新しいタイプのグラム陰性、好気性、耐塩性、活性、桿状、捕食性細菌 ASxL5T が、英国ノッティンガムシャーの牛糞池から分離され、カンピロバクターを餌として使用されました。その後、他のカンピロバクター種や腸内細菌科のメンバーが獲物として発見されました。宿主細胞を使用せずに継代培養した後、ブレインハートインフュージョン寒天培地上で弱い無菌増殖が達成されました。最適な生育条件は 37 °C、pH 7 です。透過型電子顕微鏡により、獲物の入手可能性に関連する非常に珍しい形態学的特徴がいくつか明らかになりました。 16S rRNA 遺伝子配列を使用した系統解析により、この分離株は海洋性スピルリナ科のメンバーに関連しているが、既知の属のメンバーとして明確に分類できないことが示されました。 ASxL5T の全ゲノム配列決定により、海洋スピロヘータのメンバーとの関係が確認されました。データベース検索により、いくつかの ASxL5T が、海洋、地表、地下水のいくつかの未培養細菌と 16S rRNA 遺伝子配列を共有していることが明らかになりました。 ASxL5T 株は新属の新種であると考えられます。 Venatorbacter cucullus gen という名前をお勧めします。 11月、sp. 11月にはASxL5Tを基準株として使用した。
捕食性細菌は、生合成物質とエネルギーを得るために他の生きた細菌を追い詰めて殺す能力を示す細菌です。これは、死んだ微生物からの一般的な栄養素の回収とは異なります。また、細菌が宿主を殺さずに宿主と密接な関係を築く寄生相互作用とも異なります。捕食性バクテリアは、それらが生息するニッチ（海洋生息地など）で豊富な食物源を利用するために、さまざまなライフサイクルを進化させてきました。これらは分類学的に多様なグループであり、それらは独自の滅菌ライフサイクルによってのみ結びついています1。捕食性細菌の例は、プロテオバクテリア、バクテロイデス属、クロレラなど、いくつかの異なる門で見つかっています。しかし、最もよく研​​究されている捕食性細菌は、Bdellovibrio および Bdellovibrio および類似生物 (BALOs4) です。捕食性細菌は、新しい生物学的に活性な化合物や抗菌剤の有望な供給源です5。
捕食性細菌は微生物の多様性を高め、生態系の健全性、生産性、安定性にプラスの影響を与えると考えられています6。これらの肯定的な特性にもかかわらず、細菌の培養が難しく、複雑な生活環を理解するには細胞相互作用を注意深く観察する必要があるため、新しい捕食性細菌に関する研究はほとんどありません。この情報はコンピューター分析から取得するのは簡単ではありません。
抗菌薬耐性が増大する時代において、バクテリオファージや捕食性細菌の使用など、細菌性病原体を標的とする新しい戦略が研究されています7,8。 ASxL5T 細菌は、2019 年にノッティンガムシャー州ノッティンガム大学の酪農センターから収集された牛糞からファージ分離技術を使用して分離されました。調査の目的は、生物学的防除剤としての可能性を持つ生物を分離することです。 Campylobacter hyointestinalis は人獣共通感染症の病原体であり、ヒトの腸疾患との関連性がますます高まっています10。これは血清中に遍在しており、標的宿主として使用されます。
ASxL5T 細菌は、C. hyointestinalis の芝生上に形成されるプラークがバクテリオファージによって生成されるものと類似していることが観察されたため、ビーフゼリーから分離されました。ファージ単離プロセスの一部には、細菌細胞を除去するように設計された 0.2 μm フィルターによる濾過が含まれるため、これは予想外の発見でした。プラークから抽出された物質の顕微鏡検査により、小さなグラム陰性の湾曲した棒状細菌がポリヒドロキシ酪酸（PHB）を蓄積していないことが明らかになった。プレイ細胞に依存しない無菌培養は、濃厚な固体培地（ブレインハートインフュージョン寒天（BHI）や血液寒天（BA）など）上で実現され、増殖は弱いです。それは、多量の接種源を用いた継代培養後に得られます。微好気性 (7% v/v 酸素) 条件下でも大気酸素条件下でも同様によく生育しますが、嫌気性雰囲気では生育しません。 72 時間後、コロニーの直径は非常に小さく、2 mm に達し、ベージュ色、半透明、丸く、凸状で、光沢がありました。 ASxL5T は液体培地で確実に培養できないため、標準的な生化学検査が妨げられています。このことは、ASxL5T がバイオフィルム形成の複雑なライフサイクルに依存している可能性があることを示唆しています。しかし、プレート懸濁液は、ASxL5T が好気性であり、オキシダーゼおよびカタラーゼに対して陽性であり、5% NaCl に耐えることができることを示しました。 ASxL5T は 10 µg のストレプトマイシンに対して耐性がありますが、試験された他のすべての抗生物質に対しては感受性があります。 ASxL5T 細菌細胞を TEM で検査しました (図 1)。 BA 上でプレイ細胞なしで増殖させた場合、ASxL5T 細胞は小さなカンピロバクターであり、平均長さ 1.63 μm (± 0.4)、幅 0.37 μm (± 0.08)、および単一の長い (最大 5 μm) 極を持ちます。性的鞭毛。細胞の約 1.6% は 0.2 μm 未満の幅を持っているようで、フィルター装置を通過できます。フェアリング (ラテン ククルス) に似た、いくつかのセルの上部に異常な構造の拡張が観察されました (1D、E、G の矢印を参照)。これは過剰な外膜で構成されているように見えますが、これはペリプラズムエンベロープのサイズが急速に減少したためである可能性がありますが、外膜は無傷のままであり、「緩んだ」外観を示しています。 ASxL5T を栄養素の非存在下 (PBS 中で) 4°C で長期間培養すると、ほとんど (すべてではない) の細胞が球菌の形態を示しました (図 1C)。 ASxL5T がカンピロバクター ジェジュニを餌として 48 時間増殖すると、平均細胞サイズは宿主なしで増殖した細胞よりも大幅に長く、狭くなります (表 1 および図 1E)。対照的に、ASxL5T が大腸菌を餌として 48 時間増殖させた場合、平均細胞サイズは餌なしで増殖した場合よりも長く幅が広くなり (表 1)、細胞の長さは変化し、通常は糸状を示します (図 1F)。カンピロバクター ジェジュニまたは大腸菌を餌として 48 時間インキュベートした場合、ASxL5T 細胞は鞭毛をまったく示さなかった。表 1 は、ASxL5T の存在、不在、および餌の種類に基づく細胞サイズの変化の観察をまとめたものです。
