새로운 유형의 그람 음성, 호기성, 내염성, 활성, 막대 모양 및 포식성 박테리아 ASxL5T가 영국 노팅엄셔의 소똥 연못에서 분리되었으며 캠필로박터를 먹이로 사용했습니다. 그 후, 다른 Campylobacter 종과 Enterobacteriaceae 계통의 구성원이 먹이로 발견되었습니다. 숙주 세포 없이 계대배양한 후, Brain Heart Infusion Agar에서 약한 무균 성장이 달성되었습니다. 최적의 성장 조건은 37°C이고 pH는 7입니다. 투과전자현미경은 먹이의 가용성과 관련된 매우 특이한 형태학적 특징을 드러냈습니다. 16S rRNA 유전자 서열을 사용한 계통발생학적 분석에서는 해당 분리물이 Marine Spirulina 계열의 구성원과 관련이 있지만 알려진 속의 구성원으로 명확하게 분류할 수 없음을 나타냅니다. ASxL5T의 전체 게놈 시퀀싱은 해양 스피로헤타 구성원과의 관계를 확인했습니다. 데이터베이스 검색에 따르면 여러 ASxL5T가 바다, 육지 표면 및 지하수의 여러 미배양 박테리아와 16S rRNA 유전자 서열을 공유하는 것으로 나타났습니다. 우리는 ASxL5T 균주가 새로운 속의 새로운 종을 대표한다고 제안합니다. Venatorbacter cucullus gen이라는 이름을 권장합니다. 11월, sp. 11월에는 ASxL5T가 유형 변형으로 사용되었습니다.
포식성 박테리아는 생합성 물질과 에너지를 얻기 위해 다른 살아있는 박테리아를 사냥하고 죽이는 능력을 나타내는 박테리아입니다. 이는 죽은 미생물로부터 일반적인 영양분 회복과 다르며, 박테리아가 숙주를 죽이지 않고 긴밀한 관계를 형성하는 기생충 상호작용과도 다릅니다. 포식성 박테리아는 자신이 발견되는 틈새(해양 서식지 등)에서 풍부한 식량원을 활용하기 위해 다양한 생활사를 진화시켜 왔습니다. 이들은 분류학적으로 다양한 그룹으로, 고유한 멸균 수명 주기로만 연결됩니다1. 포식성 박테리아의 예는 Proteobacteria, Bacteroides 및 Chlorella를 포함한 여러 다른 문에서 발견되었습니다.3. 그러나 가장 잘 연구된 포식성 박테리아는 Bdellovibrio 및 Bdellovibrio 유사 유기체(BALOs4)입니다. 포식성 박테리아는 새로운 생물학적 활성 화합물과 항균제5의 유망한 공급원입니다.
포식성 박테리아는 미생물 다양성을 향상시키고 생태계 건강, 생산성 및 안정성에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다6. 이러한 긍정적인 특성에도 불구하고 박테리아 배양의 어려움과 복잡한 수명 주기를 이해하기 위해 세포 상호 작용을 주의 깊게 관찰해야 하기 때문에 새로운 포식 박테리아에 대한 연구는 거의 없습니다. 이 정보는 컴퓨터 분석을 통해 얻기가 쉽지 않습니다.
항균제 내성이 증가하는 시대에 박테리오파지 및 포식성 박테리아를 사용하는 등 세균성 병원체를 표적으로 삼는 새로운 전략이 연구되고 있습니다7,8. ASxL5T 박테리아는 2019년 노팅엄셔 노팅엄 대학교 유제품 센터에서 수집한 소똥에서 파지 분리 기술을 사용하여 분리되었습니다. 조사의 목적은 생물학적 방제제로서의 가능성이 있는 유기체를 분리하는 것입니다. Campylobacter hyointestinalis는 인간 장 질환과 점점 더 관련이 있는 인수공통 병원체입니다. 이는 혈청 어디에나 존재하며 표적 숙주로 사용됩니다.
ASxL5T 박테리아는 C. hyointestinalis의 잔디밭에 형성된 플라크가 박테리오파지에 의해 생성된 것과 유사하다는 것이 관찰되었기 때문에 쇠고기 젤리에서 분리되었습니다. 파지 분리 과정의 일부에는 박테리아 세포를 제거하도록 설계된 0.2μm 필터를 통한 필터링이 포함되기 때문에 이는 예상치 못한 결과입니다. 플라크에서 추출된 물질을 현미경으로 조사한 결과 작은 그람 음성 굽은 막대 모양 박테리아가 폴리하이드록시부티레이트(PHB)를 축적하지 않는 것으로 나타났습니다. 먹이 세포와 무관한 무균 배양은 풍부한 고체 배지(예: 뇌심장 주입 한천(BHI) 및 혈액 한천(BA))에서 실현되며 성장이 약합니다. 이는 무거운 접종원이 개선된 계대배양 후에 얻어집니다. 미세호기성(7% v/v 산소) 및 대기 산소 조건에서는 동일하게 잘 자라지만 혐기성 환경에서는 그렇지 않습니다. 72시간 후, 콜로니의 직경은 2mm에 달하는 매우 작은 크기였으며, 베이지색이고 반투명하며 둥글고 볼록하며 윤기가 났다. ASxL5T는 액체 배지에서 안정적으로 배양될 수 없기 때문에 표준 생화학 테스트가 방해됩니다. 이는 생물막 형성의 복잡한 수명 주기에 의존할 수 있음을 시사합니다. 그러나 플레이트 현탁액은 ASxL5T가 호기성이며 산화효소 및 카탈라아제에 양성이며 5% NaCl을 견딜 수 있음을 보여주었습니다. ASxL5T는 10μg 스트렙토마이신에 내성이지만 테스트된 다른 모든 항생제에는 민감합니다. ASxL5T 박테리아 세포를 TEM으로 검사했습니다(그림 1). BA에서 먹이 세포 없이 성장할 때 ASxL5T 세포는 평균 길이가 1.63μm(± 0.4), 너비가 0.37μm(± 0.08), 단일 긴(최대 5μm) 극을 갖는 작은 캄필로박터입니다. 성적 편모. 세포의 약 1.6%는 폭이 0.2μm 미만인 것으로 나타나 필터 장치를 통과할 수 있습니다. 페어링(라틴 쿠쿨루스)과 유사한 일부 세포의 상단에서 특이한 구조적 확장이 관찰되었습니다(1D, E, G의 화살표 참조). 이는 과도한 외막으로 구성되어 있는 것으로 보이며, 이는 주변 세포질 외피 크기의 급속한 감소로 인한 것일 수 있지만 외막은 손상되지 않은 채 "느슨한" 모습을 보여줍니다. 4°C에서 오랫동안 영양분이 없는 상태(PBS)에서 ASxL5T를 배양하면 구균 형태를 나타내는 대부분의(전부는 아님) 세포가 생성되었습니다(그림 1C). ASxL5T가 Campylobacter jejuni를 먹이로 삼아 48시간 동안 성장할 때 평균 세포 크기는 숙주 없이 성장한 세포보다 훨씬 길고 좁습니다(표 1 및 그림 1E). 대조적으로, ASxL5T가 대장균을 먹이로 하여 48시간 동안 성장할 때, 평균 세포 크기는 먹이 없이 성장할 때보다 더 길고 넓으며(표 1), 세포 길이는 가변적이며 일반적으로 필라멘트를 나타냅니다(그림 1F). Campylobacter jejuni 또는 E. coli와 함께 48시간 동안 먹이로 배양했을 때 ASxL5T 세포는 전혀 편모를 나타내지 않았습니다. 표 1은 ASxL5T의 존재, 부재 및 먹이 유형에 따른 세포 크기의 변화 관찰을 요약합니다.
