Nova vrsta Gram-negativne, aerobne, tolerantne na sol, aktivne, štapićaste i predatorske bakterije ASxL5T izolirana je iz ribnjaka kravljeg izmeta u Nottinghamshireu u Engleskoj, a koristila je Campylobacter kao svoj plijen. Kasnije su druge vrste Campylobacter i članovi obitelji Enterobacteriaceae otkriveni kao plijen. Nakon subkulture bez stanica domaćina, postignut je slab aseptički rast na Brain Heart Infusion Agaru. Optimalni uvjeti za rast su 37 °C i pH 7. Transmisijska elektronska mikroskopija otkrila je neke vrlo neobične morfološke značajke povezane s dostupnošću plijena. Filogenetska analiza pomoću sekvence gena 16S rRNA pokazala je da je izolat povezan s članom obitelji Marine Spirulina, ali se ne može jasno klasificirati kao član bilo kojeg poznatog roda. Sekvencioniranje cijelog genoma ASxL5T potvrdilo je odnos s pripadnicima morskih spiroheta. Pretraživanje baze podataka otkrilo je da nekoliko ASxL5T dijeli sekvence gena 16S rRNA s nekoliko nekultiviranih bakterija iz oceana, kopnene površine i podzemnih voda. Predlažemo da soj ASxL5T predstavlja novu vrstu u novom rodu. Preporučujemo naziv Venatorbacter cucullus gen. studeni, sp. U studenom je ASxL5T korišten kao tipski soj.
Predatorske bakterije su bakterije koje pokazuju sposobnost loviti i ubijati druge žive bakterije kako bi dobile biosintetske materijale i energiju. To se razlikuje od općeg oporavka hranjivih tvari iz mrtvih mikroorganizama, a također se razlikuje od parazitskih interakcija, u kojima bakterije stvaraju blizak odnos sa svojim domaćinom bez da ih ubiju. Predatorske bakterije razvile su različite životne cikluse kako bi iskoristile obilne izvore hrane u nišama u kojima se nalaze (kao što su morska staništa). Oni su taksonomski raznolika skupina koju povezuje samo jedinstveni životni ciklus sterilizacije1. Primjeri grabežljivih bakterija pronađeni su u nekoliko različitih vrsta, uključujući: Proteobacteria, Bacteroides i Chlorella.3. Međutim, najbolje proučene predatorske bakterije su Bdellovibrio i Bdellovibrio i slični organizmi (BALOs4). Predatorske bakterije obećavajući su izvor novih biološki aktivnih spojeva i antibakterijskih sredstava5.
Vjeruje se da grabežljive bakterije povećavaju mikrobnu raznolikost i imaju pozitivan učinak na zdravlje, produktivnost i stabilnost ekosustava6. Unatoč tim pozitivnim atributima, malo je studija o novim grabežljivim bakterijama zbog poteškoća u uzgoju bakterija i potrebe da se pažljivo promatraju interakcije stanica kako bi se razumjeli njihovi složeni životni ciklusi. Te podatke nije lako dobiti računalnim analizama.
U eri sve veće antimikrobne otpornosti, proučavaju se nove strategije za ciljanje bakterijskih patogena, kao što je uporaba bakteriofaga i predatorskih bakterija7,8. Bakterije ASxL5T izolirane su 2019. pomoću tehnologije izolacije faga iz kravlje balege prikupljene iz Mliječnog centra Sveučilišta Nottingham, Nottinghamshire. Svrha istraživanja je izolacija organizama s potencijalom biološke kontrole. Campylobacter hyointestinalis je zoonotski patogen koji se sve više povezuje s crijevnim bolestima ljudi10. Sveprisutan je u serumu i koristi se kao ciljni domaćin.
Bakterija ASxL5T izolirana je iz goveđe mliječi jer je uočeno da su plakovi koje stvara na travnjaku C. hyointestinalis slični onima koje proizvode bakteriofagi. Ovo je neočekivano otkriće, jer dio procesa izolacije faga uključuje filtriranje kroz filter od 0,2 µm, koji je dizajniran za uklanjanje bakterijskih stanica. Mikroskopski pregled materijala ekstrahiranog iz plaka otkrio je da male gram-negativne zakrivljene štapićaste bakterije nisu nakupljale polihidroksibutirat (PHB). Aseptična kultura neovisna o stanicama plijena ostvaruje se na bogatom čvrstom mediju (kao što je agar za infuziju mozga i srca (BHI) i krvni agar (BA)), a njen rast je slab. Dobiva se nakon potkulture s teškim poboljšanjem inokuluma. Jednako dobro raste u mikroaerobnim (7% v/v kisika) i atmosferskim uvjetima kisika, ali ne u anaerobnoj atmosferi. Nakon 72 sata, promjer kolonije bio je vrlo mali, dosežući 2 mm, i bila je bež, prozirna, okrugla, konveksna i sjajna. Standardno biokemijsko testiranje je otežano jer se ASxL5T ne može pouzdano uzgajati u tekućim medijima, što sugerira da se može oslanjati na složen životni ciklus stvaranja biofilma. Međutim, suspenzija ploče je pokazala da je ASxL5T aeroban, pozitivan na oksidazu i katalazu, te može tolerirati 5% NaCl. ASxL5T je otporan na 10 µg streptomicina, ali je osjetljiv na sve ostale testirane antibiotike. Bakterijske stanice ASxL5T ispitane su TEM-om (Slika 1). Kada se uzgajaju bez stanica plijena na BA, stanice ASxL5T su mali Campylobacter, prosječne duljine od 1,63 μm (± 0,4), širine od 0,37 μm (± 0,08) i jednog dugačkog (do 5 μm) pola. Spolni bičevi. Čini se da približno 1,6% stanica ima širinu manju od 0,2 μm, što će omogućiti prolaz kroz uređaj za filtriranje. Na vrhu nekih ćelija primijećeno je neobično strukturno proširenje, slično oklopu (latinski cucullus) (vidi strelice u 1D, E, G). Čini se da se sastoji od viška vanjske membrane, što može biti posljedica brzog smanjenja veličine periplazmatične ovojnice, dok vanjska membrana ostaje netaknuta, pokazujući "labav" izgled. Uzgoj ASxL5T u odsutnosti hranjivih tvari (u PBS-u) dugo vremena na 4°C rezultirao je u većini (ali ne u svim) stanicama koje pokazuju morfologiju koke (Slika 1C). Kada ASxL5T raste s Campylobacter jejuni kao plijenom 48 sati, prosječna veličina stanice je značajno duža i uža od stanica koje rastu bez domaćina (Tablica 1 i Slika 1E). Nasuprot tome, kada ASxL5T raste s E. coli kao plijenom 48 sati, prosječna veličina stanice je duža i šira nego kada raste bez plijena (Tablica 1), a duljina stanice je promjenjiva, obično pokazujući filamente (Slika 1F). Kada su bile inkubirane s Campylobacter jejuni ili E. coli kao plijenom tijekom 48 sati, stanice ASxL5T uopće nisu pokazivale flagele. Tablica 1 sažima opažanja promjena u veličini stanica na temelju prisutnosti, odsutnosti i tipa plijena ASxL5T.