ASx5LT の TEM 表示: (A) ASx5LT は長いホイップを示します。 (B) 一般的な ASx5LT バッテリー。 (C) 栄養素なしで長時間インキュベートした後の球菌 ASx5LT 細胞。 (D) ASx5LT 細胞のグループは異常を示します (E) カンピロバクターの獲物とインキュベートされた ASx5LT 細胞グループは、獲物が成長していないものと比較して細胞長の増加を示しました (D) 頂端構造も示しました。 (F) 餌となる大腸菌とインキュベートした後の大きな糸状鞭毛、ASx5LT 細胞。 (G) 大腸菌とインキュベートした後の単一の ASx5LT 細胞。異常な上部構造を示します。バーは 1 μm を表します。
16S rRNA 遺伝子配列 (アクセッション番号 MT636545.1) を決定すると、データベース検索でガンマプロテオバクテリア綱の配列に類似した配列を確立することができます。この細菌は海洋スピリラム科の海洋細菌に最も近く (図 2)、Thalassolitus 属のメンバーです。海洋性桿菌に最も近い親戚です。 16S rRNA 遺伝子配列は、Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria) 科に属する捕食性細菌とは明らかに異なります。 B. バクテリオヴォルス HD100T (標準株、DSM 50701) と B. バクテリオヴォルス DM11A のペアワイズ比較は 48.4% と 47.7% であり、B. exovorus JSS については 46.7% でした。 ASxL5T 細菌は 16S rRNA 遺伝子のコピーを 3 つ持ち、そのうち 2 つは互いに同一で、3 つ目は 3 塩基離れています。同じ場所からの同様の形態学的特徴と表現型特徴を持つ他の 2 つの捕食性細菌分離株 (ASx5S および ASx5O、16S rRNA 遺伝子アクセッション番号はそれぞれ MT636546.1 および MT636547.1) は同じではありませんが、ASxL5T および未培養細菌とは異なります。データベースの配列は、オセアノスピリラ科の他の属と一緒にクラスター化されています (図2)。 ASxL5T の全ゲノム配列は決定され、NCBI データベースに保存されており、アクセッション番号は CP046056 です。 ASxL5T のゲノムは、G + C 比 56.1% の 2,831,152 bp の環状染色体で構成されています。ゲノム配列には 2653 個の CDS (合計) が含まれており、そのうち 2567 個がタンパク質をコードすると予測され、そのうち 1596 個 (60.2%) が推定機能として割り当てられます。ゲノムには、9 つ​​の rRNA (5S、16S、23S にそれぞれ 3 つ) と 57 の tRNA を含む 67 の RNA コード遺伝子が含まれています。 ASxL5T のゲノム特性を、16S rRNA 遺伝子配列から同定された最も近い相対型の株の入手可能なゲノムと比較しました (表 2)。アミノ酸同一性 (AAI) を使用して、利用可能なすべての Thalassolituus ゲノムを ASxL5T と比較します。 AAI によって決定された最も近い利用可能な (不完全な) ゲノム配列は、Thalassolitus sp. です。 C2-1 (NZ_VNIL01000001 を追加)。この株はマリアナ海溝の深海堆積物から分離されましたが、現時点では比較のためのこの株に関する表現型情報はありません。 ASxL5T の 2.82 Mb と比較して、この生物のゲノムは 4.36 Mb と大きくなります。海洋スピロヘータの平均ゲノム サイズは約 4.16 Mb (± 1.1; n = 92 の完全な参照ゲノムを https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly から調査) であるため、ASxL5T のゲノムは他のメンバーと比べるとかなり小さいですね。 GToTree 1.5.54 を使用して、ガンマプロテオバクテリア 11、12、13、14、15、16、 17、18。分析の結果、Thalassolitus、Bacterial Plane、および海洋細菌と密接に関連していることが示されました。しかし、これらのデータは、ASxL5T が海洋性スピルリナの近縁種とは異なることを示しており、そのゲノム配列データは入手可能です。
16S rRNA 遺伝子配列を使用した系統樹は、海洋スピルリナ科の未培養および海洋細菌株に対する ASxL5T、ASxO5、および ASxS5 株 (腸付き) の位置を強調表示します。 Genbank アクセッション番号は菌株名の後に括弧内に記載されています。 ClustalW を使用して配列をアライメントし、最尤法と田村-Nei モデルを使用して系統関係を推測し、MEGA X プログラムで 1000 回のガイド付きレプリケーションを実行します。枝の数字は、ガイド付きコピーの値が 50% を超えていることを示します。大腸菌 U/541T をアウトグループとして使用しました。