ASx5LT의 TEM 디스플레이: (A) ASx5LT는 긴 휩을 보여줍니다. (B) 일반적인 ASx5LT 배터리; (C) 영양분 없이 장기간 배양한 후 구균 ASx5LT 세포; (D) ASx5LT 세포 그룹은 비정상을 나타냅니다. (E) Campylobacter 먹이와 함께 배양된 ASx5LT 세포 그룹은 먹이 성장이 없는 그룹에 비해 세포 길이가 증가한 것으로 나타났습니다. (D) 또한 정점 구조를 나타냈습니다. (F) E. coli 먹이와 함께 배양한 후의 대형 사상성 편모, ASx5LT 세포; (G) 대장균과 함께 배양한 후 단일 ASx5LT 세포로, 특이한 상부 구조를 보여줍니다. 막대는 1μm를 나타냅니다.
16S rRNA 유전자 서열(수탁 번호 MT636545.1)을 결정하면 데이터베이스 검색을 통해 Gammaproteobacteria 클래스의 서열과 유사한 서열을 설정할 수 있으며 해양 스피릴럼 계열(그림 2)의 해양 박테리아에 가장 가깝고 Thalassolituus 속의 구성원입니다. Marine Bacillus와 가장 가까운 친척입니다. 16S rRNA 유전자 서열은 Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria) 계열에 속하는 포식성 박테리아와 분명히 다릅니다. B. 박테리오보루스 HD100T(유형 균주, DSM 50701)와 B. 박테리오보루스 DM11A의 쌍별 비교는 48.4%와 47.7%였으며, B. 엑소보루스 JSS의 경우 46.7%였습니다. ASxL5T 박테리아는 16S rRNA 유전자의 3개의 복사본을 가지고 있는데, 그 중 2개는 서로 동일하고, 세 번째는 3개의 염기만큼 떨어져 있습니다. 동일한 위치에서 유사한 형태학적 및 표현형 특성을 갖는 두 개의 다른 포식성 세균 분리물(ASx5S 및 ASx5O; 16S rRNA 유전자 접근 번호는 각각 MT636546.1 및 MT636547.1)은 동일하지 않지만 ASxL5T 및 배양되지 않은 세균과 다릅니다. 데이터베이스 서열은 Oceanospirillaceae의 다른 속과 함께 클러스터되어 있습니다 (그림 2). ASxL5T의 전체 게놈 서열이 결정되어 NCBI 데이터베이스에 저장되었으며, 수탁번호는 CP046056이다. ASxL5T의 게놈은 2,831,152bp의 원형 염색체와 56.1%의 G + C 비율로 구성됩니다. 게놈 서열에는 2653개의 CDS(전체)가 포함되어 있으며, 그 중 2567개가 단백질을 코딩하는 것으로 예측되며, 그 중 1596개(60.2%)가 추정 기능으로 할당될 수 있습니다. 게놈에는 9개의 rRNA(5S, 16S, 23S에 대해 각각 3개씩)와 57개의 tRNA를 포함하여 67개의 RNA 코딩 유전자가 포함되어 있습니다. ASxL5T의 게놈 특성은 16S rRNA 유전자 서열에서 확인된 가장 가까운 상대 유형의 균주의 이용 가능한 게놈과 비교되었습니다(표 2). AAI(아미노산 동일성)를 사용하여 사용 가능한 모든 Thalassolituus 게놈을 ASxL5T와 비교합니다. AAI가 결정한 가장 가까운(불완전한) 게놈 서열은 Thalassolituus sp.입니다. C2-1(NZ_VNIL01000001 추가). 이 균주는 마리아나 해구의 심해 퇴적물에서 분리되었지만 현재 비교를 위한 이 균주에 대한 표현형 정보가 없습니다. ASxL5T의 2.82Mb에 비해 유기체의 게놈은 4.36Mb로 더 큽니다. 해양 스피로헤타의 평균 게놈 크기는 약 4.16Mb(± 1.1; n = 92개의 완전한 참조 게놈(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assemblies에서 조사됨))이므로 ASxL5T의 게놈은 다음과 일치합니다. 순서는 다른 멤버들에 비해 상당히 적습니다. GToTree 1.5.54를 사용하여 감마프로테오박테리아 11,12,13,14,15,16에 특정한 172개의 단일 복사본 유전자의 정렬 및 연결된 아미노산 서열을 사용하여 게놈 기반 추정 최대 가능성 계통발생 트리(그림 3A)를 생성합니다. 17,18. 분석 결과 Thalassolituus, Bacterial Plane 및 Marine Bacterium과 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 그러나 이러한 데이터는 ASxL5T가 Marine Spirulina의 친척과 다르며 게놈 서열 데이터를 사용할 수 있음을 나타냅니다.