TEM prikaz ASx5LT: (A) ASx5LT pokazuje dugi bič; (B) tipična ASx5LT baterija; (C) stanice koka ASx5LT nakon duge inkubacije bez hranjivih tvari; (D) skupina stanica ASx5LT pokazuje abnormalnost (E) Skupina stanica ASx5LT inkubirana s plijenom Campylobacter pokazala je povećanu duljinu stanica u usporedbi s onima bez rasta plijena (D) također je pokazala apikalnu strukturu; (F) Velike filamentozne bičeve, stanice ASx5LT, nakon inkubacije s plijenom E. coli; (G) Jedna stanica ASx5LT nakon inkubacije s E. coli, pokazuje neobičnu strukturu vrha. Traka predstavlja 1 μm.
Određivanje sekvence gena 16S rRNA (pristupni broj MT636545.1) omogućuje pretraživanja baze podataka kako bi se ustanovile sekvence slične onima u klasi Gammaproteobacteria, a najbliže su morskim bakterijama iz obitelji morskih spirillum (slika 2), te su članovi roda Thalassolituus Najbliži rođak Marine Bacillus. Slijed gena 16S rRNA jasno se razlikuje od grabežljivih bakterija koje pripadaju obitelji Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria). Usporedbe parova B. bacteriovorus HD100T (tip soja, DSM 50701) i B. bacteriovorus DM11A bile su 48,4% i 47,7%, a za B. exovorus JSS 46,7%. ASxL5T bakterije imaju 3 kopije gena 16S rRNA, od kojih su dvije identične jedna drugoj, a treća je udaljena 3 baze. Dva druga predatorska bakterijska izolata (ASx5S i ASx5O; pristupni brojevi gena 16S rRNA su MT636546.1 odnosno MT636547.1) sa sličnim morfološkim i fenotipskim karakteristikama s iste lokacije nisu isti, ali se razlikuju od ASxL5T i nekultivirane bakterije sekvence baze podataka grupirane su zajedno s drugim rodovima Oceanospirillaceae (Slika 2). Cijeli slijed genoma ASxL5T je utvrđen i pohranjen u NCBI bazi podataka, a pristupni broj je CP046056. Genom ASxL5T sastoji se od kružnog kromosoma od 2.831.152 bp s omjerom G + C od 56,1%. Sekvenca genoma sadrži 2653 CDS (ukupno), od kojih je za 2567 predviđeno da kodiraju proteine, od kojih se 1596 može pripisati pretpostavljenim funkcijama (60,2%). Genom sadrži 67 gena koji kodiraju RNA, uključujući 9 rRNA (po 3 za 5S, 16S i 23S) i 57 tRNA. Genomske karakteristike ASxL5T uspoređene su s dostupnim genomima sojeva najbližeg relativnog tipa identificiranog iz sekvence gena 16S rRNA (Tablica 2). Upotrijebite identifikaciju aminokiselina (AAI) za usporedbu svih dostupnih Thalassolituus genoma s ASxL5T. Najbliža dostupna (nepotpuna) sekvenca genoma određena AAI je Thalassolituus sp. C2-1 (dodati NZ_VNIL01000001). Ovaj soj je izoliran iz dubokomorskih sedimenata Marijanske brazde, ali trenutno nema fenotipskih podataka o ovom soju za usporedbu. U usporedbi s ASxL5T-ovim 2,82 Mb, genom organizma je veći s 4,36 Mb. Prosječna veličina genoma morskih spiroheta je oko 4,16 Mb (± 1,1; n = 92 potpuna referentna genoma istražena s https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), tako da je genom ASxL5T u skladu s poredak U usporedbi s ostalim članicama, prilično je mali. Upotrijebite GToTree 1.5.54 za generiranje filogenetskog stabla procijenjene maksimalne vjerojatnosti temeljeno na genomu (Slika 3A), koristeći usklađene i povezane sekvence aminokiselina 172 gena s jednom kopijom specifičnih za Gammaproteobacteria 11,12,13,14,15,16, 17 ,18. Analiza je pokazala da je usko povezan s Thalassolituusom, Bacterial Plane i Marine Bacterium. Međutim, ovi podaci pokazuju da se ASxL5T razlikuje od svojih rođaka u morskoj spirulini i da su podaci o sekvenci njegovog genoma dostupni.
Filogenetsko stablo koje koristi sekvencu gena 16S rRNA naglašava položaj sojeva ASxL5T, ASxO5 i ASxS5 (s utrobom) u odnosu na sojeve nekultiviranih i morskih bakterija u morskim Spirulinaceae. Genbank pristupni broj slijedi nakon naziva soja u zagradama. Koristite ClustalW za poravnavanje sekvenci i koristite metodu maksimalne vjerojatnosti i Tamura-Nei model za zaključivanje filogenetskih odnosa i izvedite 1000 vođenih replikacija u programu MEGA X. Broj na grani označava da je vrijednost vođene kopije veća od 50%. Escherichia coli U/541T korištena je kao vanjska skupina.
