediante o método de separación de fagos. A relevancia xenómica de ASxL5T para os membros da familia oceanospirillaceae de bacterias mariñas é sorprendente, aínda que o organismo é tolerante ao sal e pode crecer nun medio que conteña un 5% de sal. A análise da calidade da auga da suspensión mostrou que o contido de cloruro de sodio era inferior ao 0,1%. Polo tanto, o barro está lonxe do medio mariño, tanto xeográfica como químicamente. A presenza de tres illados relacionados pero diferentes da mesma fonte proporciona evidencia de que estes depredadores están a prosperar neste medio non mariño. Ademais, a análise do microbioma (arquivos de datos dispoñibles en https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990) mostrou que a mesma secuencia do xene de ARNr 16S está situada nos 50 taxons operativos máis abundantes (OTU). ) En poucos intervalos de mostraxe da lama. Atopáronse varias bacterias sen cultivar na base de datos Genbank, que teñen secuencias de xenes de ARNr 16S similares ás bacterias ASxL5T. Estas secuencias, xunto coas secuencias de ASxL5T, ASxS5 e ASxO5, parecen representar diferentes clados separados de Thalassolituus e Oceanobacter (Figura 2). Tres tipos de bacterias sen cultivar (GQ921362, GQ921357 e GQ921396) foron illados da auga da fisura a unha profundidade de 1,3 quilómetros na mina de ouro de Sudáfrica en 2009, e os outros dous (DQ256320 e DQ337006) foron tamén de augas subterráneas de África do Sur en 2005). A secuencia do xene de ARNr 16S máis relacionada con ASxL5T forma parte da secuencia do xene de ARNr 16S obtida a partir do cultivo de enriquecemento de sedimentos areosos obtidos das praias do norte de Francia en 2006 (número de acceso AM29240828). Outra secuencia do xene de ARNr 16S estreitamente relacionada da bacteria HQ183822.1 non cultivada foi obtida dun tanque de recollida lixiviado dun vertedoiro municipal en China. Obviamente, as bacterias ASxL5T non son moi representativas nas bases de datos taxonómicas, pero é probable que estas secuencias de bacterias sen cultivar representen organismos similares a ASxL5T, que se distribúen por todo o mundo, xeralmente en ambientes desafiantes. De toda a análise filoxenética do xenoma, o parente máis próximo a ASxL5T é Thalassolituus sp. C2-1, T. marinus, T. oleivorans. E O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus é un membro das bacterias mariñas de fragmentación de hidrocarburos obrigadas (OHCB), que está moi estendida en ambientes mariños e terrestres, e adoita ser a dominante despois dos incidentes de contaminación por hidrocarburos30,31. As bacterias mariñas non son membros do grupo OHCB, pero están illadas do medio mariño.
Os datos fenotípicos indican que ASxL5T é unha especie nova e un membro dun xénero previamente non recoñecido na familia das espirospiráceas mariñas. Actualmente non existe un estándar claro para clasificar as cepas recentemente illadas nun novo xénero. Intentáronse para determinar os límites universais dos xéneros, por exemplo, en función da porcentaxe do xenoma dunha proteína conservadora (POCP), recoméndase que o valor de corte sexa 50% idéntico ao da cepa de referencia33. Outros suxiren usar valores AAI, que teñen vantaxes sobre POCP porque poden obterse a partir de xenomas incompletos34. O autor cre que se o valor de AAI é inferior ao 74% en comparación coa cepa modelo da especie modelo, a cepa é un representante dun xénero diferente. O xénero modelo das spirillaceae mariñas é spirillum mariña, e a cepa modelo é O. linum ATCC 11336T. O valor AAI entre ASxL5T e O. linum ATCC 11336T é do 54,34%, e o valor AAI entre ASxL5T e T. oleivorans MIL-1T (cepas de tipo xénero) é do 67,61%, o que indica que ASxL5T representa un novo xénero diferente de Thalassolituus. Usando a secuencia do xene de ARNr 16S como estándar de clasificación, o límite de delimitación do xénero suxerido é do 94,5%35. ASxL5T pode colocarse no xénero Thalassolituus, mostrando un 95,03% de identidade de secuencia de ARNr 16S con T. oleivorans MIL-1T e 96,17%. marinus IMCC1826T. Non obstante, tamén se colocará no xénero Bacteroides que ten o 94,64% de identidade do xene do ARNr 16S con B. sanyensis NV9, o que indica que o uso dun só xene como o xene do ARNr 16S pode levar a unha clasificación e asignación arbitrarias. Outro método suxerido usa ANI e Xenome Alignment Score (AF) para examinar a agrupación de puntos de datos de todos os tipos e cepas non tipo dos xéneros existentes. O