Un nuovo tipo di batteri gram-negativi, aerobici, tolleranti al sale, attivi, a forma di bastoncino e predatori ASxL5T è stato isolato da uno stagno di sterco di mucca nel Nottinghamshire, in Inghilterra, e ha utilizzato Campylobacter come preda. Successivamente furono scoperte come prede altre specie di Campylobacter e membri della famiglia delle Enterobacteriaceae. Dopo la subcoltura senza cellule ospiti, è stata ottenuta una debole crescita asettica su Brain Heart Infusion Agar. Le condizioni ottimali di crescita sono 37 °C e il pH è 7. La microscopia elettronica a trasmissione ha rivelato alcune caratteristiche morfologiche molto insolite legate alla disponibilità delle prede. L'analisi filogenetica utilizzando la sequenza del gene 16S rRNA ha indicato che l'isolato è correlato a un membro della famiglia della Spirulina marina, ma non può essere chiaramente classificato come membro di alcun genere conosciuto. Il sequenziamento dell'intero genoma di ASxL5T ha confermato la relazione con i membri delle spirochete marine. Una ricerca nel database ha rivelato che diversi ASxL5T condividono sequenze genetiche dell'rRNA 16S con diversi batteri non coltivati ​​provenienti dall'oceano, dalla superficie terrestre e dalle acque sotterranee. Suggeriamo che il ceppo ASxL5T rappresenti una nuova specie in un nuovo genere. Consigliamo il nome Venatorbacter cucullus gen. Novembre, sp. A novembre, ASxL5T è stato utilizzato come ceppo tipo.
I batteri predatori sono batteri che mostrano la capacità di dare la caccia e uccidere altri batteri viventi per ottenere materiali biosintetici ed energia. Questo è diverso dal recupero generale dei nutrienti dai microrganismi morti, ed è anche diverso dalle interazioni parassitarie, in cui i batteri formano uno stretto rapporto con il loro ospite senza ucciderlo. I batteri predatori hanno evoluto cicli vitali diversi per sfruttare le abbondanti fonti di cibo nelle nicchie in cui si trovano (come gli habitat marini). Si tratta di un gruppo tassonomicamente diversificato, collegato solo dal loro ciclo di vita di sterilizzazione unico1. Esempi di batteri predatori sono stati trovati in diversi phyla, tra cui: Proteobacteria, Bacteroides e Chlorella.3. Tuttavia, i batteri predatori più studiati sono gli organismi Bdellovibrio e Bdellovibrio e simili (BALOs4). I batteri predatori sono una fonte promettente di nuovi composti biologicamente attivi e agenti antibatterici5.
Si ritiene che i batteri predatori migliorino la diversità microbica e abbiano un impatto positivo sulla salute, sulla produttività e sulla stabilità dell’ecosistema6. Nonostante questi attributi positivi, ci sono pochi studi sui nuovi batteri predatori a causa della difficoltà di coltivare i batteri e della necessità di osservare attentamente le interazioni cellulari per comprenderne i complessi cicli di vita. Questa informazione non è facile da ottenere dall’analisi computerizzata.
In un’era di crescente resistenza antimicrobica, si stanno studiando nuove strategie per colpire i batteri patogeni, come l’uso di batteriofagi e batteri predatori7,8. I batteri ASxL5T sono stati isolati nel 2019 utilizzando la tecnologia di isolamento dei fagi dallo sterco di vacca raccolto dal Dairy Center dell'Università di Nottingham, Nottinghamshire. Lo scopo dell'indagine è isolare organismi con potenziale come agenti di controllo biologico. Il Campylobacter hyointestinalis è un patogeno zoonotico, sempre più associato alle malattie intestinali umane10. È onnipresente nel siero e viene utilizzato come ospite bersaglio.
Il batterio ASxL5T è stato isolato dalla gelatina di manzo perché si è osservato che le placche che formava sul prato di C. hyointestinalis erano simili a quelle prodotte dai batteriofagi. Si tratta di una scoperta inaspettata, perché parte del processo di isolamento dei fagi prevede il filtraggio attraverso un filtro da 0,2 µm, progettato per rimuovere le cellule batteriche. L'esame microscopico del materiale estratto dalla placca ha rivelato che i piccoli batteri gram-negativi a forma di bastoncino ricurvo non accumulavano poliidrossibutirrato (PHB). La coltura asettica indipendente dalle cellule preda viene realizzata su un terreno solido ricco (come l'agar infusione cuore-cervello (BHI) e l'agar sangue (BA)) e la sua crescita è debole. Si ottiene dopo subcoltura con inoculo pesante migliorato. Cresce altrettanto bene in condizioni microaerobiche (7% v/v di ossigeno) e di ossigeno atmosferico, ma non in un'atmosfera anaerobica. Dopo 72 ore, il diametro della colonia era molto piccolo, raggiungendo i 2 mm, ed era beige, traslucida, rotonda, convessa e lucida. I test biochimici standard sono ostacolati perché ASxL5T non può essere coltivato in modo affidabile in mezzi liquidi, il che suggerisce che potrebbe fare affidamento sul complesso ciclo di vita della formazione del biofilm. Tuttavia, la sospensione su piastra ha mostrato che ASxL5T è aerobico, positivo per ossidasi e catalasi e può tollerare il 5% di NaCl. ASxL5T è resistente a 10 µg di streptomicina, ma è sensibile a tutti gli altri antibiotici testati. Le cellule batteriche ASxL5T sono state esaminate mediante TEM (Figura 1). Se coltivate senza cellule preda sul BA, le cellule ASxL5T sono piccoli Campylobacter, con una lunghezza media di 1,63 μm (± 0,4), una larghezza di 0,37 μm (± 0,08) e un unico polo lungo (fino a 