16S rRNA 유전자 서열을 사용한 계통발생수는 해양 스피루린과의 미배양 및 해양 박테리아 균주에 비해 ASxL5T, ASxO5 및 ASxS5 균주(장 포함)의 위치를 ​​강조합니다. Genbank 등록 번호는 괄호 안의 균주 이름 뒤에 표시됩니다. ClustalW를 사용하여 서열을 정렬하고, 최대 가능성 방법과 Tamura-Nei 모델을 사용하여 계통발생 관계를 추론하고, MEGA X 프로그램에서 1000개의 안내 복제를 수행합니다. 가지의 숫자는 안내 복사 값이 50%보다 크다는 것을 나타냅니다. Escherichia coli U/541T는 아웃그룹으로 사용되었습니다.
(A) 해양 Spirospiraceae 박테리아 ASxL5T와 그 가까운 친척인 E. coli U 5/41T 사이의 관계를 외집단으로 보여주는 게놈을 기반으로 한 계통발생수. (B) T. oleivorans MIL-1T와 비교하여 유전자의 기능적 범주 분포는 ASx5LT 단백질의 COG(정사군) 클러스터를 기반으로 예측됩니다. 왼쪽 그림은 각 게놈의 각 기능적 COG 범주에 있는 유전자 수를 보여줍니다. 오른쪽 그래프는 각 기능적 COG 그룹에 포함된 게놈의 비율을 보여줍니다. (C) T. oleiverans MIL-1T와 비교하여 ASxL5T의 전체 KEGG(유전자 및 게놈 교토 백과사전) 모듈 경로 분석.
KEGG 데이터베이스를 사용하여 ASxL5T 게놈에 존재하는 구성 요소 유전자를 조사하면 호기성 감마 프로테우스의 전형적인 대사 경로가 밝혀졌습니다. ASxL5T에는 주화성, 편모 조립 및 IV형 선모 시스템과 관련된 유전자를 포함하여 박테리아 운동 단백질에 할당된 총 75개의 유전자가 포함되어 있습니다. 마지막 범주에서는 유전자 10개 중 9개가 다양한 다른 유기체의 경련 운동을 담당합니다. ASxL5T의 게놈에는 호염성 물질에 대해 예상되는 것처럼 삼투압 스트레스에 대한 보호 반응에 참여하는 완전한 테트라하이드로피리미딘 생합성 경로가 포함되어 있습니다. 게놈에는 또한 리보플라빈 합성 경로를 포함하여 보조인자와 비타민에 대한 많은 완전한 경로가 포함되어 있습니다. 알칸 1-모노옥시게나제(alkB2) 유전자가 ASxL5T에 존재하지만 탄화수소 활용 경로는 완전하지 않습니다. ASxL5T의 게놈 서열에는 TOL_2658(alkB) 및 TOL_2772(알코올 탈수소효소)와 같이 T. oleiverans MIL-1T21의 탄화수소 분해를 주로 담당하는 것으로 확인된 유전자의 상동체가 분명히 없습니다. 그림 3B는 ASxL5T와 올리브 오일 MIL-1T 사이의 COG 범주에서 유전자 분포의 비교를 보여줍니다. 전반적으로 더 작은 ASxL5T 게놈은 더 큰 관련 게놈에 비해 각 COG 범주의 유전자를 비례적으로 더 적게 포함합니다. 각 기능 범주의 유전자 수를 게놈의 백분율로 표시하면 번역, 리보솜 구조 및 생물 발생 범주, 더 큰 ASxL5T를 구성하는 에너지 생산 및 전환 기능 범주의 유전자 백분율에 차이가 나타납니다. 게놈 백분율은 T. oleiverans MIL-1T 게놈에 존재하는 동일한 그룹과 비교됩니다. 대조적으로, ASxL5T 게놈과 비교하여 T. oleivorans MIL-1T는 복제, 재조합 및 복구, 전사 범주에서 유전자의 비율이 더 높습니다. 흥미롭게도 두 게놈의 각 기능 범주 내용에서 가장 큰 차이점은 ASxL5T에 존재하는 알려지지 않은 유전자의 수입니다(그림 3B). KEGG 모듈의 농축 분석이 수행되었으며, 여기서 각 KEGG 모듈은 게놈 서열 데이터의 주석 및 생물학적 해석을 위해 수동으로 정의된 기능 단위 세트를 나타냅니다. ASxL5T와 올리브 MIL-1T의 전체 KOG 모듈 경로에서 유전자 분포의 비교는 그림 3C에 나와 있습니다. 이 분석은 ASxL5T가 완전한 황 및 질소 대사 경로를 가지고 있지만 T. oleiverans MIL-1T는 그렇지 않음을 보여줍니다. 대조적으로, T. oleiverans MIL-1T는 완전한 시스테인 및 메티오닌 대사 경로를 가지고 있지만 ASxL5T에서는 불완전합니다. 따라서 ASxL5T는 황산염 동화를 위한 특징적인 모듈(대사 능력이나 병원성과 같은 표현형 마커로 사용할 수 있는 유전자 세트로 정의됨; https://www.genome.jp/kegg/module.html)을 가지고 있습니다. .올리버란스 MIL-1T. ASxL5T의 유전자 함량을 약탈적인 생활 방식을 암시하는 유전자 목록과 비교하는 것은 결론이 나지 않습니다. 코어에 O 항원 다당류와 연관된 리가제를 코딩하는 waaL 유전자가 ASxL5T 게놈에 존재하지만(그러나 이는 많은 그람 음성 박테리아에서 일반적임), 트립토판 2,3-디옥시게나제(TDO) 유전자에는 60개의 아미노산이 포함될 수 있습니다. 존재하지 않는 포식성 박테리아에서 흔히 발견되는 산성 영역. ASxL5T 게놈에는 메발로네이트 경로에서 이소프레노이드 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 포함하여 다른 약탈적 특성 유전자가 없습니다. 조사된 포식자 그룹에는 전사 조절 유전자 gntR이 없지만 ASxL5T에서는 3개의 gntR 유사 유전자가 확인될 수 있습니다.