(A) ゲノムに基づく系統樹。海洋スピロスピラ科細菌 ASxL5T とその近縁種である大腸菌 U 5/41T をアウトグループとして示します。 (B) T. oleivorans MIL-1T と比較して、ASx5LT タンパク質のオルソロガス グループ (COG) クラスターに基づいて遺伝子の機能カテゴリー分布が予測されます。左の図は、各ゲノム内の各機能 COG カテゴリにある遺伝子の数を示しています。右側のグラフは、各機能的 COG グループに含まれるゲノムの割合を示しています。 (C) T. oleiverans MIL-1T と比較した、ASxL5T の完全な KEGG (京都遺伝子およびゲノム百科事典) モジュラー経路の分析。
KEGG データベースを使用して ASxL5T ゲノムに存在する構成遺伝子を調べると、好気性ガンマ プロテウスの典型的な代謝経路が明らかになりました。 ASxL5T には、走化性、鞭毛集合、IV 型線毛システムに関与する遺伝子など、細菌のモータータンパク質に割り当てられた合計 75 個の遺伝子が含まれています。最後のカテゴリーでは、10 個の遺伝子のうち 9 個が他のさまざまな生物のけいれん的な動きに関与しています。 ASxL5T のゲノムには、好塩菌で予想されるように、浸透圧ストレスに対する保護反応に関与する完全なテトラヒドロピリミジン生合成経路が含まれています 20。ゲノムには、リボフラビン合成経路を含む補因子やビタミンの完全な経路も多数含まれています。 ASxL5T にはアルカン 1-モノオキシゲナーゼ (alkB2) 遺伝子が存在しますが、炭化水素利用経路は完全ではありません。 ASxL5T のゲノム配列には、T. oleiverans MIL-1T21 の炭化水素の分解に主に関与すると同定されている遺伝子の相同体 (TOL_2658 (alkB) や TOL_2772 (アルコール脱水素酵素) など) が明らかに存在しません。図 3B は、ASxL5T とオリーブオイル MIL-1T の間の COG カテゴリにおける遺伝子分布の比較を示しています。全体として、より小さな ASxL5T ゲノムには、より大きな関連ゲノムと比較して、各 COG カテゴリから含まれる遺伝子の数が比例して少なくなります。各機能カテゴリーの遺伝子数をゲノムのパーセンテージとして表すと、より大きな ASxL5T を構成する、翻訳、リボソーム構造、生合成カテゴリー、およびエネルギー生産と変換機能カテゴリーの遺伝子のパーセンテージに違いが見られます。ゲノム このパーセンテージは、T. oleiverans MIL-1T ゲノムに存在する同じグループと比較されます。対照的に、ASxL5T ゲノムと比較して、T. oleivorans MIL-1T は、複製、組換えと修復、および転写のカテゴリーに属する遺伝子の割合が高くなります。興味深いことに、2 つのゲノムの各機能カテゴリーの内容における最大の違いは、ASxL5T に存在する未知の遺伝子の数です (図 3B)。 KEGG モジュールの濃縮分析が実行されました。各 KEGG モジュールは、ゲノム配列データのアノテーションおよび生物学的解釈のために手動で定義された一連の機能単位を表します。 ASxL5T とオリーブ MIL-1T の完全な KOG モジュール経路における遺伝子分布の比較を図 3C に示します。この分析は、ASxL5T には完全な硫黄および窒素代謝経路があるが、T. oleiverans MIL-1T にはそれがないことが示されています。対照的に、T. oleiverans MIL-1T は完全なシステインおよびメチオニン代謝経路を持っていますが、ASxL5T では不完全です。したがって、ASxL5T は、硫酸同化のための特徴的なモジュール (代謝能力や病原性などの表現型マーカーとして使用できる遺伝子のセットとして定義; https://www.genome.jp/kegg/module.html) を T に持っています。 .オレイブランMIL-1T。 ASxL5T の遺伝子内容を略奪的なライフスタイルを示唆する遺伝子のリストと比較しても決定的ではありません。 O 抗原多糖とコアに結合するリガーゼをコードする waaL 遺伝子は ASxL5T ゲノムに存在しますが (ただし、多くのグラム陰性菌では一般的です)、トリプトファン 2,3-ジオキシゲナーゼ (TDO) 遺伝子には 60 アミノ酸が含まれる可能性があります。捕食性細菌には一般的に見られる酸性領域は存在しません。 ASxL5T ゲノムには、メバロン酸経路のイソプレノイド生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を含め、他の捕食性の特徴的な遺伝子は存在しません。調べた捕食者グループには転写調節遺伝子 gntR はありませんが、ASxL5T では 3 つの gntR 様遺伝子が同定できることに注意してください。
ASxL5T の表現型の特徴を表 3 にまとめ、文献で報告されている関連属 23、24、25、26、および 27 の表現型の特徴と比較します。 T. marinus、T. olevorans、B. sanyensis、および Oceanobacter kriegii からの分離株は、活性で耐塩性​​のオキシダーゼ陽性の棒状体ですが、ASxL5T のその他の表現型の特徴はほとんどありません。海洋の平均 pH は 8.1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77) で、これは T. marinus、T. olevorans、B. sanyensis、O. に反映されています。クリーギィ。 ASxL5T は、非海洋種に特有のより広い pH 範囲 (4 ～ 9) に適しています。 Thalassolituus sp.の表現型の特徴C2-1.未知。 