5 μm). Flagelli sessuali. Sembra che circa l'1,6% delle cellule abbia una larghezza inferiore a 0,2 μm, che consentirà il passaggio attraverso il dispositivo di filtraggio. Sulla sommità di alcune celle è stata osservata un'insolita estensione strutturale, simile ad una carenatura (latino cucullus) (vedi frecce in 1D, E, G). Questa sembra essere composta da un eccesso di membrana esterna, forse dovuta alla rapida riduzione delle dimensioni dell'involucro periplasmatico, mentre la membrana esterna rimane intatta, mostrando un aspetto "allentato". La coltura di ASxL5T in assenza di nutrienti (in PBS) per lungo tempo a 4°C ha prodotto che la maggior parte delle cellule (ma non tutte) mostravano una morfologia coccolica (Figura 1C). Quando ASxL5T cresce con Campylobacter jejuni come preda per 48 ore, la dimensione media delle cellule è significativamente più lunga e più stretta rispetto alle cellule coltivate senza ospite (Tabella 1 e Figura 1E). Al contrario, quando ASxL5T cresce con E. coli come preda per 48 ore, la dimensione media delle cellule è più lunga e più ampia rispetto a quando cresce senza prede (Tabella 1) e la lunghezza delle cellule è variabile, solitamente filamentosa (Figura 1F). Quando incubate con Campylobacter jejuni o E. coli come prede per 48 ore, le cellule ASxL5T non mostravano alcun flagello. La tabella 1 riassume le osservazioni dei cambiamenti nelle dimensioni delle cellule in base alla presenza, all'assenza e al tipo di preda di ASxL5T.
Visualizzazione TEM di ASx5LT: (A) ASx5LT mostra una frusta lunga; (B) tipica batteria ASx5LT; (C) cellule cocchi ASx5LT dopo una lunga incubazione senza nutrienti; (D) un gruppo di cellule ASx5LT mostra anormalità (E) Il gruppo di cellule ASx5LT incubato con preda di Campylobacter ha mostrato una maggiore lunghezza cellulare rispetto a quelli senza crescita della preda (D) ha mostrato anche una struttura apicale; (F) Grandi flagelli filamentosi, cellule ASx5LT, dopo incubazione con preda di E. coli; (G) Una singola cellula ASx5LT dopo l'incubazione con E. coli, che mostra un'insolita struttura superiore. La barra rappresenta 1 μm.
La determinazione della sequenza del gene 16S rRNA (numero di accesso MT636545.1) consente ricerche nel database per stabilire sequenze simili a quelle della classe Gammaproteobacteria e sono i più vicini ai batteri marini della famiglia degli spirilli marini (Figura 2) e sono membri del genere Thalassolituus Il parente più stretto del Marine Bacillus. La sequenza del gene 16S rRNA è chiaramente diversa da quella dei batteri predatori appartenenti alla famiglia delle Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria). I confronti a coppie di B. bacteriovorus HD100T (ceppo tipo, DSM 50701) e B. bacteriovorus DM11A erano del 48,4% e 47,7% e per B. exovorus JSS era del 46,7%. I batteri ASxL5T hanno 3 copie del gene 16S rRNA, due delle quali sono identiche tra loro e la terza è distante 3 basi. Altri due isolati batterici predatori (ASx5S e ASx5O; i numeri di accesso del gene 16S rRNA sono rispettivamente MT636546.1 e MT636547.1) con caratteristiche morfologiche e fenotipiche simili provenienti dalla stessa posizione non sono gli stessi, ma sono diversi da ASxL5T e batteri non coltivati le sequenze del database sono raggruppate insieme ad altri generi nelle Oceanospirillaceae (Figura 2). L'intera sequenza del genoma di ASxL5T è stata determinata e salvata nel database NCBI e il numero di accesso è CP046056. Il genoma di ASxL5T è costituito da un cromosoma circolare di 2.831.152 bp con un rapporto G+C del 56,1%. La sequenza del genoma contiene 2653 CDS (totale), di cui si prevede che 2567 codifichino proteine, di cui 1596 possono essere assegnate come funzioni putative (60,2%). Il genoma contiene 67 geni codificanti RNA, inclusi 9 rRNA (3 ciascuno per 5S, 16S e 23S) e 57 tRNA. Le caratteristiche genomiche di ASxL5T sono state confrontate con i genomi disponibili di ceppi del tipo parente più vicino identificati dalla sequenza del gene 16S rRNA (Tabella 2). Utilizzare l'identità degli aminoacidi (AAI) per confrontare tutti i genomi Thalassolituus disponibili con ASxL5T. La sequenza genomica disponibile (incompleta) più vicina determinata dall'AAI è Thalassolituus sp. C2-1 (aggiungere NZ_VNIL01000001). Questo ceppo è stato isolato dai sedimenti delle profondità marine della Fossa delle Marianne, ma attualmente non sono disponibili informazioni fenotipiche su questo ceppo per il confronto. Rispetto ai 2,82 Mb di ASxL5T, il genoma dell'organismo è più grande, pari a 4,36 Mb. La dimensione media del genoma delle spirochete marine è di circa 4,16 Mb (± 1,1; n = 92 genomi di riferimento completi studiati da https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), quindi il genoma di ASxL5T è in linea con ordine Rispetto agli altri membri, è piuttosto piccolo. Utilizzare GToTree 1.5.54 per generare un albero filogenetico di massima verosimiglianza stimato basato sul genoma (Figura 3A), utilizzando le sequenze di aminoacidi allineate e collegate di 172 geni a copia singola specifici dei Gammaproteobacteria 11,12,13,14,15,16, 17,18. L'analisi ha dimostrato che è strettamente correlato a Thalassolituus, Bacterial Plane e Marine Bacterium. Tuttavia, questi dati indicano che ASxL5T è diverso dai suoi parenti nella Spirulina marina e sono disponibili i dati sulla sequenza del suo genoma.