ASxL5T의 표현형 특성은 표 3에 요약되어 있으며 문헌에 보고된 관련 속 23, 24, 25, 26 및 27의 표현형 특성과 비교됩니다. T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis 및 Oceanobacter kriegii의 분리균은 활성, 내염성, 산화효소 양성 막대 모양체이지만 ASxL5T와 관련된 다른 표현형 특성은 거의 없습니다. 바다의 평균 pH는 8.1(https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77)이며 이는 T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis 및 O.에 반영됩니다. 크리기이. ASxL5T는 비해양종의 일반적인 더 넓은 pH 범위(4-9)에 적합합니다. Thalassolituus sp.의 표현형적 특성 C2-1. 알려지지 않은. ASxL5T의 성장 온도 범위는 일반적으로 해양 균주(4~42°C)보다 넓지만 일부 T. marinus 분리균은 내열성이 있습니다. 국물 배지에서 ASxL5T를 성장시킬 수 없기 때문에 추가적인 표현형 특성 분석이 불가능했습니다. API 20E를 사용하여 BA 플레이트, ONPG, 아르기닌 디하이드롤라제, 라이신 탈탄산효소, 오르니틴 탈탄산효소, 구연산염 활용, 우레아제, 트립토판 탈탄산효소, 젤라틴 가수분해 효소에서 긁힌 물질을 테스트합니다. 테스트 결과는 모두 음성이었지만 인돌, 아세토인 및 H2S는 없었습니다. 생산되었습니다. 발효되지 않은 탄수화물에는 포도당, 만노스, 이노시톨, 소르비톨, 람노스, 자당, 멜리비오스, 아미그달린 및 아라비노스가 포함됩니다. 공개된 관련 참조 균주와 비교하여 ASxL5T 균주의 세포 지방산 프로필은 표 4에 나와 있습니다. 주요 세포 지방산은 C16:1Ω6c 및/또는 C16:1Ω7c, C16:0 및 C18:1Ω9입니다. 하이드록시 지방산 C12:0 3-OH 및 C10:0 3-OH도 존재합니다. ASxL5T의 C16:0 비율은 관련 속의 보고된 값보다 높습니다. 대조적으로, 보고된 T. marinus IMCC1826TT와 비교하여 ASxL5T에서 C18:1Ω7c 및/또는 C18:1Ω6c의 비율이 감소합니다. oleivorans MIL-1T 및 O. kriegii DSM 6294T, B. sanyensis KCTC 32220T에서는 검출되지 않습니다. ASxL5T와 ASxLS의 지방산 프로파일을 비교하면 두 균주 사이의 개별 지방산 양에 미묘한 차이가 있는 것으로 나타났으며 이는 동일한 종의 게놈 DNA 서열과 일치합니다. 수단 블랙 테스트에서는 폴리-3-하이드록시부티레이트(PHB) 입자가 검출되지 않았습니다.
ASxL5T 박테리아의 포식 활동을 연구하여 먹이의 범위를 결정했습니다. 이 박테리아는 Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T를 포함한 Campylobacter 종에 플라크를 형성할 수 있습니다. 대장균 NCTC 12667; C. 헬베티쿠스 NCTC 12472; C lari NCTC 11458 및 C. upsaliensis NCTC 11541T. 더 넓은 범위의 그람 음성균과 그람 양성균을 테스트하려면 분석법의 숙주 범위 결정 섹션에 나열된 배양균을 사용하십시오. 결과는 ASxL5T가 Escherichia coli NCTC 86 및 Citrobacter freundii NCTC 9750T에서도 사용될 수 있음을 보여줍니다. Klebsiella oxytoca 11466에 형성된 플라크. E. coli NCTC 86과의 TEM 상호작용은 그림 4A-D에 표시되어 있으며 Campylobacter jejuni PT14 및 Campylobacter suis S12와의 상호작용은 그림 4E-H 중간에 표시되어 있습니다. 공격 메커니즘은 각 ASxL5T 세포에 부착된 하나 이상의 대장균 세포가 흡착되기 전에 확장된 세포를 따라 측면에 위치하는 것으로 테스트된 먹이 유형 간에 다른 것으로 보입니다. 대조적으로, ASxL5T는 일반적으로 포식자 세포의 정점과 캄필로박터 세포의 정점 근처와 접촉하는 단일 접촉 지점을 통해 캄필로박터에 부착되는 것으로 보입니다(그림 4H).
ASx5LT와 먹이 사이의 상호작용을 보여주는 TEM: (AD)와 E. coli 먹이; (EH) 및 C. jejuni 먹이. (A) 단일 대장균(EC) 셀에 연결된 일반적인 ASx5LT 셀; (B) 단일 EC 셀에 부착된 필라멘트 ASx5LT; (C) 여러 EC 셀에 연결된 필라멘트 ASx5LT 셀; (D) 단일 대장균(EC) 세포에 더 작은 ASx5LT 세포를 부착합니다. (E) Campylobacter jejuni(CJ) 세포에 연결된 단일 ASx5LT 세포; (F) ASx5LT는 C. hyointestinalis(CH) 세포를 공격합니다. (G) 두 개의 One ASx5LT 셀이 CJ 셀을 공격했습니다. (H) CJ 셀의 정점 근처에 있는 ASx5LT 부착 지점의 클로즈업 보기(바 0.2 μm). 막대는 (A–G)에서 1μm를 나타냅니다.