(A) Filogenetsko stablo temeljeno na genomu, koje pokazuje odnos između morske bakterije Spirospiraceae ASxL5T i njezinih bliskih rođaka, E. coli U 5/41T kao vanjske skupine. (B) U usporedbi s T. oleivorans MIL-1T, funkcionalna kategorija distribucije gena predviđena je na temelju klastera ortologne skupine (COG) proteina ASx5LT. Slika lijevo prikazuje broj gena u svakoj funkcionalnoj COG kategoriji u svakom genomu. Grafikon na desnoj strani prikazuje postotak genoma sadržanih u svakoj funkcionalnoj COG skupini. (C) U usporedbi s T. oleiverans MIL-1T, analiza potpunog KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) modularnog puta ASxL5T.
Korištenje baze podataka KEGG za ispitivanje komponenata gena prisutnih u genomu ASxL5T otkrilo je tipični metabolički put aerobnog gama Proteusa. ASxL5T sadrži ukupno 75 gena koji su dodijeljeni bakterijskim motornim proteinima, uključujući gene uključene u kemotaksiju, sklapanje bičeva i sustav fimbrija tipa IV. U posljednjoj kategoriji, 9 od 10 gena odgovorno je za trzanje niza drugih organizama. Genom ASxL5T sadrži kompletan biosintetski put tetrahidropirimidina koji sudjeluje u zaštitnom odgovoru na osmotski stres20, kao što se očekuje za halofile. Genom također sadrži mnoge potpune putove za kofaktore i vitamine, uključujući putove sinteze riboflavina. Iako je gen alkan 1-monooksigenaze (alkB2) prisutan u ASxL5T, put iskorištavanja ugljikovodika nije potpun. U sekvenci genoma ASxL5T, homolozi gena koji su identificirani kao uglavnom odgovorni za razgradnju ugljikovodika u T. oleiverans MIL-1T21, kao što su TOL_2658 (alkB) i TOL_2772 (alkohol dehidrogenaza) očito su odsutni. Slika 3B prikazuje usporedbu distribucije gena u COG kategoriji između ASxL5T i maslinovog ulja MIL-1T. Sve u svemu, manji genom ASxL5T sadrži proporcionalno manje gena iz svake COG kategorije u usporedbi s većim srodnim genomom. Kada se broj gena u svakoj funkcionalnoj kategoriji izrazi kao postotak genoma, bilježe se razlike u postotku gena u kategorijama translacije, ribosomske strukture i biogeneze, te kategorijama funkcije proizvodnje i pretvorbe energije, koje čine veći ASxL5T genom Postotak se uspoređuje s istom skupinom prisutnom u genomu T. oleiverans MIL-1T. Nasuprot tome, u usporedbi s genomom ASxL5T, T. oleivorans MIL-1T ima veći postotak gena u kategorijama replikacije, rekombinacije i popravka te transkripcije. Zanimljivo je da je najveća razlika u sadržaju svake funkcionalne kategorije dvaju genoma broj nepoznatih gena prisutnih u ASxL5T (Slika 3B). Provedena je analiza obogaćivanja KEGG modula, pri čemu svaki KEGG modul predstavlja skup ručno definiranih funkcionalnih jedinica za označavanje i biološku interpretaciju podataka sekvenci genoma. Usporedba distribucije gena u cijelom putu KOG modula ASxL5T i MIL-1T masline prikazana je na slici 3C. Ova analiza pokazuje da iako ASxL5T ima potpun metabolički put sumpora i dušika, T. oleiverans MIL-1T nema. Nasuprot tome, T. oleiverans MIL-1T ima kompletan metabolički put cisteina i metionina, ali je nepotpun u ASxL5T. Stoga ASxL5T ima karakterističan modul za asimilaciju sulfata (definiran kao skup gena koji se mogu koristiti kao fenotipski markeri, poput metaboličkog kapaciteta ili patogenosti; https://www.genome.jp/kegg/module.html) u T . oleiverans MIL-1T. Usporedba sadržaja gena ASxL5T s popisom gena koji upućuju na predatorski način života nije uvjerljiva. Iako je gen waaL koji kodira ligazu povezanu s polisaharidom antigena O do jezgre prisutan u genomu ASxL5T (ali je čest u mnogim Gram-negativnim bakterijama), geni triptofan 2,3-dioksigenaze (TDO) mogu uključivati ​​60 amino kisela područja koja se obično nalaze u predatorskim bakterijama koja nisu prisutna. U genomu ASxL5T nema drugih predatorskih karakterističnih gena, uključujući one koji kodiraju enzime uključene u biosintezu izoprenoida u mevalonatnom putu. Imajte na umu da ne postoji transkripcijski regulatorni gen gntR u ispitanoj skupini predatora, ali tri gena slična gntR-u mogu se identificirati u ASxL5T.
Fenotipske karakteristike ASxL5T sažete su u tablici 3 i uspoređene s fenotipskim karakteristikama srodnih rodova 23, 24, 25, 26 i 27 objavljenim u literaturi. Izolati iz T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis i Oceanobacter kriegii su aktivna, štapićasta tijela otporna na sol, pozitivna na oksidazu, ali nemaju gotovo nikakvih drugih fenotipskih karakteristika s ASxL5T. Prosječni pH oceana je 8,1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77), što se odražava na T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis i O. kriegii. ASxL5T je prikladan za širi pH raspon (4-9) tipičan za nemorske vrste. Fenotipske karakteristike Thalassolituus sp. C2-1. Nepoznato. Raspon temperature rasta ASxL5T općenito je širi nego kod morskih sojeva (4–42 °C), iako su neki, ali ne svi izolati T. marinus otporni na toplinu. Nemogućnost uzgoja ASxL5T u bujonskom mediju spriječila je daljnju fenotipsku karakterizaciju. Upotrijebite API 20E za testiranje materijala sastruganih s BA ploče, ONPG, arginin dihidrolaze, lizin dekarboksilaze, ornitin dekarboksilaze, iskorištenja citrata, ureaze, triptofan deaminaze, enzima hidrolize želatine, svi rezultati ispitivanja bili su negativni, ali bez indola, acetoina i H2S proizvedeni su. Nefermentirani ugljikohidrati su: glukoza, manoza, inozitol, sorbitol, ramnoza, saharoza, melibioza, amigdalin i arabinoza. U usporedbi s objavljenim srodnim referentnim sojevima, stanični profil masnih kiselina soja ASxL5T prikazan je u tablici 4. Glavne stanične masne kiseline su C16:1ω6c i/ili C16:1ω7c, C16:0 i C18:1ω9. Postoje i hidroksi masne kiseline C12:0 3-OH i C10:0 3-OH. Omjer C16:0 u ASxL5T veći je od prijavljene vrijednosti srodnih rodova. Nasuprot tome, u usporedbi s prijavljenim T. marinus IMCC1826TT, omjer C18:1ω7c i/ili C18:1ω6c u ASxL5T je smanjen. oleivorans MIL-1T i O. kriegii DSM 6294T, ali nije otkriveno u B. sanyensis KCTC 32220T. Usporedba profila masnih kiselina ASxL5T i ASxLS otkrila je suptilne razlike u količini pojedinačnih masnih kiselina između dva soja, koje su u skladu s genomskom DNA sekvencom iste vrste. Sudanskim crnim testom nisu otkrivene čestice poli-3-hidroksibutirata (PHB).