ASxL5T の生育温度範囲は一般に海洋株の生育温度範囲 (4 ～ 42 °C) より広いですが、すべてではありませんが一部の T. marinus 分離株は耐熱性です。 ASxL5T はブロス培地で増殖できないため、表現型のさらなる特徴付けが妨げられました。 API 20E を使用して、BA プレートから掻き取った材料、ONPG、アルギニン ジヒドロラーゼ、リジン デカルボキシラーゼ、オルニチン デカルボキシラーゼ、クエン酸利用、ウレアーゼ、トリプトファン デアミナーゼ、ゼラチン加水分解酵素をテストします。テスト結果はすべて陰性でしたが、インドール、アセトイン、H2S は検出されませんでした。生産されました。未発酵炭水化物には、グルコース、マンノース、イノシトール、ソルビトール、ラムノース、スクロース、メリビオース、アミグダリン、アラビノースが含まれます。公開されている関連参照株と比較した、ASxL5T 株の細胞脂肪酸プロファイルを表 4 に示します。主な細胞脂肪酸は、C16:1ω6c および/または C16:1ω7c、C16:0 および C18:1ω9 です。ヒドロキシ脂肪酸 C12:0 3-OH および C10:0 3-OH も存在します。 ASxL5T における C16:0 の比率は、関連する属の報告値よりも高くなります。対照的に、報告されている T. marinus IMCC1826TT と比較して、ASxL5T における C18:1ω7c および/または C18:1ω6c の比率は減少しています。 oleivorans MIL-1T および O. kriegii DSM 6294T では検出されましたが、B. sanyensis KCTC 32220T では検出されませんでした。 ASxL5T と ASxLS の脂肪酸プロファイルを比較すると、2 つの株の間で個々の脂肪酸の量に微妙な違いがあることが明らかになり、これは同じ種のゲノム DNA 配列と一致しています。スーダン ブラック テストでは、ポリ-3-ヒドロキシ酪酸 (PHB) 粒子は検出されませんでした。
ASxL5T 細菌の捕食活動を研究して、獲物の範囲を決定しました。この細菌は、カンピロバクター スイス 11608T、カンピロバクター ジェジュニ PT14、カンピロバクター ジェジュニ 12662、カンピロバクター ジェジュニ NCTC 11168T などのカンピロバクター種にプラークを形成する可能性があります。大腸菌NCTC 12667; C.helveticus NCTC 12472; C. lari NCTC 11458 および C. upsaliensis NCTC 11541T。より広範囲のグラム陰性菌およびグラム陽性菌をテストするには、メソッドの宿主範囲決定セクションに記載されている培養物を使用します。結果は、ASxL5T が Escherichia coli NCTC 86 および Citrobacter freundii NCTC 9750T でも使用できることを示しています。 Klebsiella oxytoca 11466 上に形成されたプラーク。大腸菌 NCTC 86 との TEM 相互作用を図 4A ～ D に示し、カンピロバクター ジェジュニ PT14 およびカンピロバクター スイス S12 との相互作用を図 4E ～ H 中央に示します。攻撃メカニズムは、テストした餌の種類によって異なるようで、1 つまたは複数の大腸菌細胞が各 ASxL5T 細胞に付着し、吸着前に伸びた細胞に沿って横方向に配置されます。対照的に、ASxL5T は、通常は捕食者細胞の頂点と接触し、カンピロバクター細胞の頂点近くにある単一の接触点を介してカンピロバクターに結合すると考えられます (図 4H)。
ASx5LT と獲物の間の相互作用を示す TEM: (AD) と大腸菌獲物。 (EH) と C. jejuni が捕食します。 (A) 単一の大腸菌 (EC) セルに接続された典型的な ASx5LT セル。 (B) 単一の EC 細胞に付着した糸状 ASx5LT。 (C) 複数の EC セルに接続された糸状 ASx5LT セル。 (D) 単一の大腸菌 (EC) 細胞上の小さな ASx5LT 細胞の付着。 (E) カンピロバクター ジェジュニ (CJ) 細胞に接続された単一の ASx5LT 細胞。 (F) ASx5LT は C. hyointestinalis (CH) 細胞を攻撃します。 (G) 2 つの ASx5LT セルが CJ セルを攻撃しました。 (H) CJ セルの頂点付近の ASx5LT 接続点の拡大図 (バー 0.2 μm)。バーは (A ～ G) で 1 μm を表します。
捕食性細菌は、豊富な獲物源を利用するために進化してきました。明らかに、それらはさまざまな環境に広く存在します。集団メンバーのサイズが狭いため、ファージ分離法を使用してスラリーから ASxL5T 細菌を分離することが可能です。 ASxL5T と海洋細菌のオセアノスピリラ科のメンバーとのゲノム関連性は驚くべきものですが、この生物は耐塩性があり、5% の塩を含む培地でも生育できます。スラリーの水質分析により、塩化ナトリウム含有量が 0.1% 未満であることが示されました。したがって、泥は地理的にも化学的にも海洋環境から遠く離れています。同じ起源からの 3 つの関連する異なる分離株の存在は、これらの捕食者がこの非海洋環境で繁栄しているという証拠を提供します。さらに、マイクロバイオーム分析 (データ ファイルは https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990 から入手可能) により、同じ 16S rRNA 遺伝子配列が最も豊富な運用分類群の上位 50 に位置することが示されました (OTU) ) 数回の泥のサンプリング間隔で。 ASxL5T 細菌と類似した 16S rRNA 遺伝子配列を持つ、いくつかの未培養細菌が Genbank データベースで見つかりました。