포식성 박테리아는 풍부한 먹이 공급원을 이용하도록 진화했습니다. 분명히 그들은 다양한 환경에 널리 존재합니다. 인구 구성원의 좁은 크기로 인해 파지 분리 방법을 사용하여 슬러리에서 ASxL5T 박테리아를 분리하는 것이 가능합니다. 해양 박테리아의 Oceanospirillaceae 계열 구성원에 대한 ASxL5T의 게놈 관련성은 놀랍습니다. 비록 유기체가 내염성이 있고 5% 염을 함유한 배지에서 자랄 수 있지만 말입니다. 슬러리 수질분석 결과 염화나트륨 함량이 0.1% 미만인 것으로 나타났다. 따라서 진흙은 지리적으로나 화학적으로 해양 환경과 멀리 떨어져 있습니다. 동일한 출처에서 서로 관련되어 있지만 서로 다른 세 가지 분리체가 존재한다는 것은 이러한 포식자가 이러한 비해상 환경에서 번성하고 있다는 증거를 제공합니다. 또한, 미생물군유전체 분석(데이터 파일은 https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990에서 이용 가능)을 통해 동일한 16S rRNA 유전자 서열이 가장 풍부한 운영 분류군(OTU) 상위 50개에 위치하는 것으로 나타났습니다. ) 몇 번의 샘플링 간격으로 진흙을 채취합니다. Genbank 데이터베이스에서 ASxL5T 박테리아와 유사한 16S rRNA 유전자 서열을 가진 여러 가지 배양되지 않은 박테리아가 발견되었습니다. ASxL5T, ASxS5 및 ASxO5의 서열과 함께 이러한 서열은 Thalassolituus 및 Oceanobacter에서 분리된 서로 다른 계통군을 나타내는 것으로 보입니다(그림 2). 2009년 남아프리카공화국 금광 깊이 1.3km의 열구수에서 미배양세균 3종(GQ921362, GQ921357, GQ921396)이 분리됐고, 나머지 2종(DQ256320, DQ337006)은 지하수(남아프리카공화국도 마찬가지)에서 분리됐다. 2005년). ASxL5T와 가장 밀접하게 관련된 16S rRNA 유전자 서열은 2006년 프랑스 북부 해변에서 얻은 모래 퇴적물의 농축 배양에서 얻은 16S rRNA 유전자 서열의 일부입니다(수탁 번호 AM29240828). 배양되지 않은 박테리아 HQ183822.1의 또 다른 밀접하게 관련된 16S rRNA 유전자 서열은 중국의 도시 매립지에서 용출된 수집 탱크에서 얻어졌습니다. 분명히 ASxL5T 박테리아는 분류학적 데이터베이스에서 그다지 대표성이 없지만, 배양되지 않은 박테리아의 이러한 서열은 일반적으로 까다로운 환경에서 전 세계에 분포하는 ASxL5T와 유사한 유기체를 나타낼 가능성이 높습니다. 전체 게놈 계통발생 분석에서 ASxL5T와 가장 가까운 것은 Thalassolituus sp.입니다. C2-1, T. 마리누스, T. 올리보란스. 그리고 O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus는 해양 및 육상 환경에 널리 퍼져 있으며 일반적으로 탄화수소 오염 사고 이후 지배적이 되는 해양 절대 탄화수소 단편화 박테리아(OHCB)의 구성원입니다30,31. 해양 박테리아는 OHCB 그룹의 구성원이 아니지만 해양 환경에서 격리됩니다.
표현형 데이터는 ASxL5T가 새로운 종이며 해양 스피로스피라세과(marine spirospiraceae 계통)에서 이전에 인식되지 않은 속의 구성원임을 나타냅니다. 현재 새로 분리된 균주를 새로운 속으로 분류하는 명확한 표준은 없습니다. 예를 들어 보존 단백질(POCP)의 게놈 백분율을 기준으로 보편적인 속 경계를 결정하려는 시도가 이루어졌으며, 컷오프 값은 기준 균주와 50% 동일한 것이 권장됩니다. 다른 사람들은 불완전한 게놈에서 얻을 수 있기 때문에 POCP에 비해 장점이 있는 AAI 값을 사용할 것을 제안합니다34. 저자는 모델종의 모델균주와 비교하여 AAI 값이 74% 미만이면 해당 균주가 다른 속을 대표하는 균주라고 생각한다. 해양 나선과의 모델 속은 해양 나선이며, 모델 균주는 O. linum ATCC 11336T입니다. ASxL5T와 O. linum ATCC 11336T 사이의 AAI 값은 54.34%이고, ASxL5T와 T. oleivorans MIL-1T(속 유형 균주) 사이의 AAI 값은 67.61%로 ASxL5T가 Thalassolituus와는 다른 새로운 속임을 나타냅니다. 16S rRNA 유전자 서열을 분류 표준으로 사용하여 제안된 속 경계 경계는 94.5%35입니다. ASxL5T는 Thalassolituus 속에 위치할 수 있으며, T. oleivorans MIL-1T와 95.03% 및 96.17%의 16S rRNA 서열 동일성을 나타냅니다. 마리누스 IMCC1826T. 그러나 B. sanyensis NV9와 94.64%의 16S rRNA 유전자 동일성을 갖는 Bacteroides 속에도 포함될 것이며, 이는 16S rRNA 유전자와 같은 단일 유전자의 사용이 임의의 분류 및 할당으로 이어질 수 있음을 나타냅니다. 또 다른 제안 방법은 ANI 및 AF(Genome Alignment Score)를 사용하여 기존 속의 모든 유형 및 비유형 계통의 데이터 포인트 클러스터링을 검사합니다. 저자는 속 경계를 분석 중인 분류군에 특정한 추정 속 변곡점과 결합할 것을 권장합니다. 그러나 Thalassolituus 분리주로부터 완전한 게놈 서열이 충분하지 않은 경우, 이 방법으로 ASxL5T가 Thalassolituus 속에 속하는지 여부를 결정하는 것은 불가능합니다. 분석을 위한 완전한 게놈 서열의 이용 가능성이 제한되어 있기 때문에 전체 게놈 계통수를 주의 깊게 해석해야 합니다. 둘째, 전체 게놈 비교 방법은 비교된 게놈 크기의 실질적인 차이를 설명할 수 없습니다. 그들은 관련 속들 사이에 보존된 핵심 단일 복사본 유전자의 유사성을 측정했지만 훨씬 작은 ASxL5T 게놈에는 존재하지 않는 많은 수의 유전자를 고려하지 않았습니다. 분명히 ASxL5T와 Thalassolituus, Oceanobacter 및 Bacterioplanes를 포함한 그룹은 공통 조상을 가지고 있지만 진화는 다른 경로를 택하여 약탈적인 생활 방식에 적응할 수 있는 게놈의 감소로 이어졌습니다. 이는 28% 더 크고 탄화수소를 활용하기 위해 다양한 환경 압력에서 진화한 T. oleivorans MIL-1T와 대조적입니다. 리케차(Rickettsia), 클라미디아(Chlamydia) 및 부크네라(Buchnera)와 같은 절대 세포내 기생충 및 공생체를 사용하여 흥미로운 비교를 할 수 있습니다. 그들의 게놈 크기는 약 1Mb입니다. 숙주 세포 대사산물을 활용하는 능력은 유전자 손실로 이어지므로 상당한 진화적 게놈 분해를 겪었습니다. 해양 화학 영양 유기체에서 약탈적인 생활 방식으로의 진화적 변화는 게놈 크기의 유사한 감소를 초래할 수 있습니다. COG 및 KEGG 분석은 특정 기능에 사용되는 유전자의 수와 ASxL5T와 T. oleivorans MIL-1T 사이의 게놈 경로의 전체적인 차이를 강조합니다. 이는 이동 유전 요소의 광범위한 가용성 때문이 아닙니다. ASxL5T의 전체 게놈의 G+C 비율 차이는 56.1%, T. oleivorans MIL-1T의 경우 46.6%로 분리되어 있음을 나타냅니다.