autor recomenda combinar o límite do xénero co punto de inflexión do xénero estimado específico dos taxons que se están analizando. Porén, se non hai suficientes secuencias xenómicas completas de illados de Thalassolituus, é imposible determinar se ASxL5T pertence ao xénero Thalassolituus por este método. Debido á limitada dispoñibilidade de secuencias xenómicas completas para a análise, toda a árbore filoxenética do xenoma debe interpretarse con precaución. En segundo lugar, os métodos de comparación de xenomas completos non poden dar conta de diferenzas substanciais no tamaño dos xenomas comparados. Mediron a semellanza dos xenes de copia única conservados entre xéneros relacionados, pero non tiveron en conta o gran número de xenes que non están presentes no xenoma moito máis pequeno de ASxL5T. Obviamente, ASxL5T e grupos que inclúen Thalassolituus, Oceanobacter e Bacterioplanes teñen un antepasado común, pero a evolución tomou un camiño diferente, levando a unha redución do xenoma, que pode ser adaptarse a un estilo de vida depredador. Isto contrasta con T. oleivorans MIL-1T, que é un 28% máis grande e evolucionou baixo diferentes presións ambientais para utilizar hidrocarburos23,30. Pódese facer unha comparación interesante con parasitos e simbiontes intracelulares obrigados, como Rickettsia, Chlamydia e Buchnera. O tamaño do seu xenoma é de aproximadamente 1 Mb. A capacidade de utilizar metabolitos da célula hóspede leva á perda de xenes, polo que sufriu unha importante degradación xenómica evolutiva. Os cambios evolutivos desde os organismos nutrientes químicos mariños ata os estilos de vida depredadores poden producir unha redución similar no tamaño do xenoma. A análise COG e KEGG destaca o número de xenes utilizados para funcións específicas e as diferenzas globais nas vías xenómicas entre ASxL5T e T. oleivorans MIL-1T, que non se deben á ampla dispoñibilidade de elementos xenéticos móbiles. A diferenza na relación G + C de todo o xenoma de ASxL5T é do 56,1%, e a de T. oleivorans MIL-1T é do 46,6%, o que tamén indica que está segregado.
O exame do contido de codificación do xenoma ASxL5T proporciona información funcional sobre as características fenotípicas. A presenza de xenes que codifican fimbrias tipo IV (Tfp) é de especial interese porque promoven o movemento celular, chamado deslizamento social ou convulsións, sen flaxelos na superficie. Segundo os informes, o Tfp ten outras funcións, incluíndo a depredación, a patoxénese, a formación de biopelículas, a captación natural de ADN, a agregación celular automática e o desenvolvemento38. O xenoma ASxL5T contén 18 xenes que codifican a diguanilato ciclase (un encima que cataliza a conversión de 2 guanosina trifosfato en guanosina 2 fosfato e diGMP cíclico) e 6 xenes que codifican o correspondente diguanilato ciclase fosfato diguanilato. O xene da esterase (que cataliza a degradación do di-GMP cíclico a monofosfato de guanosina) é interesante porque o cycl-di-GMP é un segundo mensaxeiro importante implicado no desenvolvemento e separación do biofilm, o movemento, a adhesión celular e a virulencia 39, 40 no proceso. Tamén hai que sinalar que en Bdellovibrio bacteriovorus demostrouse que o GMP dobre cíclico controla a transición entre a vida libre e o estilo de vida depredador41.
A maioría das investigacións sobre bacterias depredadoras centráronse en Bdellovibrio, organismos similares a Bdellovibrio e especies de Myxococcus. Estes e outros exemplos coñecidos de bacterias depredadoras forman un grupo diverso. A pesar desta diversidade, identificáronse un conxunto de familias de proteínas características que reflicten os fenotipos de 11 bacterias depredadoras coñecidas3,22. Non obstante, só se identificaron xenes que codifican O antíxeno ligase (waaL), o que é particularmente común nas bacterias Gram negativas. Esta forma de análise non é útil para designar a ASxL5T como depredador, probablemente porque utiliza unha estratexia de ataque nova. A dispoñibilidade de xenomas bacterianos depredadores máis diversos axudará a desenvolver análises de resolución máis finas que teñan en conta a evidencia das diferenzas funcionais e ambientais entre os membros do grupo. Exemplos de bacterias depredadoras non incluídas nesta análise inclúen membros de Cupriavidus necator42 e Bradymonabacteria43, porque a medida que os investigadores investigan diferentes comunidades microbianas, establécense máis taxons depredadores.