これらの配列は、ASxL5T、ASxS5、および ASxO5 の配列とともに、Thalassolitus および Oceanobacter から分離された異なるクレードを表すと考えられます (図 2)。 2009年に南アフリカの金鉱山の深さ1.3キロメートルの亀裂水から3種類の未培養細菌（GQ921362、GQ921357、GQ921396）が分離され、他の2種類（DQ256320とDQ337006）は地下水（同じく南アフリカ）から分離された。 2005年）。 ASxL5T に最も密接に関連する 16S rRNA 遺伝子配列は、2006 年にフランス北部の海岸から得られた砂質堆積物の濃縮培養から得られた 16S rRNA 遺伝子配列の一部です (アクセッション番号 AM29240828)。未培養細菌 HQ183822.1 に由来するもう 1 つの密接に関連した 16S rRNA 遺伝子配列が、中国の都市埋立地から浸出した収集タンクから得られました。明らかに、ASxL5T 細菌は分類データベースではあまり代表的ではありませんが、非培養細菌からのこれらの配列は、通常は困難な環境で世界中に分布する ASxL5T に類似した生物を表す可能性があります。全ゲノム系統解析から、ASxL5T に最も近いのは Thalassolituus sp. です。 C2-1、T. marinus、T. oleivorans。そして O. kriegii 23、24、25、26、27。Thalassolitus は海洋偏性炭化水素断片化細菌 (OHCB) のメンバーであり、海洋および陸上環境に広く分布しており、通常、炭化水素汚染事件の後に優勢になります 30,31。海洋細菌は OHCB グループのメンバーではありませんが、海洋環境から隔離されています。
表現型データは、ASxL5T が新種であり、海洋スピロスピラ科のこれまで認識されていなかった属のメンバーであることを示しています。現在、新たに分離された菌株を新しい属に分類するための明確な基準はありません。普遍的な属の境界を決定する試みがなされており、例えば、保存的タンパク質 (POCP) のゲノムのパーセンテージに基づいて、カットオフ値が参照株と 50% 同一であることが推奨されています 33。不完全なゲノムから取得できるため、POCP よりも利点がある AAI 値の使用を提案する人もいます 34。著者は、モデル種のモデル株と比較して AAI 値が 74% 未満の場合、その株は別の属の代表であると考えています。海洋性スピリラム科のモデル属は海洋性スピリラムであり、モデル株はO. linum ATCC 11336Tである。 ASxL5T と O. linum ATCC 11336T の間の AAI 値は 54.34%、ASxL5T と T. oleivorans MIL-1T (属タイプ株) の間の AAI 値は 67.61% であり、ASxL5T が Thalassolituus とは異なる新しい属を表すことを示しています。 16S rRNA 遺伝子配列を分類標準として使用すると、提案される属境界境界は 94.5% です35。 ASxL5T は Thalassolituus 属に分類される可能性があり、T. oleivorans MIL-1T と 95.03%、96.17% の 16S rRNA 配列同一性を示します。マリナスIMCC1826T。ただし、B. sanyensis NV9 と 94.64% の 16S rRNA 遺伝子同一性を持つバクテロイデス属にも分類され、16S rRNA 遺伝子などの単一遺伝子の使用が恣意的な分類と割り当てにつながる可能性があることを示しています。提案されているもう 1 つの方法は、ANI とゲノム アライメント スコア (AF) を使用して、既存の属のすべての型および非型株からのデータ ポイントのクラスタリングを検査します。著者は、属の境界と、分析対象の分類群に固有の推定属の変曲点を組み合わせることが推奨されています。ただし、Thalassolitus 分離株の完全なゲノム配列が十分にない場合、この方法では ASxL5T が Thalassolituus 属に属するかどうかを判断することはできません。分析に利用できる完全なゲノム配列は限られているため、ゲノム系統樹全体は注意して解釈する必要があります。第二に、全ゲノム比較法では、比較されるゲノムのサイズの実質的な違いを説明することができません。彼らは、関連属間の保存されたコア単一コピー遺伝子の類似性を測定しましたが、ASxL5T のはるかに小さいゲノムには存在しない多数の遺伝子は考慮していませんでした。明らかに、ASxL5T と、タラソリトゥス、オセアノバクター、バクテリオプレーンを含むグループには共通の祖先がありますが、進化は異なる道をたどっており、捕食的なライフスタイルに適応するためにゲノムの減少につながっていると考えられます。これは、28% 大きく、炭化水素を利用するためにさまざまな環境圧力下で進化した T. oleivorans MIL-1T とは対照的です。リケッチア、クラミジア、ブフネラなどの偏性細胞内寄生虫や共生生物との興味深い比較が可能です。それらのゲノムサイズは約 1 Mb です。宿主細胞の代謝産物を利用する能力は遺伝子の損失につながるため、進化上の重大なゲノム分解を受けます。海洋化学栄養生物から略奪的なライフスタイルへの進化的変化は、同様のゲノムサイズの減少をもたらす可能性があります。 COG および KEGG 解析は、特定の機能に使用される遺伝子の数と、ASxL5T と T. oleivorans MIL-1T の間のゲノム経路における全体的な違いを浮き彫りにします。これらの違いは、可動性の遺伝要素が広く利用可能になったことによるものではありません。 ASxL5T の全ゲノムの G+C 比の差は 56.1%、T. oleivorans MIL-1T のそれは 46.6% であり、これも分離されていることを示しています。