L'albero filogenetico che utilizza la sequenza del gene 16S rRNA evidenzia la posizione dei ceppi ASxL5T, ASxO5 e ASxS5 (con le viscere) rispetto ai ceppi di batteri incolti e marini nelle Spirulinaceae marine. Il numero di accesso Genbank segue il nome del ceppo tra parentesi. Utilizza ClustalW per allineare le sequenze e utilizza il metodo di massima verosimiglianza e il modello Tamura-Nei per dedurre le relazioni filogenetiche ed eseguire 1000 repliche guidate nel programma MEGA X. Il numero sul ramo indica che il valore della copia guidata è superiore al 50%. Come outgroup è stato utilizzato Escherichia coli U/541T.
(A) Un albero filogenetico basato sul genoma, che mostra la relazione tra il batterio marino Spirospiraceae ASxL5T e i suoi parenti stretti, E. coli U 5/41T come gruppo esterno. (B) Rispetto a T. oleivorans MIL-1T, la distribuzione della categoria funzionale dei geni è prevista in base al cluster del gruppo ortologo (COG) della proteina ASx5LT. La figura a sinistra mostra il numero di geni in ciascuna categoria COG funzionale in ciascun genoma. Il grafico a destra mostra la percentuale di genomi contenuti in ciascun gruppo COG funzionale. (C) Rispetto a T. oleiverans MIL-1T, l'analisi del percorso modulare completo KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) di ASxL5T.
Utilizzando il database KEGG per esaminare i geni componenti presenti nel genoma ASxL5T è stato rivelato il percorso metabolico tipico del gamma Proteus aerobico. ASxL5T contiene un totale di 75 geni assegnati alle proteine ​​motrici batteriche, inclusi i geni coinvolti nella chemiotassi, nell'assemblaggio dei flagelli e nel sistema delle fimbrie di tipo IV. Nell'ultima categoria, 9 geni su 10 sono responsabili del movimento di contrazione di una serie di altri organismi. Il genoma di ASxL5T contiene una via biosintetica completa della tetraidropirimidina che partecipa alla risposta protettiva allo stress osmotico20, come previsto per gli alofili. Il genoma contiene anche molte vie complete per cofattori e vitamine, comprese le vie di sintesi della riboflavina. Sebbene il gene dell'alcano 1-monoossigenasi (alkB2) sia presente in ASxL5T, il percorso di utilizzo degli idrocarburi non è completo. Nella sequenza del genoma di ASxL5T, sono ovviamente assenti gli omologhi dei geni identificati come principali responsabili della degradazione degli idrocarburi in T. oleiverans MIL-1T21, come TOL_2658 (alkB) e TOL_2772 (alcol deidrogenasi). La Figura 3B mostra il confronto della distribuzione dei geni nella categoria COG tra ASxL5T e olio d'oliva MIL-1T. Nel complesso, il genoma ASxL5T più piccolo contiene proporzionalmente meno geni di ciascuna categoria COG rispetto al genoma correlato più grande. Quando il numero di geni in ciascuna categoria funzionale è espresso come percentuale del genoma, si notano differenze nella percentuale di geni nelle categorie di traduzione, struttura ribosomiale e biogenesi, e nelle categorie di produzione di energia e funzione di conversione, che costituiscono il più ampio ASxL5T genoma La percentuale viene confrontata con lo stesso gruppo presente nel genoma di T. oleiverans MIL-1T. Al contrario, rispetto al genoma ASxL5T, T. oleivorans MIL-1T ha una percentuale più elevata di geni nelle categorie di replicazione, ricombinazione, riparazione e trascrizione. È interessante notare che la più grande differenza nel contenuto di ciascuna categoria funzionale dei due genomi è il numero di geni sconosciuti presenti in ASxL5T (Figura 3B). È stata eseguita un'analisi di arricchimento dei moduli KEGG, in cui ciascun modulo KEGG rappresenta un insieme di unità funzionali definite manualmente per l'annotazione e l'interpretazione biologica dei dati della sequenza del genoma. Il confronto della distribuzione genica nel percorso completo del modulo KOG di ASxL5T e MIL-1T oliva è mostrato nella Figura 3C. Questa analisi mostra che sebbene ASxL5T abbia una via metabolica completa dello zolfo e dell'azoto, T. oleiverans MIL-1T no. Al contrario, T. oleiverans MIL-1T ha una via metabolica completa della cisteina e della metionina, ma è incompleta in ASxL5T. Pertanto, ASxL5T ha un modulo caratteristico per l'assimilazione del solfato (definito come un insieme di geni che possono essere utilizzati come marcatori fenotipici, come capacità metabolica o patogenicità; https://www.genome.jp/kegg/module.html) In T .oliveran MIL-1T. Confrontare il contenuto genetico di ASxL5T con l'elenco di geni che suggeriscono uno stile di vita predatorio non è conclusivo. Sebbene il gene waaL che codifica la ligasi associata al polisaccaride dell'antigene O al nucleo sia presente nel genoma ASxL5T (ma è comune in molti batteri Gram-negativi), i geni della triptofano 2,3-diossigenasi (TDO) possono includere i 60 aminoacidi regioni acide comunemente presenti nei batteri predatori che non sono presenti. Non sono presenti altri geni caratteristici predatori nel genoma ASxL5T, compresi quelli che codificano per gli enzimi coinvolti nella biosintesi degli isoprenoidi nella via del mevalonato. Si noti che non esiste alcun gene regolatore trascrizionale gntR nel gruppo di predatori esaminato, ma tre geni simili a gntR possono essere identificati in ASxL5T.
