Нов тип на грам-негативни, аеробни, толерантни на сол, активни, во облик на прачка и грабливи бактерии ASxL5T беше изолиран од езерцето со кравји измет во Нотингемшир, Англија и го користеше Campylobacter како свој плен. Последователно, други видови Campylobacter и членови на семејството Enterobacteriaceae беа откриени како плен. По субкултура без клетки домаќини, беше постигнат слаб асептичен раст на Brain Heart Infusion Agar. Оптималните услови за раст се 37 °C, а pH е 7. Преносната електронска микроскопија откри некои многу необични морфолошки карактеристики поврзани со достапноста на пленот. Филогенетската анализа со користење на генската секвенца 16S rRNA покажа дека изолатот е поврзан со член на семејството на Marine Spirulina, но не може јасно да се класифицира како член на кој било познат род. Секвенционирањето на целиот геном на ASxL5T ја потврди врската со членовите на морските спирохети. Пребарувањето на базата на податоци откри дека неколку ASxL5T споделуваат генски секвенци на 16S rRNA со неколку некултурни бактерии од океанот, површината на земјата и подземните води. Предлагаме сојот ASxL5T да претставува нов вид во нов род. Ви го препорачуваме името Venatorbacter cucullus gen. ноември, сп. Во ноември, ASxL5T се користеше како тип на сој.
Предаторските бактерии се бактерии кои покажуваат способност да ловат и убиваат други живи бактерии за да добијат биосинтетички материјали и енергија. Ова е различно од општото обновување на хранливите материи од мртвите микроорганизми, а исто така се разликува и од паразитските интеракции, во кои бактериите формираат блиски односи со својот домаќин без да го убијат. Предаторските бактерии еволуирале различни животни циклуси за да ги искористат изобилните извори на храна во нишите каде што се наоѓаат (како што се морските живеалишта). Тие се таксономски разновидна група, кои се поврзани само со нивниот единствен животен циклус на стерилизација1. Примери на грабливи бактерии се пронајдени во неколку различни фили, вклучувајќи: Протеобактерии, Бактероиди и Хлорела.3. Сепак, најдобро проучени грабливи бактерии се Bdellovibrio и Bdellovibrio и слични организми (BALOs4). Предаторските бактерии се ветувачки извор на нови биолошки активни соединенија и антибактериски агенси5.
Се верува дека грабливите бактерии ја подобруваат микробната разновидност и имаат позитивно влијание врз здравјето, продуктивноста и стабилноста на екосистемот6. И покрај овие позитивни атрибути, има малку студии за нови грабливи бактерии поради тешкотијата на одгледување бактерии и потребата внимателно да се набљудуваат клеточните интеракции за да се разберат нивните сложени животни циклуси. Оваа информација не е лесно да се добие од компјутерска анализа.
Во ера на зголемена антимикробна отпорност, се проучуваат нови стратегии за таргетирање на бактериски патогени, како што е употребата на бактериофаги и предаторски бактерии7,8. Бактериите ASxL5T беа изолирани во 2019 година со помош на технологија за изолација на фаг од кравји измет собрани од Центарот за млечни производи на Универзитетот во Нотингем, Нотингемшир. Целта на истражувањето е да се изолираат организми со потенцијал како биолошки контролни агенси. Campylobacter hyointestinalis е зоонотичен патоген, кој се повеќе се поврзува со цревни болести кај луѓето10. Тоа е сеприсутно во серумот и се користи како цел домаќин.