Proučavana je predatorska aktivnost bakterija ASxL5T kako bi se odredio raspon plijena. Ova bakterija može stvarati plakove na vrstama Campylobacter, uključujući: Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T; Escherichia coli NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; C lari NCTC 11458 i C. upsaliensis NCTC 11541T. Upotrijebite kulture navedene u odjeljku metode za određivanje raspona domaćina za testiranje šireg raspona Gram-negativnih i Gram-pozitivnih bakterija. Rezultati pokazuju da se ASxL5T također može koristiti u Escherichia coli NCTC 86 i Citrobacter freundii NCTC 9750T. Nastali su plakovi na Klebsiella oxytoca 11466. TEM interakcija s E. coli NCTC 86 prikazana je na slici 4A-D, a interakcija s Campylobacter jejuni PT14 i Campylobacter suis S12 prikazana je na slici 4E-H u sredini. Čini se da se mehanizam napada razlikuje između testiranih tipova plijena, s jednom ili više stanica E. coli vezanih za svaku stanicu ASxL5T i postavljenih bočno duž produžene stanice prije adsorpcije. Nasuprot tome, čini se da se ASxL5T veže za Campylobacter kroz jednu kontaktnu točku, obično u kontaktu s vrhom stanice predatora i blizu vrha stanice Campylobacter (Slika 4H).
TEM pokazuje interakciju između ASx5LT i plijena: (AD) i plijena E. coli; (EH) i C. jejuni prey. (A) Tipična ASx5LT stanica povezana s jednom stanicom E. coli (EC); (B) filamentni ASx5LT pričvršćen na jednu EC ćeliju; (C) Nitasta ASx5LT stanica povezana s više EC stanica; (D) Pričvršćivanje manjih ASx5LT stanica na jednu stanicu E. coli (EC); (E) jedna ASx5LT stanica povezana sa stanicom Campylobacter jejuni (CJ); (F) ASx5LT napada stanice C. hyointestinalis (CH); (G) dvije Jedna ASx5LT stanica napala je CJ stanicu; (H) Pogled izbliza na točku pričvršćivanja ASx5LT, u blizini vrha CJ ćelije (bar 0,2 μm). Traka predstavlja 1 μm u (A–G).
Predatorske bakterije razvile su se kako bi iskoristile obilje izvora plijena. Očito su naširoko prisutni u mnogim različitim sredinama. Zbog male veličine članova populacije, moguće je izolirati bakterije ASxL5T iz kaše metodom odvajanja faga. Genomska relevantnost ASxL5T za članove obitelji oceanospirillaceae morskih bakterija je iznenađujuća, iako je organizam tolerantan na sol i može rasti na mediju koji sadrži 5% soli. Analiza kvalitete vode gnojovke pokazala je da je sadržaj natrijevog klorida manji od 0,1%. Stoga je blato daleko od morskog okoliša - i geografski i kemijski. Prisutnost tri povezana, ali različita izolata iz istog izvora pruža dokaze da ovi predatori uspijevaju u ovom nemorskom okolišu. Nadalje, analiza mikrobioma (datoteke s podacima dostupne na https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990) pokazala je da se ista sekvenca gena 16S rRNA nalazi u prvih 50 najzastupljenijih operativnih taksona (OTU ) U nekoliko intervala uzorkovanja isplake. U bazi podataka Genbank pronađeno je nekoliko nekultiviranih bakterija koje imaju sekvence gena 16S rRNA slične bakterijama ASxL5T. Čini se da ove sekvence, zajedno sa sekvencama ASxL5T, ASxS5 i ASxO5, predstavljaju različite kladuse odvojene od Thalassolituusa i Oceanobactera (Slika 2). Tri vrste nekultiviranih bakterija (GQ921362, GQ921357 i GQ921396) izolirane su iz vode pukotina na dubini od 1,3 kilometra u južnoafričkom rudniku zlata 2009. godine, a druge dvije (DQ256320 i DQ337006) bile su iz podzemnih voda (također u Južnoj Africi). 2005. godine). Genska sekvenca 16S rRNA koja je najbliže povezana s ASxL5T dio je sekvence gena 16S rRNA dobivene iz obogaćene kulture pješčanih sedimenata dobivenih s plaža sjeverne Francuske 2006. (pristupni broj AM29240828). Još jedan blisko povezan slijed gena 16S rRNA iz nekultivirane bakterije HQ183822.1 dobiven je iz spremnika za prikupljanje ispranog s gradskog odlagališta u Kini. Očito, bakterije ASxL5T nisu visoko reprezentativne u taksonomskim bazama podataka, ali ove sekvence iz nekultiviranih bakterija vjerojatno predstavljaju organizme slične ASxL5T, koji su rasprostranjeni po cijelom svijetu, obično u izazovnim okruženjima. Iz filogenetske analize cijelog genoma, najbliži rođak ASxL5T je Thalassolituus sp. C2-1, T. marinus, T. oleivorans. I O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus je član morske obligatne bakterije fragmentacije ugljikovodika (OHCB), koja je široko rasprostranjena u morskom i kopnenom okolišu i obično postaje dominantna nakon incidenata onečišćenja ugljikovodicima30,31. Morske bakterije nisu članice OHCB skupine, ali su izolirane iz morskog okoliša.