Le caratteristiche fenotipiche di ASxL5T sono riassunte nella Tabella 3 e confrontate con le caratteristiche fenotipiche dei generi correlati 23, 24, 25, 26 e 27 riportate in letteratura. Gli isolati di T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis e Oceanobacter kriegii sono corpi a forma di bastoncino attivi, tolleranti al sale, ossidasi positivi, ma non hanno quasi altre caratteristiche fenotipiche con ASxL5T. Il pH medio dell'oceano è 8,1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77), che si riflette in T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis e O. kriegii. ASxL5T è adatto per l'intervallo di pH più ampio (4-9) tipico delle specie non marine. Caratteristiche fenotipiche di Thalassolituus sp. C2-1. Sconosciuto. L'intervallo di temperature di crescita di ASxL5T è generalmente più ampio di quello dei ceppi marini (4–42 °C), sebbene alcuni, ma non tutti gli isolati di T. marinus, siano resistenti al calore. L'incapacità di coltivare ASxL5T in brodo ha impedito un'ulteriore caratterizzazione fenotipica. Utilizzare API 20E per testare i materiali raschiati dalla piastra BA, ONPG, arginina diidrolasi, lisina decarbossilasi, ornitina decarbossilasi, utilizzo del citrato, ureasi, triptofano deaminasi, enzima idrolisi della gelatina, i risultati del test erano tutti negativi, ma senza indolo, acetoino e H2S sono stati prodotti. I carboidrati non fermentati includono: glucosio, mannosio, inositolo, sorbitolo, ramnosio, saccarosio, melibiosio, amigdalina e arabinosio. Rispetto ai ceppi di riferimento correlati pubblicati, il profilo degli acidi grassi cellulari del ceppo ASxL5T è mostrato nella Tabella 4. I principali acidi grassi cellulari sono C16:1ω6c e/o C16:1ω7c, C16:0 e C18:1ω9. Esistono anche acidi grassi idrossilici C12:0 3-OH e C10:0 3-OH. Il rapporto di C16:0 in ASxL5T è superiore al valore riportato dei generi correlati. Al contrario, rispetto al T. marinus IMCC1826TT riportato, il rapporto tra C18:1ω7c e/o C18:1ω6c in ASxL5T è ridotto. oleivorans MIL-1T e O. kriegii DSM 6294T, ma non rilevato in B. sanyensis KCTC 32220T. Il confronto dei profili degli acidi grassi di ASxL5T e ASxLS ha rivelato sottili differenze nella quantità di singoli acidi grassi tra i due ceppi, che sono coerenti con la sequenza del DNA genomico della stessa specie. Utilizzando il test del nero Sudan non sono state rilevate particelle di poli-3-idrossibutirrato (PHB).
L'attività di predazione dei batteri ASxL5T è stata studiata per determinare la gamma delle prede. Questo batterio può formare placche sulle specie Campylobacter, tra cui: Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T; Escherichia coli NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; C lari NCTC 11458 e C. upsaliensis NCTC 11541T. Utilizzare le colture elencate nella sezione relativa alla determinazione dell'intervallo ospite del metodo per testare una gamma più ampia di batteri Gram-negativi e Gram-positivi. I risultati mostrano che ASxL5T può essere utilizzato anche in Escherichia coli NCTC 86 e Citrobacter freundii NCTC 9750T. Placche formate su Klebsiella oxytoca 11466. L'interazione TEM con E. coli NCTC 86 è mostrata nella Figura 4A-D e l'interazione con Campylobacter jejuni PT14 e Campylobacter suis S12 è mostrata nella Figura 4E-H centrale. Il meccanismo di attacco sembra essere diverso tra i tipi di prede testati, con una o più cellule di E. coli attaccate a ciascuna cellula ASxL5T e posizionate lateralmente lungo la cellula estesa prima dell'adsorbimento. Al contrario, ASxL5T sembra attaccarsi al Campylobacter attraverso un singolo punto di contatto, solitamente a contatto con l'apice della cellula predatrice e vicino all'apice della cellula Campylobacter (Figura 4H).
TEM che mostra l'interazione tra ASx5LT e preda: (AD) e preda di E. coli; (EH) e C. jejuni preda. (A) Una tipica cella ASx5LT collegata a una singola cella E. coli (EC); (B) Un ASx5LT filamentoso collegato a una singola cella EC; (C) Una cella ASx5LT filamentosa collegata a più celle EC; (D) Allegato Celle ASx5LT più piccole su una singola cellula di E. coli (EC); (E) una singola cellula ASx5LT collegata a una cellula Campylobacter jejuni (CJ); (F) ASx5LT attacca le cellule di C. hyointestinalis (CH); (G) due cellule One ASx5LT hanno attaccato una cellula CJ; (H) Una vista ravvicinata del punto di attacco ASx5LT, vicino all'apice della cella CJ (barra 0,2 μm). La barra rappresenta 1 μm in (A – G).