ASxL5T ゲノムのコード内容を調べると、表現型の特徴について機能的な洞察が得られます。 IV 線毛 (Tfp) をコードする遺伝子の存在は、表面に鞭毛を持たずに社会的滑走またはけいれんと呼ばれる細胞運動を促進するため、特に興味深いものです。報告によると、Tfp には、捕食、病原性、バイオフィルム形成、自然な DNA 取り込み、自動細胞凝集および発生などの他の機能もあります 38。 ASxL5T ゲノムには、ジグアニル酸シクラーゼ (2 グアノシン三リン酸からグアノシン 2 リン酸および環状ジGMP への変換を触媒する酵素) をコードする 18 個の遺伝子と、対応するジグアニル酸シクラーゼリン酸ジグアニル酸をコードする 6 個の遺伝子が含まれています。エステラーゼの遺伝子（環状ジGMPのグアノシン一リン酸への分解を触媒する）は興味深い。なぜなら、シクロジGMPはバイオフィルムの発生と分離、移動、細胞接着、そしてその過程における毒性に関与する重要なセカンドメッセンジャーであるからである39、40。また、Bdellovibrio bacteriovorus では、環状二重 GMP が自由な生活と略奪的な生活の間の移行を制御することが示されていることにも注目すべきです 41。
捕食性細菌に関するほとんどの研究は、ブデロビブリオ、ブデロビブリオ様生物、およびミクソコッカス種に焦点を当ててきました。これらおよび他の既知の捕食性細菌の例は、多様なグループを形成しています。この多様性にもかかわらず、11 の既知の捕食性細菌の表現型を反映する一連の特徴的なタンパク質ファミリーが同定されています 3,22。しかし、特にグラム陰性菌によく見られる O 抗原リガーゼ (waaL) をコードする遺伝子のみが同定されています。この形式の分析は、おそらく新しい攻撃戦略を使用しているため、ASxL5T を捕食者として指定するのには役に立ちません。より多様な捕食性細菌のゲノムが利用可能になれば、グループのメンバー間の機能的および環境的差異の証拠を考慮した、より詳細な解像度の分析を開発するのに役立ちます。研究者がさまざまな微生物群集を調査するにつれて、より多くの捕食性分類群が確立されるため、この分析に含まれていない捕食性細菌の例には、Cupriavidus necator 42 および Bradymonabacteria 43 のメンバーが含まれます。
TEM 画像で捉えた ASxL5T 細菌の最も注目すべき特徴は、餌となる細菌との相互作用を促進できる、その独特で柔軟な形態です。観察された相互作用の種類は他の捕食性細菌とは異なり、これまで発見または報告されていません。提案されている ASxL5T の捕食生活環を図 5 に示します。ここで報告するものと同様の頂端構造を持つ例は文献にほとんどありませんが、これらの例には、時折頂端が拡大する海洋性スピリラム属細菌である Terasakiispira papahanaumokuakeensis 44 や、Alphaproteobacteria である Terasakiella pusilla が含まれます。 、以前はオセアノスピリルム属に属しており、いわゆる「極性」を示します。球菌の形態は古い培養物でよく観察され、特にビブリオ、カンピロバクター、ヘリコバクターなどの湾曲した形態の細菌では、劣化した状態を示す可能性があります 46、47、48。 ASxL5T 細菌の正確な生活環を解明するには、さらなる研究が必要です。どのように捕獲して捕食するのか、またそのゲノムが医療やバイオテクノロジーの目的に使用できる生物学的に活性な化合物をコードしているかどうかを判断するため。
Venatorbacter 世代の説明。 11 月 Venatorbacter (Ven.a.tor、ba'c.ter、L. は、L. n. venator、「狩人」と Gr. n. bacter、「ロッド」の venators で構成されます。Venatorbacter、「狩猟用のロッド」細胞は好気性、耐塩性、湾曲グラム染色陰性、運動ロッド活性は 4 ～ 20 ℃の温度範囲では蓄積しません。 42 °C の内部成長。pH 範囲が 4 ～ 9 であるのは異常で、ほとんどのカタツムリは酸性 pH に耐性がありません。主な脂肪酸は C16:1ω6c、C16:1ω9、C18:1ω9 です。 :0 3-OH および C10:0 3-OH はヒドロキシ脂肪酸として検出され、ブロス培地では増殖しません。 DNA G + C 含量は 56.1 mol% であり、この属のメンバーはカンピロバクターに対する耐性を示し、腸内細菌科のメンバーの捕食行動はこの属の系統内にあります。
Venatorbacter cucullus sp. の説明11 月 Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus はフェアリングを意味します)。
さらに、この属の特徴は、BA または BHI 上で増殖させた場合、細胞の長さが 1.63 μm、幅が 0.37 μm になることです。 BHI 寒天培地上のコロニーは非常に小さく、72 時間後には直径 2 mm に達します。それらはベージュ色で、半透明で、丸く、凸状で、光沢があります。この種のメンバーは、大腸菌およびクレブシエラを使用できます。カンピロバクターや他のいくつかのグラム陰性菌が餌食となります。
典型的な菌株 ASxL5T は、英国ノッティンガムシャーの牛乳から分離され、National Type Culture Collection (英国) の受託番号 NCTC 14397 およびオランダ細菌培養コレクション (NCCB) の受託番号 NCCB 100775 に寄託されました。 ASxL5T の完全なゲノム配列CP046056の追加に従ってGenbankに寄託されました。