Fenotipski podaci pokazuju da je ASxL5T nova vrsta i član prethodno neprepoznatog roda u obitelji morskih spirospiraceae. Trenutno ne postoji jasan standard za klasificiranje novoizoliranih sojeva u novi rod. Pokušalo se odrediti univerzalne granice rodova, na primjer, na temelju postotka genoma konzervativnog proteina (POCP), preporučuje se da granična vrijednost bude 50% identična referentnom soju33. Drugi predlažu korištenje AAI vrijednosti, koje imaju prednosti u odnosu na POCP jer se mogu dobiti iz nepotpunih genoma34. Autor smatra da ako je vrijednost AAI manja od 74% u usporedbi s modelnim sojem modelne vrste, soj je predstavnik drugog roda. Modelni rod u morskim spirillaceae je marine spirillum, a modelni soj je O. linum ATCC 11336T. Vrijednost AAI između ASxL5T i O. linum ATCC 11336T iznosi 54,34%, a vrijednost AAI između ASxL5T i T. oleivorans MIL-1T (sojevi roda) je 67,61%, što ukazuje da ASxL5T predstavlja novi rod različit od Thalassolituus. Korištenjem sekvence gena 16S rRNA kao klasifikacijskog standarda, predložena granica razgraničenja roda je 94,5%35. ASxL5T se može smjestiti u rod Thalassolituus, pokazujući 95,03% identičnosti sekvence 16S rRNA s T. oleivorans MIL-1T i 96,17%. marinus IMCC1826T. Međutim, također će biti smješten u rod Bacteroides koji ima 94,64% identičnosti gena 16S rRNA s B. sanyensis NV9, što ukazuje da upotreba jednog gena kao što je gen 16S rRNA može dovesti do proizvoljne klasifikacije i dodjele. Druga predložena metoda koristi ANI i Genome Alignment Score (AF) za ispitivanje grupiranja podatkovnih točaka svih tipova i netipskih sojeva postojećih rodova. Autor preporuča kombiniranje granice roda s točkom infleksije procijenjenog roda specifičnog za taksone koji se analiziraju. Međutim, ako nema dovoljno potpunih sekvenci genoma iz izolata Thalassolituus, ovom metodom nemoguće je utvrditi pripada li ASxL5T rodu Thalassolituus. Zbog ograničene dostupnosti kompletnih sekvenci genoma za analizu, cijelo filogenetsko stablo genoma treba tumačiti s oprezom. Drugo, metode usporedbe cijelog genoma ne mogu objasniti značajne razlike u veličini uspoređivanih genoma. Mjerili su sličnost sačuvanih gena s jednom kopijom jezgre između povezanih rodova, ali nisu uzeli u obzir velik broj gena koji nisu prisutni u mnogo manjem genomu ASxL5T. Očito, ASxL5T i skupine uključujući Thalassolituus, Oceanobacter i Bacterioplanes imaju zajedničkog pretka, ali evolucija je krenula drugačijim putem, što dovodi do smanjenja genoma, što bi moglo biti prilagodba predatorskom načinu života. To je u suprotnosti s T. oleivorans MIL-1T, koji je 28% veći i evoluirao je pod različitim pritiscima okoliša kako bi iskoristio ugljikovodike23,30. Zanimljiva usporedba može se napraviti s obligatnim intracelularnim parazitima i simbiontima, kao što su Rickettsia, Chlamydia i Buchnera. Veličina njihovog genoma je oko 1 Mb. Sposobnost iskorištavanja metabolita stanice domaćina dovodi do gubitka gena, pa je pretrpio značajnu evolucijsku genomsku degradaciju. Evolucijske promjene od morskih organizama s kemijskim hranjivim tvarima do grabežljivog načina života mogu rezultirati sličnim smanjenjem veličine genoma. Analiza COG i KEGG naglašava broj gena koji se koriste za određene funkcije i globalne razlike u genomskim putovima između ASxL5T i T. oleivorans MIL-1T, koje nisu posljedica široko rasprostranjene dostupnosti mobilnih genetskih elemenata. Razlika u omjeru G + C cijelog genoma ASxL5T je 56,1%, a T. oleivorans MIL-1T 46,6%, što također ukazuje na njegovu segregaciju.
Ispitivanje sadržaja kodiranja genoma ASxL5T daje funkcionalne uvide u fenotipske karakteristike. Prisutnost gena koji kodiraju fimbrije tipa IV (Tfp) od posebnog je interesa jer potiču kretanje stanica, koje se naziva socijalno klizanje ili konvulzije, bez flagela na površini. Prema izvješćima, Tfp ima i druge funkcije, uključujući grabežljivost, patogenezu, stvaranje biofilma, prirodni unos DNK, automatsku agregaciju stanica i razvoj38. Genom ASxL5T sadrži 18 gena koji kodiraju diguanilat ciklazu (enzim koji katalizira pretvorbu 2 gvanozin trifosfata u gvanozin 2 fosfat i ciklički diGMP) i 6 gena koji kodiraju odgovarajući diguanilat ciklaza fosfat diguanilat. Gen za esterazu (katalizira razgradnju cikličkog di-GMP-a u gvanozin-monofosfat) zanimljiv je jer je cikl-di-GMP važan drugi glasnik uključen u razvoj i odvajanje biofilma, kretanje, pričvršćivanje stanica i virulentnost 39, 40 u procesu. Također treba napomenuti da se kod Bdellovibrio bacteriovorus pokazalo da ciklički dvostruki GMP kontrolira prijelaz između slobodnog života i grabežljivog načina života41.
Većina istraživanja predatorskih bakterija usredotočena je na Bdellovibrio, organizme slične Bdellovibriju i vrste Myxococcus. Ovi i drugi poznati primjeri grabežljivih bakterija čine raznoliku skupinu. Unatoč toj raznolikosti, identificiran je skup karakterističnih obitelji proteina koji odražavaju fenotipove 11 poznatih predatorskih bakterija3,22. Međutim, identificirani su samo geni koji kodiraju O antigen ligazu (waaL), što je osobito uobičajeno kod Gram-negativnih bakterija. Ovaj oblik analize nije od pomoći u određivanju ASxL5T kao predatora, vjerojatno zato što koristi novu strategiju napada. Dostupnost raznolikijih predatorskih bakterijskih genoma pomoći će u razvoju finijih analiza razlučivosti koje uzimaju u obzir dokaze o funkcionalnim i ekološkim razlikama između članova grupe. Primjeri grabežljivih bakterija koje nisu uključene u ovu analizu uključuju članove Cupriavidus necator42 i Bradymonabacteria43, jer kako istraživači istražuju različite mikrobne zajednice, uspostavlja se više grabežljivih svojti.