A característica máis notable das bacterias ASxL5T capturadas pola imaxe TEM é a súa morfoloxía única e flexible, que pode promover a interacción coas bacterias presa. O tipo de interacción observada é diferente do doutras bacterias depredadoras e non foi descuberta nin informada previamente. O ciclo de vida depredador ASxL5T proposto móstrase na Figura 5. Hai poucos exemplos na literatura con estruturas apicais similares ás que informamos aquí, pero estes exemplos inclúen Terasakiispira papahanaumokuakeensis, unha bacteria espírillum mariña con aumento ocasional do ápice 44, e Alphaproteobacteria, Terasakiella pusilla. , antigamente pertencente ao xénero Oceanospirillum, que exhibe O chamado "película polar" 45. As formas de cocos adoitan observarse en cultivos máis antigos, especialmente para bacterias con formas curvas, como Vibrio, Campylobacter e Helicobacter 46, 47, 48, que poden representar un estado degradado. Precísase máis traballo para aclarar o ciclo de vida preciso das bacterias ASxL5T. Determinar como captura e presa, e se o seu xenoma codifica compostos bioloxicamente activos que poden ser utilizados con fins médicos ou biotecnolóxicos.
Descrición de Venatorbacter gen. Novembro Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. está composto por venators de L. n. venator,'hunter' e Gr. n. bacter,'un rod'. Venatorbacter,'un hunting rod') As células son aeróbicas, tolerantes ao sal, a mancha de Gram curvada, a actividade da catalasa e a oxidase non se acumulan 42 °C Ingrown. O rango de pH de 4-9 é inusual. Nos caracois mariños, a maioría son intolerantes ao pH ácido :0 3-OH e C10:0 3-OH atópanse como hidroxiácidos graxos medio de caldo. O contido de ADN G + C é do 56,1 % en moles. Os membros deste xénero mostran resistencia a Campylobacter E o comportamento de depredación dos membros da familia das Enterobacteriaceae é a posición filoxenética deste xénero.
Descrición de Venatorbacter cucullus sp. Novembro Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus significa carenado).
Ademais, a característica descritiva deste xénero é que cando se cultivan en BA ou BHI, as células miden 1,63 µm de longo e 0,37 µm de ancho. As colonias en agar BHI son moi pequenas, alcanzando os 2 mm de diámetro despois de 72 horas. Son beis, translúcidos, redondos, convexos e brillantes. Os membros desta especie poden usar Escherichia coli e Klebsiella. Campylobacter e varias outras bacterias Gram negativas serven de presa.
A cepa típica ASxL5T illouse do leite de vacún en Nottinghamshire, Reino Unido, e depositouse na National Type Culture Collection (Reino Unido): número de acceso NCTC 14397 e número de acceso NCCB 100775 da Colección de cultivos bacterianos dos Países Baixos (NCCB). A secuencia xenómica completa de ASxL5T foi depositado en Genbank segundo a adición de CP046056.