ASxL5T 게놈의 코딩 내용을 조사하면 표현형 특성에 대한 기능적 통찰력을 얻을 수 있습니다. IV형 선모(Tfp)를 암호화하는 유전자의 존재는 표면에 편모가 없이 사회적 활공 또는 경련이라고 불리는 세포 운동을 촉진하기 때문에 특히 중요합니다. 보고서에 따르면 Tfp는 포식, 발병, 생물막 형성, 천연 DNA 흡수, 자동 세포 집합 및 발달을 포함한 다른 기능을 가지고 있습니다. ASxL5T 게놈에는 디구아닐레이트 사이클라제(2 구아노신 삼인산을 구아노신 2 포스페이트 및 고리형 diGMP로 전환하는 것을 촉매하는 효소)를 코딩하는 18개의 유전자와 상응하는 디구아닐레이트 사이클라제 인산염 디구아닐레이트를 코딩하는 6개의 유전자가 포함되어 있습니다. 에스테라제 유전자(고리형 di-GMP를 구아노신 모노포스페이트로 분해하는 촉매)는 흥미롭습니다. 왜냐하면 cycl-di-GMP는 생물막 발달과 분리, 이동, 세포 부착 및 독성과 관련된 중요한 2차 전달자이기 때문입니다39, 40. 또한 Bdellovibrio bacteriovorus에서는 순환 이중 GMP가 자유 생활과 약탈적 생활 방식 사이의 전환을 제어하는 ​​것으로 나타났습니다41.
포식성 박테리아에 대한 대부분의 연구는 Bdellovibrio, Bdellovibrio 유사 유기체 및 Myxococcus 종에 중점을 두었습니다. 이러한 포식성 박테리아의 알려진 예는 다양한 그룹을 형성합니다. 이러한 다양성에도 불구하고, 알려진 11종의 포식성 박테리아의 표현형을 반영하는 일련의 특징적인 단백질 계열이 확인되었습니다3,22. 그러나 O 항원 리가제(waaL)를 코딩하는 유전자만 확인되었으며, 이는 특히 그람 음성 박테리아에서 흔히 발생합니다. 이러한 형태의 분석은 ASxL5T를 포식자로 지정하는 데 도움이 되지 않습니다. 아마도 새로운 공격 전략을 사용하기 때문일 것입니다. 보다 다양한 포식성 박테리아 게놈의 가용성은 그룹 구성원 간의 기능적, 환경적 차이에 대한 증거를 고려한 보다 정밀한 분석을 개발하는 데 도움이 될 것입니다. 이 분석에 포함되지 않은 포식성 박테리아의 예로는 Cupriavidus necator42 및 Bradymonabacteria43가 포함됩니다. 왜냐하면 연구자들이 다양한 미생물 군집을 조사함에 따라 더 많은 포식성 분류군이 확립되기 때문입니다.
TEM 이미지로 포착된 ASxL5T 박테리아의 가장 주목할만한 특징은 독특하고 유연한 형태로, 먹이 박테리아와의 상호 작용을 촉진할 수 있습니다. 관찰된 상호 작용 유형은 다른 포식성 박테리아와 다르며 이전에 발견되거나 보고된 적이 없습니다. 제안된 ASxL5T 포식 생활 주기는 그림 5에 나와 있습니다. 여기에 보고된 것과 유사한 정점 구조를 가진 문헌에는 몇 가지 예가 있지만 이러한 예에는 가끔 정점이 확대되는 해양 스피릴럼 박테리아인 Terasakiispira papahanaumokuakeensis와 Alphaproteobacteria, Terasakiella pusilla가 포함됩니다. , 이전에는 Oceanospirillum 속에 속했으며 소위 "극성 필름"을 나타냅니다. 45. 구균 형태는 오래된 배양에서 종종 관찰되며, 특히 Vibrio, Campylobacter 및 Helicobacter와 같이 구부러진 형태를 가진 박테리아의 경우 분해된 상태를 나타낼 수 있습니다. ASxL5T 박테리아의 정확한 수명주기를 명확히 하기 위해서는 추가 작업이 필요합니다. 포획하고 포식하는 방법과 게놈이 의료 또는 생명공학 목적으로 사용할 수 있는 생물학적 활성 화합물을 암호화하는지 여부를 확인합니다.