I batteri predatori si sono evoluti per trarre vantaggio da abbondanti fonti di prede. Ovviamente, sono ampiamente presenti in molti ambienti diversi. A causa delle dimensioni ridotte dei membri della popolazione, è possibile isolare i batteri ASxL5T dal liquame utilizzando il metodo di separazione dei fagi. La rilevanza genomica di ASxL5T per i membri della famiglia dei batteri marini oceanospirillaceae è sorprendente, sebbene l'organismo sia tollerante al sale e possa crescere su un terreno contenente il 5% di sale. L'analisi della qualità dell'acqua del liquame ha mostrato che il contenuto di cloruro di sodio era inferiore allo 0,1%. Pertanto, il fango è lontano dall'ambiente marino, sia geograficamente che chimicamente. La presenza di tre isolati correlati ma diversi provenienti dalla stessa fonte fornisce la prova che questi predatori prosperano in questo ambiente non marino. Inoltre, l'analisi del microbioma (file di dati disponibili su https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990) ha mostrato che la stessa sequenza genetica dell'rRNA 16S si trova nei primi 50 taxa operativi più abbondanti (OTU ) In pochi intervalli di campionamento del fango. Nel database Genbank sono stati trovati diversi batteri non coltivati, che hanno sequenze di geni rRNA 16S simili ai batteri ASxL5T. Queste sequenze, insieme alle sequenze di ASxL5T, ASxS5 e ASxO5, sembrano rappresentare diversi cladi separati da Thalassolituus e Oceanobacter (Figura 2). Tre tipi di batteri non coltivati ​​(GQ921362, GQ921357 e GQ921396) sono stati isolati dall'acqua della fessura a una profondità di 1,3 chilometri nella miniera d'oro sudafricana nel 2009, e gli altri due (DQ256320 e DQ337006) provenivano dalle acque sotterranee (sempre in Sud Africa). nel 2005). La sequenza del gene 16S rRNA più strettamente correlata ad ASxL5T fa parte della sequenza del gene 16S rRNA ottenuta dalla coltura di arricchimento dei sedimenti sabbiosi ottenuti dalle spiagge della Francia settentrionale nel 2006 (numero di accesso AM29240828). Un'altra sequenza genetica dell'rRNA 16S strettamente correlata proveniente dal batterio non coltivato HQ183822.1 è stata ottenuta da un serbatoio di raccolta lisciviato da una discarica municipale in Cina. Ovviamente, i batteri ASxL5T non sono altamente rappresentativi nei database tassonomici, ma è probabile che queste sequenze di batteri non coltivati ​​rappresentino organismi simili ad ASxL5T, che sono distribuiti in tutto il mondo, solitamente in ambienti difficili. Dall'analisi filogenetica dell'intero genoma, il parente più vicino ad ASxL5T è Thalassolituus sp. C2-1, T. marinus, T. oleivorans. E O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus è un membro dei batteri marini obbligati della frammentazione degli idrocarburi (OHCB), che è diffuso negli ambienti marini e terrestri e di solito diventa il dominante dopo gli incidenti di inquinamento da idrocarburi30,31. I batteri marini non appartengono al gruppo OHCB, ma sono isolati dall'ambiente marino.
I dati fenotipici indicano che ASxL5T è una nuova specie e un membro di un genere precedentemente non riconosciuto nella famiglia delle spirospiracee marine. Attualmente non esiste uno standard chiaro per classificare i ceppi appena isolati in un nuovo genere. Sono stati fatti tentativi per determinare i confini dei generi universali, ad esempio, in base alla percentuale del genoma di una proteina conservativa (POCP), si raccomanda che il valore cut-off sia identico al 50% al ceppo di riferimento33. Altri suggeriscono di utilizzare valori AAI, che presentano vantaggi rispetto a POCP perché possono essere ottenuti da genomi incompleti34. L'autore ritiene che se il valore AAI è inferiore al 74% rispetto al ceppo modello della specie modello, il ceppo è rappresentativo di un genere diverso. Il genere modello nelle spirillaceae marine è lo spirillum marino e il ceppo modello è O. linum ATCC 11336T. Il valore AAI tra ASxL5T e O. linum ATCC 11336T è 54,34% e il valore AAI tra ASxL5T e T. oleivorans MIL-1T (ceppi di tipo genere) è 67,61%, indicando che ASxL5T rappresenta un nuovo genere diverso da Thalassolituus. Utilizzando la sequenza genetica dell'rRNA 16S come standard di classificazione, il limite di delimitazione del genere suggerito è del 94,5%35. ASxL5T può essere inserito nel genere Thalassolituus, mostrando un'identità della sequenza di rRNA 16S del 95,03% con T. oleivorans MIL-1T e del 96,17%. marinus IMCC1826T. Tuttavia, verrà inserito anche nel genere Bacteroides che ha il 94,64% di identità genetica 16S rRNA con B. sanyensis NV9, indicando che l'uso di un singolo gene come il gene 16S rRNA può portare a classificazione e assegnazione arbitrarie. Un altro metodo suggerito utilizza ANI e Genome Alignment Score (AF) per esaminare il raggruppamento di punti dati di tutti i tipi e ceppi non tipo di generi esistenti. L'autore raccomanda di combinare il confine del genere con il punto di flesso del genere stimato specifico per i taxa analizzati. Tuttavia, se non sono disponibili sequenze genomiche complete sufficienti degli isolati Thalassolituus, è impossibile determinare con questo metodo se ASxL5T appartiene al genere Thalassolituus. A causa della disponibilità limitata di sequenze genomiche complete per l'analisi, l'intero albero filogenetico del genoma deve essere interpretato con cautela. In secondo luogo, i metodi di confronto dell’intero genoma non possono tenere conto delle differenze sostanziali nella dimensione dei genomi confrontati. Hanno misurato la somiglianza dei geni core conservati a copia singola tra generi correlati, ma non hanno tenuto conto del gran numero di geni che non sono presenti nel genoma molto più piccolo di ASxL5T. Ovviamente, ASxL5T e gruppi tra cui Thalassolituus, Oceanobacter e Bacterioplanes hanno un antenato comune, ma l'evoluzione ha preso un percorso diverso, portando a una riduzione del genoma, che potrebbe essere un adattamento a uno stile di vita predatorio. Ciò è in contrasto con T. oleivorans MIL-1T, che è più grande del 28% e si è evoluto sotto diverse pressioni ambientali per utilizzare idrocarburi23,30. Un confronto interessante può essere fatto con i parassiti intracellulari obbligati e i simbionti, come Rickettsia, Chlamydia e Buchnera. La dimensione del loro genoma è di circa 1 Mb. La capacità di utilizzare i metaboliti della cellula ospite porta alla perdita di geni, quindi ha subito una significativa degradazione genomica evolutiva. I cambiamenti evolutivi dagli organismi chimici marini nutrienti agli stili di vita predatori possono comportare una riduzione simile delle dimensioni del genoma. L'analisi COG e KEGG evidenzia il numero di geni utilizzati per funzioni specifiche e le differenze globali nei percorsi genomici tra ASxL5T e T. oleivorans MIL-1T, che non sono dovute alla diffusa disponibilità di elementi genetici mobili. La differenza nel rapporto G + C dell'intero genoma di ASxL5T è del 56,1% e quello di T. oleivorans MIL-1T è del 46,6%, il che indica anche che è segregato.