As bacterias ASxL5T illáronse do leite de carne mediante a tecnoloxía de illamento de fagos9,49. A suspensión foi diluída 1:9 (p/v) en tampón SM (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,1 M NaCl, 8 mM MgSO4.7H2O e 0,01% de xelatina; Sigma Aldrich, Gillingham, Reino Unido), a continuación, incubar. a 4 °C durante 24 horas, xirando lentamente para eluír aos depredadores no tampón. A suspensión centrifugouse a 3000 g durante 3 minutos. O sobrenadante foi recollido e centrifugado a 13.000 g por segunda vez durante 5 minutos. O sobrenadante pasou despois a través dun filtro de membrana de 0,45 µm (Minisart; Sartorius, Göttingen, Alemaña) e un filtro de membrana de 0,2 µm (Minisart) para eliminar as células bacterianas restantes. ASxL5T pode pasar estes filtros. Preparouse un céspede de agar brando de Campylobacter enterosus S12 (número de acceso NCBI CP040464) a partir da mesma suspensión mediante técnicas estándar. A suspensión filtrada distribuíuse en cada unha destas placas de células hóspedes en gotas de 10 µl por triplicado e deixouse secar. A placa foi incubada nun tanque microaerófilo a 37 °C durante 48 horas en condicións microaeróbicas (5% O2, 5% H2, 10% CO2 e 80% N2). A placa visible obtida foi extraída no tampón SM e transferida ao céspede fresco de C. hyointestinalis S12 para propagar aínda máis os organismos lisados. Unha vez que se determina que as bacterias son a causa da placa lítica e non do fago, intenta facer crecer o organismo independentemente do hóspede e caracterizalo aínda máis. O cultivo aeróbico realizouse a 37 °C con sangue de cabalo desfibrinado ao 5% v/v (TCS Biosciences Lt, Buckingham, Reino Unido, suplemento). Segundo as directrices do National Clinical Standards Committee, o método de difusión do disco utilízase para probas de susceptibilidade antibacteriana. Cultivouse agar BHI a 37 °C utilizando un disco que contiña os seguintes antibióticos (Oxoid) para o cultivo aeróbico: amoxicilina e ácido clavulánico 30 µg; cefotaxima 30 µg; estreptomicina 10 µg; ciprofloxacino 5 µg; Ceftazidima 30 µg Ácido nalidíxico 30 µg; Imipenem 10 µg; azitromicina 15 µg; Cloranfenicol 30 µg; Cefoxitina 30 µg; tetraciclina 30 µg; Nitrofurantoína 300 µg; Aztreonam 30 µg; Ampicilina 10 µg; Cefpodoxima 10 µg; Trimetoprim-Sulfametoxazol 25 µg. A tolerancia á sal estableceuse mediante incubación aeróbica en placas de agar BHI a 37 °C. Engadiuse NaCl adicional ás placas de agar BHI para proporcionar un intervalo de concentración de ata 10% p/v. O intervalo de pH determínase mediante cultivo aeróbico en placas de agar BHI a 37 °C, onde o intervalo de pH se axustou entre 4 e 9 con HCl estéril ou NaOH estéril, e o valor de pH obxectivo verifícase antes de verter a placa. Para a análise de ácidos graxos celulares, cultivouse ASxL5T en agar BHI durante 3 días e aeróbico a 37 °C. Segundo o protocolo estándar MIDI (Sherlock Microbial Identification System, versión 6.10) de FERA Science Ltd, (York, Reino Unido), extraéronse, preparáronse e analizáronse os ácidos graxos celulares.
Para TEM, ASxL5T cultivouse aeróbico espallando uniformemente sobre BA a 37 °C durante 24 horas, e despois recollíuse en 1 ml de glutaraldehido ao 3% (v/v) en tampón de cacodilato 0,1 M a temperatura ambiente Fix durante 1 hora e, a continuación, centrifugue. a 10.000 g durante 3 minutos. A continuación, resuspender suavemente o sedimento en 600 μl de tampón de cacodilato 0,1 M. Transfira a suspensión fixa de ASxL5T á película Formvar/carbon sobre unha reixa de cobre de 200 mallas. As bacterias tinguironse con acetato de uranilo ao 0,5% (p/v) durante 1 minuto e examináronse mediante TEM utilizando un microscopio TEI Tecnai G2 12 Biotwin. Como se mencionou anteriormente, combine o mesmo número de presas e depredadores no caldo NZCYM (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) e incube durante 48 horas en condicións microaeróbicas de Campylobacter ou Campylobacter a 37 °C, A interacción do predador e a presa. tamén foi examinado por TEM. Condicións aeróbicas para Escherichia coli. Examinar de forma independente as presas e as bacterias depredadoras para determinar calquera cambio na morfoloxía celular debido á depredación. Utilizouse o método do negro de Sudán para a microscopía óptica da acumulación de PHB.
Cultiva ASxL5T durante a noite untando o crecemento en placas BHI ou BA cun hisopo estéril. Recolle as células ASxL5T e suspéndeas en MRD (CM0733, Oxoid), e despois colócaas a 4 °C durante 7 días para que as células morren de fame. O cultivo bacteriano de referencia ou de laboratorio de referencia NCTC inoculouse en caldo BHI ou caldo de nutrientes número 2 (CM007, Oxoid), incubouse durante a noite, centrifugouse a 13.000 g e resuspendiuse en MRD ata que a DO600 foi de 0,4. Cultivo: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, Klebsiella oxytoca, Lebsiella oxytoca NCTC1146ctoca Listeria Special bacteria NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, Rhodococcus submarine hamburger NCTC 1621T, Salmonella intestinal bacteria Mondeville NCTC 5786TC, Stalocophy 57867 aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. O hóspede Campylobacter foi incubado microaerobicamente en placas BA a 37 °C e suspendido en caldo NZCYM. Os hóspedes Campylobacter probados son: C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11458, C.11458, C. jejuni NCTC . PT14, C... Recoller células en MRD, centrifugar a 13.000 g e resuspender en MRD ata que OD600 sexa 0,4. Engade unha alícuota de 0,5 ml de suspensión a 5 ml de agar superior NZCYM fundido (ágar 0,6%) e bótao nunha placa inferior de NZCYM ao 1,2%. Despois do curado e do secado, o ASxL5T diluído en serie foi distribuído en forma de gotas de 20 µl en cada táboa de céspede por triplicado. A temperatura e a atmosfera do cultivo dependen dos requisitos das bacterias da proba.