Бактеријата ASxL5T беше изолирана од говедско желе бидејќи беше забележано дека наслагите што ги формира на тревникот на C. hyointestinalis се слични на оние што ги создаваат бактериофагите. Ова е неочекуван наод, бидејќи дел од процесот на изолација на фагот вклучува филтрирање преку филтер од 0,2 µm, кој е дизајниран да ги отстранува бактериските клетки. Микроскопското испитување на материјалот извлечен од плочата откри дека малите грам-негативни криви бактерии во облик на прачка не акумулирале полихидроксибутират (PHB). Асептичната култура независна од клетките на плен се реализира на богат цврст медиум (како што е инфузиониот агар на мозокот (BHI) и крвен агар (BA)), а неговиот раст е слаб. Се добива по подобрување на субкултурата со тежок инокулум. Расте подеднакво добро под микроаеробни (7% v/v кислород) и атмосферски кислородни услови, но не и во анаеробна атмосфера. По 72 часа, дијаметарот на колонијата беше многу мал, достигнувајќи 2 мм, а беше беж, проѕирен, тркалезен, конвексен и сјаен. Стандардното биохемиско тестирање е отежнато бидејќи ASxL5T не може да се одгледува со сигурност во течни подлоги, што сугерира дека може да се потпира на сложениот животен циклус на формирање на биофилм. Сепак, суспензијата на плочата покажа дека ASxL5T е аеробен, позитивен на оксидаза и каталаза и може да толерира 5% NaCl. ASxL5T е отпорен на 10 µg стрептомицин, но е чувствителен на сите други тестирани антибиотици. Бактериските клетки ASxL5T беа испитани со ТЕМ (Слика 1). Кога се одгледуваат без плен клетки на BA, ASxL5T клетките се мали Campylobacter, со просечна должина од 1,63 μm (± 0,4), ширина од 0,37 μm (± 0,08) и еден долг (до 5 μm) пол. Сексуални флагели. Се чини дека приближно 1,6% од ќелиите имаат ширина помала од 0,2 μm, што ќе овозможи премин низ уредот за филтрирање. Беше забележано необично структурно продолжување на врвот на некои ќелии, слично на облекување (латински cucullus) (видете ги стрелките во 1D, E, G). Се чини дека ова е составено од вишок надворешна мембрана, што може да се должи на брзото намалување на големината на периплазматската обвивка, додека надворешната мембрана останува недопрена, покажувајќи „лабав“ изглед. Одгледувањето на ASxL5T во отсуство на хранливи материи (во PBS) долго време на 4°C резултираше со повеќето (но не сите) клетки кои покажуваат морфологија на кокусот (Слика 1C). Кога ASxL5T расте со Campylobacter jejuni како плен 48 часа, просечната големина на клетките е значително подолга и потесна од клетките одгледувани без домаќин (Табела 1 и Слика 1E). Спротивно на тоа, кога ASxL5T расте со E. coli како плен за 48 часа, просечната големина на клетката е подолга и поширока отколку кога расте без плен (Табела 1), а должината на клетката е променлива, обично покажувајќи филаментозни (слика 1F). Кога биле инкубирани со Campylobacter jejuni или E. coli како плен 48 часа, клетките ASxL5T воопшто не покажале флагели. Табела 1 ги сумира набљудувањата на промените во големината на ќелијата врз основа на присуството, отсуството и видот на плен на ASxL5T.
TEM приказ на ASx5LT: (A) ASx5LT покажува долг камшик; (Б) типична батерија ASx5LT; (В) ASx5LT клетки од коки по долга инкубација без хранливи материи; (Г) група ASx5LT клетки покажуваат абнормалност (E) ASx5LT клеточната група инкубирана со плен Campylobacter покажа зголемена должина на клетките во споредба со оние без раст на плен (D), исто така, покажа апикална структура; (F) Големи филаментозни флагели, ASx5LT клетки, по инкубација со плен E. coli; (Г) Единечна ASx5LT клетка по инкубација со E. coli, која покажува необична структура на горниот дел. Лентата претставува 1 μm.
Утврдувањето на генската секвенца 16S rRNA (пристапен број MT636545.1) овозможува пребарување на базата на податоци да воспостават секвенци слични на оние од класата Gammaproteobacteria и се најблиску до морските бактерии во семејството на морските спирилум (Слика 2) и се членови на родот Thalassolituus Најблискиот роднина на морскиот бацил. Секвенцата на генот 16S rRNA е јасно различна од грабливите бактерии кои припаѓаат на семејството Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria). Парните споредби на B. bacteriovorus HD100T (тип сој, DSM 50701) и B. bacteriovorus DM11A беа 48,4% и 47,7%, а за B. exovorus JSS беше 46,7%. Бактериите ASxL5T имаат 3 копии од генот 16S rRNA, од кои две се идентични еден со друг, а третата е оддалечена 3 бази. Два други грабливи бактериски изолати (ASx5S и ASx5O; 16S rRNA генски броеви за пристап се MT636546.1 и MT636547.1, соодветно) со слични морфолошки и фенотипски карактеристики од иста локација не се исти, но се разликуваат од ASxL5T и некултурни секвенците на базата на податоци се групирани заедно со другите родови во Oceanospiillaceae (Слика 2). Целата геномска секвенца на ASxL5T е одредена и зачувана во базата на податоци на NCBI, а пристапниот број е CP046056. Геномот на ASxL5T се состои од кружен хромозом од 2.831.152 bp со однос G + C од 56,1%. Геномската секвенца содржи 2653 CDS (вкупно), од кои 2567 се предвидува дека ќе кодираат протеини, од кои 1596 може да се доделат како наводни функции (60,2%). Геномот содржи 67 гени за кодирање на РНК, вклучувајќи 9 rRNA (по 3 за 5S, 16S и 23S) и 57 tRNA. Геномските карактеристики на ASxL5T беа споредени со достапните геноми на соеви од најблискиот релативен тип идентификувани од генската секвенца 16S rRNA (Табела 2). Користете идентитет на аминокиселини (AAI) за да ги споредите сите достапни геноми на Thalassolituus со ASxL5T. Најблиската достапна (нецелосна) геномска секвенца одредена од AAI е Thalassolituus sp. C2-1 (додадете NZ_VNIL01000001). Овој вид беше изолиран од длабокоморските седименти на Маријанскиот ров, но моментално нема фенотипски информации за овој вид за споредба. Во споредба со 2,82 Mb на ASxL5T, геномот на организмот е поголем со 4,36 Mb. Просечната големина на геномот на морските спирохети е околу 4,16 Mb (± 1,1; n = 92 комплетни референтни геноми испитани од https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), така што геномот на ASxL5T е во согласност со ред Во споредба со другите членови, тој е прилично мал. Користете го GToTree 1.5.54 за да генерирате проценето филогенетско стебло за максимална веројатност засновано на геном (Слика 3А), користејќи ги усогласените и поврзаните аминокиселински секвенци од 172 гени од една копија специфични за Гамапротеобактерии 11,12,13,14,15,16, 17,18. Анализата покажа дека е тесно поврзана со Thalassolituus, Bacterial Plane и Marine Bacterium. Сепак, овие податоци покажуваат дека ASxL5T е различен од неговите роднини во морската спирулина и податоците за неговата геномска секвенца се достапни.