ASxL5T 細菌は、ファージ分離技術を使用して牛肉から分離されました9,49。スラリーを SM バッファー (50 mM Tris-HCl [pH 7.5]、0.1 M NaCl、8 mM MgSO4・7H2O および 0.01% ゼラチン、Sigma Aldrich、英国ギリンガム) で 1:9 (w/v) に希釈し、インキュベートしました。 4℃で24時間、ゆっくりと回転させて捕食者を緩衝液に溶出します。懸濁液を３０００ｇで３分間遠心分離した。上清を回収し、１３，０００ｇで５分間２回目の遠心分離した。次いで、上清を０．４５μｍ膜フィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および０．２μｍ膜フィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ）に通して、残留細菌細胞を除去した。 ASxL5T はこれらのフィルターを通過できます。標準技術を使用して、同じスラリーからカンピロバクター エンテロサス S12 (NCBI アクセッション番号 CP040464) の軟寒天ローンを調製しました。ろ過したスラリーをこれらの宿主細胞プレートのそれぞれに 10 μl の液滴として 3 回ずつ分配し、乾燥させました。プレートを微好気性タンク内で３７℃、微好気条件（５％Ｏ２、５％Ｈ２、１０％ＣＯ２、および８０％Ｎ２）下で４８時間インキュベートした。得られた目に見えるプラークをSM緩衝液に抽出し、C. hyointestinalis S12の新鮮な芝生に移し、溶解した微生物をさらに増殖させた。細菌が溶解性プラークの原因であり、ファージではないことが判明したら、宿主から独立して微生物を増殖させ、さらにその特徴を調べてみます。好気培養は、5% v/v の脱繊維化馬血液 (TCS Biosciences Lt、バッキンガム、英国、サプリメント) を使用して 37 °C で実行されました。国家臨床標準委員会のガイドラインによれば、ディスク拡散法は抗菌薬感受性試験に使用されます。 BHI 寒天培地を、好気培養用の次の抗生物質 (Oxoid) を含むディスクを使用して 37 °C で培養しました。アモキシシリンおよびクラブラン酸 30 μg。セフォタキシム 30μg;ストレプトマイシン 10μg;シプロフロキサシン 5μg;セフタジジム 30 μg ナリジキシン酸 30 μg;イミペネム 10μg;アジスロマイシン 15μg;クロラムフェニコール 30μg;セフォキシチン 30μg;テトラサイクリン 30μg;ニトロフラントイン 300μg;アズトレオナム 30μg;アンピシリン 10μg;セフポドキシム 10μg;トリメトプリム-スルファメトキサゾール 25 μg。耐塩性は、BHI 寒天プレート上で 37 °C で好気的にインキュベートすることによって確立されました。追加の NaCl を BHI 寒天プレートに添加して、最大 10% w/v の濃度範囲を提供しました。 pH 範囲は、BHI 寒天プレート上で 37°C で好気培養することによって決定されます。pH 範囲は滅菌 HCl または滅菌 NaOH で 4 ～ 9 に調整されており、プレートに注ぐ前に目標の pH 値が確認されます。細胞脂肪酸分析のために、ASxL5T を BHI 寒天上で 37 °C で好気的に 3 日間培養しました。 FERA Science Ltd, (英国ヨーク) の MIDI (Sherlock Microbial Identification System、バージョン 6.10) 標準プロトコルに従って、細胞脂肪酸を抽出、調製、分析しました。
TEM の場合、ASxL5T を BA 上に均一に広げて 37°C で 24 時間好気培養し、室温で 0.1 M カコジル酸緩衝液中の 3% (v/v) グルタルアルデヒド 1 ml に回収しました。1 時間固定し、遠心分離しました。 10,000gで3分間。次にペレットを 600 μl の 0.1 M カコジル酸緩衝液に静かに再懸濁します。固定された ASxL5T サスペンションを 200 メッシュ銅グリッド上の Formvar/カーボン フィルムに移します。細菌を 0.5% (w/v) 酢酸ウラニルで 1 分間染色し、TEI Tecnai G2 12 Biotwin 顕微鏡を使用して TEM によって検査しました。前述したように、NZCYM ブロス (BD Difco™、Fisher Scientific UK Ltd、Loughborough) で同数の獲物と捕食者を組み合わせ、カンピロバクターまたはカンピロバクターの微好気条件下で 37°C で 48 時間インキュベートします。捕食者と被食者の相互作用TEMでも検査しました。大腸菌の好気条件。獲物と捕食性細菌を独立して検査し、捕食による細胞形態の変化を判定します。 PHB蓄積の光学顕微鏡検査にはスーダンブラック法を使用しました。
滅菌綿棒で BHI または BA プレート上に増殖を塗りつけて、ASxL5T 培養物を一晩増殖させます。 ASxL5T 細胞を回収し、MRD (CM0733、Oxoid) に懸濁し、4℃で 7 日間放置して細胞を飢餓状態にします。 NCTC 参照または実験室ストック細菌培養物を BHI ブロスまたは No. 2 栄養ブロス (CM007、Oxoid) に接種し、一晩インキュベートし、13,000 g で遠心分離し、OD600 が 0.4 になるまで MRD に再懸濁しました。