Najistaknutija značajka ASxL5T bakterija snimljenih TEM slikom je njihova jedinstvena i fleksibilna morfologija, koja može pospješiti interakciju s bakterijama plijenom. Vrsta primijećene interakcije razlikuje se od ostalih predatorskih bakterija i nije prethodno otkrivena niti prijavljena. Predloženi grabežljivi životni ciklus ASxL5T prikazan je na slici 5. Malo je primjera u literaturi sa sličnim apikalnim strukturama kao što ih ovdje navodimo, ali ti primjeri uključuju Terasakiispira papahanaumokuakeensis, morsku bakteriju spirillum s povremenim povećanjem vrha 44, i Alphaproteobacteria, Terasakiella pusilla , ranije pripadao rodu Oceanospirillum, koji pokazuje takozvani "polarni film" 45. Cocci oblici često se opažaju u starijim kulturama, posebno za bakterije sa zakrivljenim oblicima, kao što su Vibrio, Campylobacter i Helicobacter 46, 47, 48, koje mogu predstavljati degradirano stanje. Potreban je daljnji rad kako bi se razjasnio točan životni ciklus bakterija ASxL5T. Kako bi se utvrdilo kako hvata i lovi te kodira li njegov genom biološki aktivne spojeve koji se mogu koristiti u medicinske ili biotehnološke svrhe.
Opis Venatorbacter gen. studeni Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. sastoji se od venatora od L. n. venator, 'lovac' i gr. n. bacter, 'štap'. Venatorbacter, 'lovački štap' Stanice su aerobne, zakrivljene po Gramu, aktivnost katalaze i oksidaze se ne akumuliraju Raspon temperature od 4 do 42 °C. U morskim puževima većina je netolerantna na kisele masne kiseline C16:1ω7c i C16:0. C18:1ω9; C12:0 3-OH i C10:0 3-OH nalaze se kao hidroksi masne kiseline ne raste u bujonu Sadržaj DNA G + C je 56.1% Pripadnici ovog roda pokazuju otpornost na Campylobacter. Filogenetski položaj ovog roda je u obitelji.
Opis Venatorbacter cucullus sp. studeni Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus znači žižak).
Osim toga, opisna značajka ovog roda je da su, kada se uzgajaju na BA ili BHI, stanice duge 1,63 µm i široke 0,37 µm. Kolonije na BHI agaru su vrlo male, dosežu 2 mm u promjeru nakon 72 sata. Oni su bež, prozirni, okrugli, konveksni i sjajni. Pripadnici ove vrste mogu koristiti Escherichia coli i Klebsiella. Campylobacter i nekoliko drugih Gram-negativnih bakterija služe kao plijen.
Tipični soj ASxL5T izoliran je iz goveđeg mlijeka u Nottinghamshireu, UK, i pohranjen u Nacionalnoj zbirci tipskih kultura (UK): pristupni broj NCTC 14397 i nizozemskoj zbirci bakterijskih kultura (NCCB) pristupni broj NCCB 100775. Potpuna sekvenca genoma ASxL5T je pohranjen u Genbank prema dodatku CP046056.
Bakterije ASxL5T izolirane su iz goveđeg mlijeka tehnologijom izolacije faga9,49. Suspenzija je razrijeđena 1:9 (w/v) u SM puferu (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,1 M NaCl, 8 mM MgSO4.7H2O i 0,01% želatine; Sigma Aldrich, Gillingham, UK), zatim inkubirati na 4°C tijekom 24 sata, polako rotirajući da se ispere predatora u tampon. Suspenzija je centrifugirana na 3000 g 3 minute. Supernatant je sakupljen i centrifugiran na 13,000 g po drugi put 5 minuta. Supernatant je zatim propušten kroz membranski filter od 0,45 µm (Minisart; Sartorius, Gottingen, Njemačka) i membranski filter od 0,2 µm (Minisart) kako bi se uklonile sve preostale bakterijske stanice. ASxL5T može proći ove filtre. Meki agar travnjak Campylobacter enterosus S12 (NCBI pristupni broj CP040464) iz iste kaše pripremljen je standardnim tehnikama. Filtrirana suspenzija je raspoređena na svaku od ovih ploča sa stanicama domaćina u 10 ul kapljica u tri primjerka i ostavljena da se osuši. Ploča je inkubirana u mikroaerofilnom spremniku na 37°C tijekom 48 sati u mikroaerobnim uvjetima (5% O2, 5% H2, 10% CO2 i 80% N2). Dobiveni vidljivi plak ekstrahiran je u SM pufer i prebačen na svježi travnjak C. hyointestinalis S12 radi daljnjeg razmnožavanja liziranih organizama. Nakon što se utvrdi da je bakterija uzrok litičnog plaka, a ne fag, pokušajte uzgojiti organizam neovisno o domaćinu i dodatno ga karakterizirati. Aerobna kultura je izvedena na 37 °C s 5% v/v defibrinirane konjske krvi (TCS Biosciences Lt, Buckingham, UK, dodatak). Prema smjernicama Nacionalnog odbora za kliničke standarde, metoda disk difuzije koristi se za ispitivanje antibakterijske osjetljivosti. BHI agar je uzgajan na 37 °C pomoću diska koji je sadržavao sljedeće antibiotike (Oxoid) za aerobnu kulturu: amoksicilin i klavulanska kiselina 30 µg; cefotaksim 30 µg; streptomicin 10 µg; ciprofloksacin 5 µg; Ceftazidim 30 µg Nalidiksična kiselina 30 µg; Imipenem 10 µg; Azitromicin 15 µg; kloramfenikol 30 µg; cefoksitin 30 µg; Tetraciklin 30 µg; Nitrofurantoin 300 µg; Aztreonam 30 µg; ampicilin 10 µg; cefpodoksim 10 µg; Trimetoprim-sulfametoksazol 25 µg. Tolerancija na sol utvrđena je aerobnom inkubacijom na BHI agar pločama na 37 °C. Na BHI agar ploče dodan je dodatni NaCl kako bi se osigurao raspon koncentracije do 10% w/v. Raspon pH određuje se aerobnom kulturom na BHI agar pločama na 37°C, gdje je pH raspon podešen na između 4 i 9 sterilnom HCl ili sterilnom NaOH, a ciljna pH vrijednost se provjerava prije izlijevanja ploče. Za analizu stanične masne kiseline, ASxL5T je uzgajan na BHI agaru 3 dana i aerobno na 37 °C. Prema MIDI (Sherlock Microbial Identification System, verzija 6.10) standardnom protokolu FERA Science Ltd, (York, UK), stanične masne kiseline su ekstrahirane, pripremljene i analizirane.