Use GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma Aldridge) para preparar ADN a partir de illados bacterianos. Utilizáronse métodos estándar para a amplificación por PCR do xene de ARNr 16S e a determinación da secuencia do produto mediante a química de terminación do colorante (Eurofins Value Read Service, Alemaña). Use o programa BLAST-N para comparar estas secuencias con outras secuencias de xenes de ARNr 16S para identificar e recoller especies estreitamente relacionadas. Estes están aliñados usando ClustalW no programa MEGA X. A árbore filoxenética foi reconstruída mediante MEGA X mediante o método de máxima verosimilitud baseado no modelo Tamura-Nei, con 1000 copias guiadas54. Use PureLink™ Genomic DNA Kit (Fisher Scientific, Loughborough, Reino Unido) para extraer ADN para a secuenciación do xenoma completo. A secuencia do xenoma de ASxL5T determinouse mediante a combinación Illumina MiSeq, que consta de lecturas de dobre extremo de 250 pb composta por unha biblioteca preparada mediante o kit de etiquetado Nextera e lecturas de 2 a 20 kb de lonxitude da plataforma PacBio. Instalación de Investigación de Secuenciación de ADN de Genómica da Universidade de Sembia. O xenoma foi ensamblado usando CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen, Aarhus, Dinamarca). Os cultivos ASxL5T están depositados na National Type Culture Collection (Reino Unido) e na Netherlands Bacterial Culture Collection (NCCB). Os xenomas de organismos relacionados utilizados para a comparación son: Thalassolituus oleivorans MIL-1T (número de acceso HF680312, completo); Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (número de acceso BMYY01000001, incompleto); Oceanobacter kriegii DSM 6294T (número de acceso NZ_AUGV00000000, incompleto); Marinamonas community DSM 5604T (engadido ASM436330v1, incompleto), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (engadido MTSD02000001, incompleto) e Thalassolituus sp. C2-1 (engadir NZ_VNIL01000001, incompleto). Use JGI Genome Portal36 en https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page= para determinar a puntuación de aliñamento (AF) e a identidade media do ácido nucleico (ANI). En parellas. Utilizouse o método de Rodríguez-R e Konstantinidis55 para determinar a identidade de aminoácidos (AAI). Use GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 para xerar unha árbore filoxenética de máxima probabilidade estimada. O xenoma de entrada que representa o xenoma de referencia dispoñible elíxese entre xéneros de referencia identificados como relacionados con ASxL5T a partir da filoxenia do ARNr 16S. Anotou a árbore mediante a ferramenta en liña interactiva da árbore da vida (https://itol.embl.de/). A anotación funcional e a análise do xenoma ASxL5T realízase mediante a ferramenta en liña BlastKOALA KEGG mediante a distribución de enriquecemento do módulo KEGG (Enciclopedia de xenes e xenomas de Kioto). A distribución das categorías COG (grupos ortólogos) determínase mediante a ferramenta en liña eggNOG-mapper.
Pérez, J., Moraleda-Muñoz, A., Marcos-Torres, FJ e Muñoz-Dorado, J. Depredación bacteriana: 75 anos e segue! . ambiente. microorganismo. 18, 766–779 (2016).
Linares-Otoya, L. etc. Diversidade e potencial antibacteriano de bacterias depredadoras no litoral peruano. Drogas de marzo. 15. E308. https://doi.org/10.3390/md15100308 (2017).
Pasternak, Z. et al. A través dos seus xenes, comprenderaos: as características xenómicas das bacterias depredadoras. ISME J. 7, 756–769 (2013).
Sockett, RE O estilo de vida depredador do bacteriófago Bdellovibrio. instalar. Pastor microbios. 63, 523–539 (2009).