L'esame del contenuto codificante del genoma ASxL5T fornisce approfondimenti funzionali sulle caratteristiche fenotipiche. La presenza di geni che codificano per le fimbrie di tipo IV (Tfp) è di particolare interesse perché promuovono il movimento cellulare, chiamato scivolamento sociale o convulsioni, senza flagelli sulla superficie. Secondo i rapporti, Tfp ha altre funzioni, tra cui la predazione, la patogenesi, la formazione di biofilm, l'assorbimento naturale del DNA, l'aggregazione e lo sviluppo automatico delle cellule38. Il genoma ASxL5T contiene 18 geni che codificano per la diguanilato ciclasi (un enzima che catalizza la conversione di 2 guanosina trifosfato in guanosina 2 fosfato e diGMP ciclico) e 6 geni che codificano per il corrispondente diguanilato ciclasi fosfato diguanilato. Il gene per l'esterasi (che catalizza la degradazione del di-GMP ciclico in guanosina monofosfato) è interessante perché il ciclo-di-GMP è un importante secondo messaggero coinvolto nello sviluppo e nella separazione del biofilm, nel movimento, nell'attaccamento cellulare e nella virulenza 39, 40 nel processo. Va inoltre notato che nel Bdellovibrio bacteriovorus è stato dimostrato che il doppio GMP ciclico controlla la transizione tra la vita libera e lo stile di vita predatorio41.
La maggior parte delle ricerche sui batteri predatori si è concentrata su Bdellovibrio, organismi simili a Bdellovibrio e specie Myxococcus. Questi e altri esempi noti di batteri predatori formano un gruppo eterogeneo. Nonostante questa diversità, è stata identificata una serie di famiglie proteiche caratteristiche che riflettono i fenotipi di 11 batteri predatori conosciuti3,22. Tuttavia, sono stati identificati solo i geni che codificano per l'antigene O ligasi (waaL), che è particolarmente comune nei batteri Gram-negativi. Questa forma di analisi non è utile per designare ASxL5T come predatore, probabilmente perché utilizza una nuova strategia di attacco. La disponibilità di genomi batterici predatori più diversificati aiuterà a sviluppare analisi di risoluzione più precise che tengano conto delle prove delle differenze funzionali e ambientali tra i membri del gruppo. Esempi di batteri predatori non inclusi in questa analisi includono membri di Cupriavidus necator42 e Bradymonabacteria43, perché man mano che i ricercatori studiano diverse comunità microbiche, vengono stabiliti più taxa predatori.
La caratteristica più notevole dei batteri ASxL5T catturati dall'immagine TEM è la sua morfologia unica e flessibile, che può favorire l'interazione con i batteri preda. Il tipo di interazione osservata è diversa da quella di altri batteri predatori e non è stata scoperta o segnalata in precedenza. Il ciclo di vita predatorio ASxL5T proposto è mostrato nella Figura 5. Ci sono pochi esempi in letteratura con strutture apicali simili come riportiamo qui, ma questi esempi includono Terasakiispira papahanaumokuakeensis, un batterio spirillum marino con occasionale allargamento dell'apice 44, e Alphaproteobacteria, Terasakiella pusilla , già appartenente al genere Oceanospirillum, che presenta il cosiddetto "film polare" 45. Forme di cocci sono spesso osservati nelle colture più vecchie, soprattutto per i batteri con forme curve, come Vibrio, Campylobacter e Helicobacter 46, 47, 48, che possono rappresentare uno stato degradato. È necessario ulteriore lavoro per chiarire l’esatto ciclo di vita dei batteri ASxL5T. Determinare come cattura e preda e se il suo genoma codifica composti biologicamente attivi che possono essere utilizzati per scopi medici o biotecnologici.
Descrizione di Venatorbacter gen. Novembre Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. è composto da venatori da L. n. venator,'cacciatore' e Gr. n. bacter,'una verga'. Venatorbacter,'una canna da caccia' Le cellule sono aerobiche, tolleranti al sale, negative alla colorazione di Gram, l'attività della catalasi e dell'ossidasi non si accumula nell'intervallo di temperatura compreso tra 4 e 42 °C L'intervallo di pH compreso tra 4 e 9 è insolito. Nelle lumache marine, la maggior parte è intollerante al pH acido. I principali acidi grassi sono C16:1ω6c e/o C16:1ω7c, C16:0 e C18:1ω9 ; I C10:0 3-OH si trovano come idrossiacidi grassi. Non crescono nei terreni di brodo. Il contenuto di DNA G + C è 56,1 mol% I membri di questo genere mostrano resistenza al Campylobacter e il comportamento di predazione dei membri della famiglia delle Enterobacteriaceae. La posizione filogenetica di questo genere è nella famiglia.