Za TEM, ASxL5T je uzgojen aerobno tako da se ravnomjerno nanosi na BA na 37°C tijekom 24 sata, a zatim sakupljen u 1 ml 3% (v/v) glutaraldehida u 0,1 M kakodilatnom puferu na sobnoj temperaturi, fiksirajte 1 sat, zatim centrifugirajte na 10 000 g 3 minute. Zatim nježno resuspendirajte talog u 600 μl 0,1 M pufera za kakodilat. Prenesite fiksiranu ASxL5T suspenziju na Formvar/ugljični film na bakrenu rešetku od 200 mesh. Bakterije su obojene s 0,5% (w/v) uranil acetatom tijekom 1 minute i ispitane pomoću TEM-a pomoću mikroskopa TEI Tecnai G2 12 Biotwin. Kao što je gore spomenuto, pomiješajte isti broj plijena i predatora u NZCYM bujonu (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) i inkubirajte 48 sati u mikroaerobnim uvjetima Campylobacter ili Campylobacter na 37°C, Interakcija predatora i plijena također je pregledan TEM-om. Aerobni uvjeti za Escherichiju coli. Neovisno ispitajte plijen i predatorske bakterije kako biste utvrdili bilo kakve promjene u morfologiji stanica uzrokovane predatorstvom. Sudanska crna metoda korištena je za optičku mikroskopiju nakupljanja PHB.
Uzgajajte kulture ASxL5T preko noći razmazivanjem rasta na BHI ili BA pločice sterilnim tamponom. Prikupite stanice ASxL5T i suspendirajte ih u MRD (CM0733, Oxoid), a zatim ih stavite na 4°C 7 dana kako bi stanice izgladnjele. NCTC referentna ili laboratorijska osnovna bakterijska kultura inokulirana je u BHI bujon ili hranjivi bujon br. 2 (CM007, Oxoid), inkubirana preko noći, centrifugirana na 13 000 g i resuspendirana u MRD dok OD600 nije bio 0,4. Kultura: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, Klebsiella oxytoca 11466, Leuconostoc NCTC 10817, Listeria Special bakterije NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, Rhodococcus submarine hamburger NCTC 1621T, Salmonella intestinalne bakterije Mondeville NCTC 5747, sluz NCTC 10861, Staphylococcus aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. Campylobacter domaćin mikroaerobno je inkubiran na BA pločama na 37°C i suspendiran u NZCYM bujonu. Testirani domaćini Campylobacter su: C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11458, C. lari NCTC 11458, C. jejuni PT14, C... Sakupite stanice u MRD, centrifugirajte na 13 000 g i resuspendirajte u MRD dok OD600 ne bude 0,4. Dodajte alikvot od 0,5 ml suspenzije u 5 ml otopljenog NZCYM gornjeg agara (0,6% agar) i izlijte na 1,2% NZCYM donju ploču. Nakon stvrdnjavanja i sušenja, serijski razrijeđeni ASxL5T raspoređen je kao kapljice od 20 µl na svaku ploču travnjaka u tri primjerka. Temperatura kulture i atmosfera ovise o zahtjevima ispitivanih bakterija.
Koristite GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma Aldridge) za pripremu DNA iz bakterijskih izolata. Standardne metode korištene su za PCR amplificiranje gena 16S rRNA i određivanje sekvence produkta korištenjem kemije terminacije boje (Eurofins Value Read Service, Njemačka). Upotrijebite program BLAST-N za usporedbu ovih sekvenci s drugim sekvencama gena 16S rRNA kako biste identificirali i prikupili blisko povezane vrste. Oni su usklađeni pomoću ClustalW u programu MEGA X. Filogenetsko stablo rekonstruirano je pomoću MEGA X koristeći metodu maksimalne vjerojatnosti temeljenu na modelu Tamura-Nei, s 1000 vođenih kopija54. Upotrijebite komplet PureLink™ Genomic DNA (Fisher Scientific, Loughborough, UK) za izdvajanje DNK za sekvencioniranje cijelog genoma. Sekvenca genoma ASxL5T određena je korištenjem kombinacije Illumina MiSeq, koja se sastoji od dvostrukih očitanja od 250 bp sastavljenih od biblioteke pripremljene pomoću pribora za označavanje Nextera i dugih očitanja od 2 do 20 kb s platforme PacBio. Genomics DNA Research Facility na Sveučilištu Sembia. Genom je sastavljen pomoću CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen, Aarhus, Danska). Kulture ASxL5T pohranjene su u Nacionalnoj zbirci tipskih kultura (UK) i Nizozemskoj zbirci bakterijskih kultura (NCCB). Genomi srodnih organizama korišteni za usporedbu su: Thalassolituus oleivorans MIL-1T (pristupni broj HF680312, potpun); Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (pristupni broj BMYY01000001, nepotpun); Oceanobacter kriegii DSM 6294T (pristupni broj NZ_AUGV00000000, nepotpun); Marinamonas zajednica DSM 5604T (dodan ASM436330v1, nepotpuno), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (dodan MTSD02000001, nepotpuno) i Thalassolituus sp. C2-1 (dodati NZ_VNIL01000001, nepotpuno). Koristite JGI Genome Portal36 na https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page= za određivanje rezultata poravnanja (AF) i prosječnog identiteta nukleinske kiseline (ANI). U parovima. Za određivanje identiteta aminokiselina (AAI) korištena je metoda Rodriguez-R & Konstantinidis55. Koristite GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 za generiranje procijenjenog filogenetskog stabla najveće vjerojatnosti. Ulazni genom koji predstavlja dostupni referentni genom odabran je iz referentnih rodova koji su identificirani kao srodni ASxL5T iz filogenije 16S rRNA. Stablo je označeno pomoću online alata za interaktivno stablo života (https://itol.embl.de/). Funkcionalna anotacija i analiza genoma ASxL5T provodi se pomoću mrežnog alata BlastKOALA KEGG uz korištenje distribucije obogaćivanja modula KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Distribucija COG kategorija (ortolognih skupina) određena je pomoću online alata eggNOG-mapper.