Venatorbacter gen.에 대한 설명 11월 Venatorbacter(Ven.a.tor, ba'c.ter, L.는 L. n. venator, 'hunter'와 Gr. n. bacter, 'a 막대'의 venator로 구성됩니다. Venatorbacter, 'a Hunting Rod' 세포는 호기성이며, 곡선형 그람 염색 음성이며, 카탈라제 및 산화효소 활성은 4~42°C의 온도 범위에서 축적되지 않습니다. 4-9의 pH 범위는 일반적이지 않습니다. 해양 달팽이에서는 대부분 산성 pH를 견디지 ​​못합니다. -OH 및 C10:0 3-OH는 하이드록시 지방산으로 발견됩니다. 이들은 국물 배지에서 자라지 않습니다. DNA G + C 함량은 다음과 같습니다. 56.1 mol%. 이 속의 구성원은 Campylobacter에 대한 저항성을 나타내며 Enterobacteriaceae과의 포식 행동을 나타냅니다.
Venatorbacter cucullus sp.에 대한 설명 11월 Venatorbacter cucullus(cu'cull.us.; L. n. cucullus는 페어링을 의미함).
또한, 이 속의 설명적 특징은 BA 또는 BHI에서 성장할 때 세포의 길이가 1.63μm, 너비가 0.37μm라는 것입니다. BHI 한천의 집락은 매우 작아서 72시간 후에 직경이 2mm에 이릅니다. 베이지 색이고 반투명하며 둥글고 볼록하며 반짝입니다. 이 종의 구성원은 Escherichia coli와 Klebsiella를 사용할 수 있습니다. 캄필로박터(Campylobacter)와 기타 여러 그람 음성 박테리아가 먹이 역할을 합니다.
전형적인 균주 ASxL5T는 영국 노팅엄셔(Nottinghamshire)의 쇠고기 우유에서 분리되었으며 National Type Culture Collection(UK): 수탁 번호 NCTC 14397 및 네덜란드 세균 배양 컬렉션(NCCB) 수탁 번호 NCCB 100775에 기탁되었습니다. ASxL5T의 전체 게놈 서열 CP046056의 추가에 따라 Genbank에 입금되었습니다.
ASxL5T 박테리아는 파지 분리 기술9,49을 사용하여 쇠고기 우유에서 분리되었습니다. 슬러리를 SM 완충액(50mM Tris-HCl [pH 7.5], 0.1M NaCl, 8mM MgSO4.7H2O 및 0.01% 젤라틴; Sigma Aldrich, Gillingham, UK)에 1:9(w/v)로 희석한 후 인큐베이션했습니다. 4°C에서 24시간 동안 천천히 회전하면서 포식자를 완충액으로 용출시킵니다. 현탁액을 3000g에서 3분 동안 원심분리했습니다. 상청액을 수집하고 13,000g에서 5분간 두 번째 원심분리했습니다. 그런 다음 상청액을 0.45μm 멤브레인 필터(Minisart, Sartorius, Gottingen, Germany) 및 0.2μm 멤브레인 필터(Minisart)를 통과하여 남아 있는 박테리아 세포를 제거했습니다. ASxL5T는 이러한 필터를 통과할 수 있습니다. 동일한 슬러리로부터 Campylobacter enterosus S12(NCBI 수탁 번호 CP040464)의 부드러운 한천 잔디를 표준 기술을 사용하여 준비했습니다. 여과된 슬러리를 이들 숙주 세포 플레이트 각각에 10μl 액적으로 3회 분배하고 건조시켰습니다. 플레이트를 미호기성 조건(5% O2, 5% H2, 10% CO2 및 80% N2) 하에서 37°C의 미호기성 탱크에서 48시간 동안 배양했습니다. 획득된 눈에 보이는 플라크를 SM 완충액으로 추출하고 C. hyointestinalis S12의 신선한 잔디밭으로 옮겨 용해된 유기체를 추가로 증식시켰습니다. 박테리아가 파지의 원인이 아니라 용해성 플라크의 원인이라는 것이 확인되면 숙주와 독립적으로 유기체를 성장시키고 추가로 특성을 분석해 보십시오. 호기성 배양은 5% v/v 탈섬유화된 말 혈액(TCS Biosciences Lt, Buckingham, UK, 보충제)을 사용하여 37°C에서 수행되었습니다. 국가임상표준위원회의 지침에 따라 항균제 감수성 검사에는 디스크 확산법을 사용하고 있다. BHI 한천은 호기성 배양을 위해 다음 항생제(Oxoid)가 포함된 디스크를 사용하여 37°C에서 배양되었습니다: 아목시실린 및 클라불란산 30μg; 세포탁심 30μg; 스트렙토마이신 10μg; 시프로플록사신 5μg; 세프타지딤 30μg 날리딕스산 30μg; 이미페넴 10μg; 아지스로마이신 15μg; 클로람페니콜 30μg; 세폭시틴 30μg; 테트라사이클린 30μg; 니트로푸란토인 300μg; 아즈트레오남 30μg; 암피실린 10μg; 세프포독심 10μg; 트리메토프림-설파메톡사졸 25μg. 내염성은 37°C에서 BHI 한천 플레이트에서 호기성 배양을 통해 확립되었습니다. 추가 NaCl을 BHI 한천 플레이트에 첨가하여 최대 10% w/v의 농도 범위를 제공했습니다. pH 범위는 37°C에서 BHI 한천 플레이트에서 호기성 배양을 통해 결정됩니다. 여기서 pH 범위는 멸균 HCl 또는 멸균 NaOH를 사용하여 4~9 사이로 조정되었으며, 플레이트를 따르기 전에 목표 pH 값을 확인합니다. 세포 지방산 분석을 위해 ASxL5T를 BHI 한천에서 3일 동안 배양하고 37°C에서 호기성으로 배양했습니다. FERA Science Ltd(York, UK)의 MIDI(Sherlock Microbial Identification System, 버전 6.10) 표준 프로토콜에 따라 세포 지방산을 추출, 제조 및 분석했습니다.