Descrizione di Venatorbacter cucullus sp. Novembre Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus significa carenatura).
Inoltre, la caratteristica descrittiva di questo genere è che quando coltivate su BA o BHI, le cellule sono lunghe 1,63 µm e larghe 0,37 µm. Le colonie sull'agar BHI sono molto piccole e raggiungono i 2 mm di diametro dopo 72 ore. Sono beige, traslucidi, rotondi, convessi e lucenti. I membri di questa specie possono utilizzare Escherichia coli e Klebsiella. Campylobacter e molti altri batteri Gram-negativi fungono da prede.
Il ceppo tipico ASxL5T è stato isolato dal latte di manzo nel Nottinghamshire, Regno Unito, e depositato nella National Type Culture Collection (Regno Unito): numero di accesso NCTC 14397 e numero di accesso nella Netherlands Bacterial Culture Collection (NCCB) NCCB 100775. La sequenza completa del genoma di ASxL5T è stato depositato in Genbank secondo l'aggiunta di CP046056.
I batteri ASxL5T sono stati isolati dal latte bovino utilizzando la tecnologia di isolamento dei fagi9,49. L'impasto liquido è stato diluito 1:9 (p/v) in tampone SM (Tris-HCl 50 mM [pH 7,5], NaCl 0,1 M, MgSO4.7H2O 8 mM e gelatina 0,01%; Sigma Aldrich, Gillingham, Regno Unito), quindi incubare a 4°C per 24 ore, ruotando lentamente per eluire i predatori nel tampone. La sospensione è stata centrifugata a 3000 g per 3 minuti. Il surnatante è stato raccolto e centrifugato a 13.000 g per la seconda volta per 5 minuti. Il surnatante è stato quindi fatto passare attraverso un filtro a membrana da 0,45 µm (Minisart; Sartorius, Gottingen, Germania) e un filtro a membrana da 0,2 µm (Minisart) per rimuovere eventuali cellule batteriche rimanenti. ASxL5T può superare questi filtri. Un soffice prato di agar di Campylobacter enterosus S12 (numero di accesso NCBI CP040464) dallo stesso liquame è stato preparato utilizzando tecniche standard. L'impasto liquido filtrato è stato distribuito su ciascuna di queste piastre di cellule ospiti in goccioline da 10 pi in triplice copia e lasciato asciugare. La piastra è stata incubata in una vasca microaerofila a 37°C per 48 ore in condizioni microaerobiche (5% O2, 5% H2, 10% CO2 e 80% N2). La placca visibile ottenuta è stata estratta nel tampone SM e trasferita sul prato fresco di C. hyointestinalis S12 per propagare ulteriormente gli organismi lisati. Una volta stabilito che i batteri sono la causa della placca litica e non il fago, provare a far crescere l'organismo indipendentemente dall'ospite e caratterizzarlo ulteriormente. La coltura aerobica è stata eseguita a 37 °C con sangue di cavallo defibrinato al 5% v/v (TCS Biosciences Lt, Buckingham, UK, supplemento). Secondo le linee guida del National Clinical Standards Committee, il metodo di diffusione del disco viene utilizzato per i test di sensibilità antibatterica. L'agar BHI è stato coltivato a 37 °C utilizzando un disco contenente i seguenti antibiotici (Oxoid) per coltura aerobica: amoxicillina e acido clavulanico 30 µg; cefotaxima 30 µg; streptomicina 10 µg; ciprofloxacina 5 µg; Ceftazidima 30 µg Acido nalidixico 30 µg; Imipenem 10 µg; Azitromicina 15 µg; Cloramfenicolo 30 µg; Cefoxitina 30 µg; Tetraciclina 30 µg; Nitrofurantoina 300 µg; Aztreonam 30 µg; Ampicillina 10 µg; Cefpodoxima 10 µg; Trimetoprim-Sulfametossazolo 25 µg. La tolleranza al sale è stata stabilita mediante incubazione aerobica su piastre di agar BHI a 37°C. Ulteriore NaCl è stato aggiunto alle piastre di agar BHI per fornire un intervallo di concentrazione fino al 10% p/v. L'intervallo di pH è determinato mediante coltura aerobica su piastre di agar BHI a 37°C, dove l'intervallo di pH è stato regolato tra 4 e 9 con HCl sterile o NaOH sterile, e il valore di pH target viene verificato prima di versare la piastra. Per l'analisi degli acidi grassi cellulari, ASxL5T è stato coltivato su agar BHI per 3 giorni e aerobico a 37 °C. Secondo il protocollo standard MIDI (Sherlock Microbial Identification System, versione 6.10) di FERA Science Ltd, (York, Regno Unito), gli acidi grassi cellulari sono stati estratti, preparati e analizzati.