Pérez, J., Moraleda-Muñoz, A., Marcos-Torres, FJ i Muñoz-Dorado, J. Bakterijska predacija: 75 godina i nastavlja se! . okruženje. mikroorganizam. 18, 766–779 (2016).
Linares-Otoya, L. itd. Raznolikost i antibakterijski potencijal grabežljivih bakterija na peruanskoj obali. Ožujski lijekovi. 15. E308. https://doi.org/10.3390/md15100308 (2017).
Pasternak, Z. i sur. Kroz njihove gene, razumjet ćete ih: genomske karakteristike predatorskih bakterija. ISME J. 7, 756–769 (2013).
Sockett, RE Predatorski životni stil bakteriofaga Bdellovibrio. instalirati. Pastor mikrobi. 63, 523–539 (2009).
Korp, J., Vela Gurovic, MS & Nett, M. Antibiotici iz predatorskih bakterija. Beilstein J. Histokemija 12, 594-607 (2016).
Johnke, J., Fraune, S., Bosch, TCG, Hentschel, U. & Schulenburg, H. Bdellovibrio i slični organizmi prediktori su raznolikosti mikrobioma u različitim populacijama domaćina. mikroorganizam. Ekologija. 79, 252–257 (2020).
Vila, J., Moreno-Morales, J. i Ballesté-Delpierre, C. Otkrijte trenutni status novih antibakterijskih sredstava. klinički. mikroorganizam. Zaraziti. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2019.09.015 (2019).
Hobley, L. i sur. Dvostruka grabežljivost faga i faga može iskorijeniti plijen E. coli bez ijednog grabežljivaca. J. Bakterije. 202, e00629-19. https://doi.org/10.1128/JB.00629-19 (2020).
El-Shibiny, A., Connerton, PL & Connerton, IF Broj i raznolikost Campylobactera i bakteriofaga izoliranih tijekom ciklusa hranjenja pilića iz slobodnog uzgoja i organskih pilića. Aplikacijsko okruženje. mikroorganizam. 71, 1259-1266 (2005).
Wilkinson, DA itd. Ažurirati genomsku taksonomiju i epidemiologiju Campylobacter svinja. znanost. Predstavnik 8, 2393. https://doi.org/10.1038/s41598-018-20889-x (2018).
Lee, MD GToTree: Jednostavan tijek rada za sustavnu genomiku. Bioinformatika 35, 4162–4164 (2019).
Edgar, RC MUSCLE: Metoda usklađivanja više sekvenci koja smanjuje vremensku i prostornu složenost. BMC biološke informacije. 5, 113 (2004).
Capella-Gutiérrez, S., Silla-Martínez, JM & Gabaldón, T. TrimAl: Alat za automatsko poravnavanje i podrezivanje u velikoj filogenetskoj analizi. Bioinformatika 25, 1972–1973 (2009).
Hyatt, D., LoCascio, PF, Hauser, LJ & Uberbacher, EC gen i predviđanje mjesta početka translacije metagenomske sekvence. Bioinformatika 28, 2223-2230 (2012).
Shen, W. & Xiong, J. TaxonKit: Međuplatformski i učinkovit NCBI alat za klasifikaciju. Bio Rxiv. (Pristupljeno 1. lipnja 2021.); https://www.biorxiv.org/content/10.1101/513523v1 (2019).
Price, MN, Dehal, PS & Arkin, AP FastTree 2-približno stablo najveće vjerojatnosti s velikim poravnanjem. PLoS One 5, e9490 (2010).
Tange, O. GNU Parallel. (Pristupljeno 1. lipnja 2021.); https://zenodo.org/record/1146014#.YOHaiJhKiUk (2018).
Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: Kyoto enciklopedija gena i genoma. Istraživanja nukleinskih kiselina. 28, 27-30 (2000).
Češka, L. itd. Uloga ekstremolita ektoina i hidroksiektoina kao zaštitnika stresa i hranjivih tvari: genetika, genomika sustava, biokemija i strukturna analiza. Gene (Basel). 9. E177. https://doi.org/10.3390/genes9040177 (2018).
Gregson, BH, Metodieva, G., Metodiev, MV, Golyshin, PN & McKew, BA Diferencijalna ekspresija proteina tijekom rasta obligatne morske bakterije koja razgrađuje ugljikovodike Thalassolituus oleivorans MIL-1 tijekom rasta alkana srednjeg i dugog lanca. ispred. mikroorganizam. 9, 3130 (2018).
Pasternak, Z., Ben Sasson, T., Cohen, Y., Segev, E., i Jurkevitch, E. Nova komparativna genomska metoda za definiranje fenotipskih specifičnih pokazatelja otkriva specifično nasljeđe kod predatorskih bakterija. Public Science Library One. 10. e0142933. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142933 (2015).
Yakimov, MM, itd. Gen Thalassolituus oleivorans. studeni, sp. nov., nova vrsta morskih bakterija specijalizirana za korištenje ugljikovodika. internacionalnost. J. Sustav. evolucija. mikroorganizam. 54, 141–148 (2004).
Wang, Y., Yu, M., Liu, Y., Yang, X. i Zhang, XH Bacterioplanoides pacificum gen. studeni, sp. U studenom se odvojio od morske vode koja kruži južnim Pacifikom. internacionalnost. J. Sustav. evolucija. mikroorganizam. 66, 5010-5015 (2016).