TEM의 경우 ASxL5T를 37°C에서 24시간 동안 BA에 균일하게 도말하여 호기성 배양한 후 0.1M 카코딜레이트 완충액에 용해된 3%(v/v) 글루타르알데히드 1ml에 실온에서 1시간 동안 고정한 후 원심분리합니다. 10,000g에서 3분 동안. 그런 다음 600 μl 0.1 M cacodylate 완충액에 펠렛을 부드럽게 다시 놓습니다. 고정된 ASxL5T 서스펜션을 200 메쉬 구리 그리드의 Formvar/탄소 필름으로 옮깁니다. 박테리아를 1분 동안 0.5%(w/v) 우라닐 아세테이트로 염색하고 TEI Tecnai G2 12 Biotwin 현미경을 사용하여 TEM으로 검사했습니다. 위에서 언급한 바와 같이 NZCYM 액체배지(BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough)에 동일한 수의 먹이와 포식자를 결합하고 37°C에서 Campylobacter 또는 Campylobacter의 미세호기성 조건에서 48시간 동안 배양하면 포식자와 먹이의 상호작용 TEM에서도 조사되었습니다. 대장균에 대한 호기성 조건. 먹이와 포식성 박테리아를 독립적으로 검사하여 포식으로 인한 세포 형태의 변화를 확인합니다. PHB 축적의 광학 현미경 검사에는 수단 블랙 방법이 사용되었습니다.
멸균 면봉으로 BHI 또는 BA 플레이트에 성장을 번짐으로써 ASxL5T 하룻밤 배양을 성장시킵니다. ASxL5T 세포를 수집하여 MRD(CM0733, Oxoid)에 현탁한 다음 4°C에서 7일 동안 놓아 세포를 굶깁니다. NCTC 참조 또는 실험실 스톡 박테리아 배양물을 BHI 국물 또는 No. 2 영양 배지(CM007, Oxoid)에 접종하고 밤새 배양하고 13,000g에서 원심분리한 다음 OD600이 0.4가 될 때까지 MRD에 재현탁했습니다. 배양: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, Klebsiella oxytoca 11466, Leuconostoc NCTC 10817, Listeria Specialbacterium NCTC 4885, 바실러스 마세란스 NCTC 6355T, 프로비덴시아 스튜어트시 NCTC 10318, 슈도모나스 플루오레센스 SMDL, 로도코커스 잠수함 햄버거 NCTC 1621T, 살모넬라 장내 세균 몬데빌 NCTC 5747, 점액 NCTC 10861, 황색포도상구균 NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. Campylobacter 숙주를 37°C의 BA 플레이트에서 미세호기성 배양하고 NZCYM 국물에 현탁시켰습니다. 테스트된 캄필로박터 숙주는 C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11458, C. lari NCTC 11458, C. jejuni PT14 , C... 세포 수집 MRD에서는 13,000g에서 원심분리하고 OD600이 0.4가 될 때까지 MRD에 재현탁합니다. 0.5ml 현탁액을 녹인 NZCYM 상단 한천(0.6% 한천) 5ml에 추가하고 1.2% NZCYM 하단 플레이트에 붓습니다. 경화 및 건조 후, 연속적으로 희석된 ASxL5T를 각 잔디밭 보드에 20μl 방울로 3회 배포했습니다. 배양 온도와 분위기는 테스트 박테리아의 요구 사항에 따라 달라집니다.
GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit(Sigma Aldridge)를 사용하여 분리된 세균으로부터 DNA를 준비하십시오. 16S rRNA 유전자의 PCR 증폭 및 염료 종결 화학(Eurofins Value Read Service, Germany)을 사용한 산물 서열 결정을 위해 표준 방법을 사용했습니다. BLAST-N 프로그램을 사용하여 이러한 서열을 다른 16S rRNA 유전자 서열과 비교하여 밀접하게 관련된 종을 식별하고 수집하십시오. 이는 MEGA X 프로그램의 ClustalW를 사용하여 정렬됩니다. 계통발생수는 Tamura-Nei 모델을 기반으로 한 최대 우도 방법을 사용하여 MEGA X를 사용하여 1000개의 안내 사본으로 재구성되었습니다. 전체 게놈 시퀀싱을 위한 DNA를 추출하려면 PureLink™ Genomic DNA Kit(Fisher Scientific, Loughborough, UK)를 사용하십시오. ASxL5T의 게놈 서열은 Nextera 라벨링 키트를 사용하여 준비된 라이브러리와 PacBio 플랫폼의 2~20kb 긴 읽기로 구성된 250bp 이중 끝 읽기로 구성된 Illumina MiSeq 조합을 사용하여 결정되었습니다. Sembia University의 유전체학 DNA 시퀀싱 연구 시설. 게놈은 CLC Genomics Workbench 12.0.3(덴마크 오르후스 소재의 Qiagen)을 사용하여 조립되었습니다. ASxL5T 배양물은 National Type Culture Collection(UK) 및 네덜란드 세균 배양 컬렉션(NCCB)에 기탁되어 있습니다. 비교에 사용된 관련 유기체의 게놈은 다음과 같습니다: Thalassolituus oleivorans MIL-1T(수탁 번호 HF680312, 완전); Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T(수탁 번호 BMYY01000001, 불완전); Oceanobacter kriegii DSM 6294T(수탁 번호 NZ_AUGV00000000, 불완전); Marinamonas 커뮤니티 DSM 5604T(ASM436330v1 추가, 불완전), Oceanospirullum linum ATCC 11336T(MTSD02000001 추가, 불완전) 및 Thalassolituus sp. C2-1(NZ_VNIL01000001 추가, 불완전). 정렬 점수(AF)와 평균 핵산 동일성(ANI)을 결정하려면 https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page=에서 JGI Genome Portal36을 사용하십시오. 쌍으로. Rodriguez-R & Konstantinidis55 방법을 사용하여 아미노산 동일성(AAI)을 결정했습니다. GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18을 사용하여 추정된 최대 우도 계통수를 생성합니다. 이용 가능한 참조 게놈을 나타내는 입력 게놈은 16S rRNA 계통발생에서 ASxL5T와 관련이 있는 것으로 식별된 참조 속에서 선택됩니다. 대화형 생명나무 온라인 도구(https://itol.embl.de/)를 사용하여 나무에 주석을 달았습니다. ASxL5T 게놈의 기능적 주석 및 분석은 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 모듈 강화 배포판을 사용하는 BlastKOALA KEGG 온라인 도구를 사용하여 수행됩니다. COG 범주(직교 그룹)의 분포는 eggNOG-mapper 온라인 도구를 사용하여 결정됩니다.
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