Per TEM, ASxL5T è stato coltivato in aerobiosi distribuendolo uniformemente su BA a 37°C per 24 ore, quindi raccolto in 1 ml di glutaraldeide al 3% (v/v) in tampone cacodilato 0,1 M a temperatura ambiente Fissare per 1 ora, quindi centrifugare a 10.000 g per 3 minuti. Quindi risospendere delicatamente il pellet in 600 μl di tampone cacodilato 0,1 M. Trasferire la sospensione ASxL5T fissa sulla pellicola Formvar/carbonio su una griglia di rame da 200 mesh. I batteri sono stati colorati con acetato di uranile allo 0,5% (p/v) per 1 minuto ed esaminati mediante TEM utilizzando un microscopio TEI Tecnai G2 12 Biotwin. Come accennato in precedenza, combinare lo stesso numero di prede e predatori nel brodo NZCYM (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) e incubare per 48 ore in condizioni microaerobiche di Campylobacter o Campylobacter a 37°C. L'interazione tra predatore e preda è stato esaminato anche dal TEM. Condizioni aerobiche per Escherichia coli. Esaminare in modo indipendente prede e batteri predatori per determinare eventuali cambiamenti nella morfologia cellulare dovuti alla predazione. Il metodo del nero del Sudan è stato utilizzato per la microscopia ottica dell'accumulo di PHB.
Coltivare le colture notturne ASxL5T spalmando la crescita su piastre BHI o BA con un tampone sterile. Raccogliere le cellule ASxL5T e sospenderle in MRD (CM0733, Oxoid), quindi posizionarle a 4°C per 7 giorni per far morire di fame le cellule. La coltura batterica di riferimento dell'NCTC o di laboratorio è stata inoculata nel brodo BHI o nel brodo nutriente n. 2 (CM007, Oxoid), incubata durante la notte, centrifugata a 13.000 g e risospesa in MRD fino a quando la OD600 era 0,4. Coltura: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, Klebsiella oxytoca 11466, Leuconostoc NCTC 10817, Listeria Specialbacter NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, Rhodococcus hamburger sottomarino NCTC 1621T, Salmonella batteri intestinali Mondeville NCTC 5747, mucillagini NCTC 10861, Staphylococcus aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. L'ospite Campylobacter è stato incubato microaerobicamente su piastre BA a 37°C e sospeso in brodo NZCYM. Gli ospiti Campylobacter testati sono: C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11458, C. lari NCTC 11458, C. jejuni PT14 , C... Raccogliere le cellule in MRD, centrifugare a 13.000 g e risospendere in MRD fino a quando OD600 è 0,4. Aggiungere un'aliquota di 0,5 ml di sospensione a 5 ml di agar superiore NZCYM fuso (agar allo 0,6%) e versarlo su una piastra inferiore NZCYM all'1,2%. Dopo la polimerizzazione e l'essiccazione, l'ASxL5T diluito in serie è stato distribuito come goccioline da 20 µl su ciascuna tavola da prato in triplice copia. La temperatura e l'atmosfera della coltura dipendono dalle esigenze dei batteri di prova.
Utilizzare il kit GenElute™ Bacterial Genomic DNA (Sigma Aldridge) per preparare il DNA da isolati batterici. Sono stati utilizzati metodi standard per l'amplificazione PCR del gene 16S rRNA e la determinazione della sequenza del prodotto utilizzando la chimica della terminazione del colorante (Eurofins Value Read Service, Germania). Utilizzare il programma BLAST-N per confrontare queste sequenze con altre sequenze di geni rRNA 16S per identificare e raccogliere specie strettamente correlate. Questi sono allineati utilizzando ClustalW nel programma MEGA X. L'albero filogenetico è stato ricostruito utilizzando MEGA X utilizzando il metodo di massima verosimiglianza basato sul modello Tamura-Nei, con 1000 copie guidate54. Utilizzare il kit PureLink™ Genomic DNA (Fisher Scientific, Loughborough, Regno Unito) per estrarre il DNA per il sequenziamento dell'intero genoma. La sequenza del genoma di ASxL5T è stata determinata utilizzando la combinazione Illumina MiSeq, che consiste in letture a doppia estremità da 250 bp composte da una libreria preparata utilizzando il kit di etichettatura Nextera e letture lunghe da 2 a 20 kb dalla piattaforma PacBio. Centro di ricerca sul sequenziamento del DNA genomico presso l'Università di Sembia. Il genoma è stato assemblato utilizzando CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen, Aarhus, Danimarca). Le colture ASxL5T sono depositate nella National Type Culture Collection (Regno Unito) e nella Netherlands Bacterial Culture Collection (NCCB). I genomi di organismi correlati utilizzati per il confronto sono: Thalassolituus oleivorans MIL-1T (numero di accesso HF680312, completo); Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (numero di accesso BMYY01000001, incompleto); Oceanobacter kriegii DSM 6294T (numero di accesso NZ_AUGV00000000, incompleto); Comunità Marinamonas DSM 5604T (aggiunto ASM436330v1, incompleto), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (aggiunto MTSD02000001, incompleto) e Thalassolituus sp. C2-1 (aggiungere NZ_VNIL01000001, incompleto). Utilizzare JGI Genome Portal36 all'indirizzo https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page= per determinare il punteggio di allineamento (AF) e l'identità media dell'acido nucleico (ANI). A coppie. Il metodo di Rodriguez-R & Konstantinidis55 è stato utilizzato per determinare l'identità degli amminoacidi (AAI). Utilizzare GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 per generare un albero filogenetico di massima verosimiglianza stimato. Il genoma di input che rappresenta il genoma di riferimento disponibile è selezionato dai generi di riferimento identificati come correlati ad ASxL5T dalla filogenesi dell'rRNA 16S. Annotato l'albero utilizzando lo strumento online interattivo dell'albero della vita (https://itol.embl.de/). L'annotazione funzionale e l'analisi del genoma ASxL5T vengono eseguite utilizzando lo strumento online BlastKOALA KEGG utilizzando la distribuzione di arricchimento del modulo KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). La distribuzione delle categorie COG (gruppi ortologici) viene determinata utilizzando lo strumento online EggNOG-mapper.
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