Korp, J., Vela Gurovic, MS & Nett, M. Antibióticos de bacterias depredadoras. Beilstein J. Histoquímica 12, 594–607 (2016).
Johnke, J., Fraune, S., Bosch, TCG, Hentschel, U. & Schulenburg, H. Bdellovibrio e organismos similares son predictores da diversidade do microbioma en diferentes poboacións de hóspede. microorganismo. Ecoloxía. 79, 252–257 (2020).
Vila, J., Moreno-Morales, J. e Ballesté-Delpierre, C. Discover the current status of new antibacterial agents. clínica. microorganismo. Infectar. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2019.09.015 (2019).
Hobley, L. et al. A dobre depredación do fago e do fago pode erradicar as presas de E. coli sen unha soa depredación. J. Bacterias. 202, e00629-19. https://doi.org/10.1128/JB.00629-19 (2020).
El-Shibiny, A., Connerton, PL e Connerton, IF O reconto e a diversidade de Campylobacter e bacteriófagos illados durante o ciclo de alimentación de galiñas en liberdade e orgánicas. Entorno de aplicación. microorganismo. 71, 1259–1266 (2005).
Wilkinson, DA etc. Actualizar a taxonomía xenómica e epidemioloxía do porcino Campylobacter. ciencia. Representante 8, 2393. https://doi.org/10.1038/s41598-018-20889-x (2018).
Lee, MD GToTree: fluxo de traballo amigable para a xenómica de sistemas. Bioinformática 35, 4162–4164 (2019).
Edgar, RC MUSCLE: Un método de aliñamento de secuencias múltiples que reduce a complexidade do tempo e do espazo. Información biolóxica BMC. 5, 113 (2004).
Capella-Gutiérrez, S., Silla-Martínez, JM & Gabaldón, T. TrimAl: A tool for automatic alignment and trimming in large-scale phylogentic analysis. Bioinformática 25, 1972–1973 (2009).
Hyatt, D., LoCascio, PF, Hauser, LJ e Uberbacher, o xene EC e a tradución de secuencias metaxenómicas comezan a predición do sitio. Bioinformática 28, 2223-2230 (2012).
Shen, W. & Xiong, J. TaxonKit: Kit de ferramentas de clasificación NCBI multiplataforma e eficiente. Biografía Rxiv. (Consultado o 1 de xuño de 2021); https://www.biorxiv.org/content/10.1101/513523v1 (2019).
Price, MN, Dehal, PS & Arkin, AP FastTree 2-árbore de probabilidade máxima aproximada cunha aliñación grande. PLoS One 5, e9490 (2010).
Tange, O. GNU Paralelo. (Consultado o 1 de xuño de 2021); https://zenodo.org/record/1146014#.YOHaiJhKiUk (2018).
Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: Enciclopedia de xenes e xenomas de Kioto. Investigación de ácidos nucleicos. 28, 27-30 (2000).
República Checa, L. etc. O papel dos extremolitos ectoína e hidroxiectoína como protectores do estrés e nutrientes: xenética, xenómica de sistemas, bioquímica e análise estrutural. Xene (Basilea). 9. E177. https://doi.org/10.3390/genes9040177 (2018).
Gregson, BH, Metodieva, G., Metodiev, MV, Golyshin, PN e McKew, BA Expresión diferencial de proteínas durante o crecemento da bacteria obrigada que degrada hidrocarburos mariños Thalassolituus oleivorans MIL-1 durante o crecemento de alcanos de cadea media e longa. fronte. microorganismo. 9, 3130 (2018).
Pasternak, Z., Ben Sasson, T., Cohen, Y., Segev, E. e Jurkevitch, E. Un novo método de xenómica comparativa para definir indicadores fenotípicos específicos revela a herdanza específica na marca de bacterias depredadoras. Biblioteca Pública de Ciencias 1. 10. e0142933. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142933 (2015).
Yakimov, MM, etc. Xene Thalassolituus oleivorans. novembro, sp. nov., un novo tipo de bacterias mariñas especializadas no uso de hidrocarburos. internacionalidade. J. Sistema. evolución. microorganismo. 54, 141–148 (2004).
Wang, Y., Yu, M., Liu, Y., Yang, X. & Zhang, XH Bacterioplanoides pacificum gen. novembro, sp. En novembro, separouse da auga do mar que circulaba polo Pacífico Sur. internacionalidade. J. Sistema. evolución. microorganismo. 66, 5010–5015 (2016).