培養物: Bacillus subtilis NCTC 3610T、Citrobacter freundii NCTC 9750T、Enterobacter aerogenes NCTC 10006T、Enterococcus faecalis NCTC 775T、Escherichia coli NCTC 86、Klebsiella oxytoca 11466、Leuconostoc NCTC 10817、Listeria 特殊細菌NCTC 4885、Bacillus macerans NCTC 6355T、Providencia stuartsii NCTC 10318、Pseudomonas fluorescens SMDL、ロドコッカス サブマリン ハンバーガー NCTC 1621T、サルモネラ腸内細菌 モンデビル NCTC 5747、粘液 NCTC 10861、黄色ブドウ球菌 NCTC 8532T、Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T、Yersinia enterocolitica NCTC 10460。カンピロバクター宿主をBAプレート上で37℃で微好気的にインキュベートし、NZCYMブロスに懸濁した。試験したカンピロバクター宿主は以下の通り: C. coli 12667 NCTC、C. jejuni 12662、C. jejuni PT14、C. jejuni NCTC 11168T、C. helveticus NCTC 12472、C. lari NCTC 11458、C. lari NCTC 11458、C. jejuni PT14 、C…集める細胞を MRD に移し、13,000g で遠心分離し、OD600 が 0.4 になるまで MRD に再懸濁します。 ０．５ｍｌの懸濁液のアリコートを５ｍｌの融解したＮＺＣＹＭ上部寒天（０．６％寒天）に添加し、それを１．２％ＮＺＣＹＭ底部プレート上に注ぐ。硬化および乾燥後、段階希釈した ASxL5T を 20 µl の液滴として各芝生ボードに 3 回ずつ分配しました。培養温度と雰囲気は、試験細菌の要件によって異なります。
GenElute™ 細菌ゲノム DNA キット (Sigma Aldridge) を使用して細菌分離株から DNA を調製します。 16S rRNA 遺伝子の PCR 増幅および色素終結化学 (Eurofins Value Read Service, Germany) を使用した産物配列決定には標準的な方法を使用しました。 BLAST-N プログラムを使用して、これらの配列を他の 16S rRNA 遺伝子配列と比較し、密接に関連した種を同定して収集します。これらは、MEGA X プログラムの ClustalW を使用して調整されます。系統樹は、田村-根井モデルに基づく最尤法を使用し、1000 個のガイド付きコピーを使用して MEGA X を使用して再構築されました 54。 PureLink™ Genomic DNA Kit (Fisher Scientific、ラフバラー、英国) を使用して、全ゲノム配列決定用の DNA を抽出します。 ASxL5T のゲノム配列は、Illumina MiSeq の組み合わせを使用して決定されました。これは、Nextera ラベリング キットを使用して調製されたライブラリーと PacBio プラットフォームからの 2 ～ 20 kb の長さのリードで構成される 250 bp の両端リードで構成されます。センビア大学のゲノミクス DNA シーケンス研究施設。ゲノムは、CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen、オーフス、デンマーク) を使用して組み立てられました。 ASxL5T 培養物は、National Type Culture Collection (UK) および Netherlands Bacterial Culture Collection (NCCB) に寄託されています。比較に使用される関連生物のゲノムは次のとおりです。 Thalassolituus oleivorans MIL-1T (アクセッション番号 HF680312、完全)。バクテリオプレーンズ・サンエンシス KCTC 32220T (アクセッション番号 BMYY01000001、不完全)。オセアノバクター・クリギイ DSM 6294T (アクセッション番号 NZ_AUGV00000000、不完全); Marinamonas コミュニティ DSM 5604T (ASM436330v1 を追加、不完全)、Oceanospirullum linum ATCC 11336T (MTSD02000001 を追加、不完全)、および Thalassolituus sp. C2-1 (NZ_VNIL01000001 を追加、不完全)。 https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page= にある JGI Genome Portal36 を使用して、アラインメント スコア (AF) と平均核酸同一性 (ANI) を決定します。ペアで。 Rodriguez-R および Konstantinidis の方法 55 を使用して、アミノ酸同一性 (AAI) を決定しました。 GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 を使用して、推定された最尤系統樹を生成します。利用可能な参照ゲノムを表す入力ゲノムは、16S rRNA 系統発生から ASxL5T に関連すると同定された参照属から選択されます。インタラクティブな Tree of Life オンライン ツール (https://itol.embl.de/) を使用してツリーに注釈を付けました。 ASxL5T ゲノムの機能アノテーションと分析は、KEGG (京都遺伝子およびゲノム百科事典) モジュール エンリッチメント ディストリビューションを使用する BlastKOALA KEGG オンライン ツールを使用して実行されます。 COG カテゴリ (オルソロガス グループ) の分布は、eggNOG-mapper オンライン ツールを使用して決定されます。
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