Филогенетското дрво што ја користи генската секвенца 16S rRNA ја нагласува позицијата на соевите ASxL5T, ASxO5 и ASxS5 (со црева) во однос на некултивираните и морските бактерии во морските Spirulinaceae. Пристапниот број на Genbank го следи името на сојот во загради. Користете ClustalW за порамнување на секвенците и користете метод на максимална веројатност и модел Тамура-Неи за да заклучите филогенетски врски и изведете 1000 водени репликации во програмата MEGA X. Бројот на гранката покажува дека вредноста на водената копија е поголема од 50%. Ешерихија коли U/541T беше користена како надворешна група.
(А) Филогенетско стебло засновано на геномот, што ја покажува врската помеѓу морската бактерија Spirospiraceae ASxL5T и нејзините блиски роднини, E. coli U 5/41T како надворешна група. (Б) Во споредба со T. oleivorans MIL-1T, функционалната категорија на дистрибуција на гените е предвидена врз основа на кластерот на ортологната група (COG) на протеинот ASx5LT. Сликата лево го покажува бројот на гени во секоја функционална категорија COG во секој геном. Графиконот од десната страна го прикажува процентот на геномите содржани во секоја функционална група COG. (В) Во споредба со T. oleiverans MIL-1T, анализата на комплетната модуларна патека на KEGG (Кјото енциклопедија на гени и геноми) на ASxL5T.
Користењето на базата на податоци KEGG за испитување на компонентите гени присутни во геномот ASxL5T го откри типичниот метаболички пат на аеробната гама Proteus. ASxL5T содржи вкупно 75 гени доделени на бактериски моторни протеини, вклучувајќи гени вклучени во хемотаксата, склопување на флагели и тип IV фимбриумски систем. Во последната категорија, 9 од 10 гени се одговорни за грчевито движење на низа други организми. Геномот на ASxL5T содржи комплетен биосинтетички пат на тетрахидропиримидин кој учествува во заштитниот одговор на осмотскиот стрес20, како што се очекуваше за халофилите. Геномот, исто така, содржи многу целосни патишта за кофактори и витамини, вклучително и патишта за синтеза на рибофлавин. Иако генот на алкан 1-монооксигеназа (alkB2) е присутен во ASxL5T, патот на искористување на јаглеводородите не е целосен. Во геномската секвенца на ASxL5T, хомолозите на гените идентификувани како главно одговорни за разградувањето на јаглеводородите во T. oleiverans MIL-1T21, како што се TOL_2658 (alkB) и TOL_2772 (алкохол дехидрогеназа) очигледно се отсутни. Слика 3Б ја прикажува споредбата на дистрибуцијата на гените во категоријата COG помеѓу ASxL5T и маслиновото масло MIL-1T. Севкупно, помалиот геном ASxL5T содржи пропорционално помалку гени од секоја категорија COG во споредба со поголемиот поврзан геном. Кога бројот на гени во секоја функционална категорија е изразен како процент од геномот, се забележуваат разлики во процентот на гени во категориите на транслација, рибозомална структура и биогенеза, како и во категориите на функции за производство и конверзија на енергија, кои го сочинуваат поголемиот ASxL5T геном Процентот се споредува со истата група присутна во геномот на T. oleiverans MIL-1T. Спротивно на тоа, во споредба со геномот ASxL5T, T. oleivorans MIL-1T има поголем процент на гени во категориите на репликација, рекомбинација и поправка и транскрипција. Интересно, најголемата разлика во содржината на секоја функционална категорија од двата генома е бројот на непознати гени присутни во ASxL5T (Слика 3Б). Извршена е анализа на збогатување на KEGG модулите, каде што секој KEGG модул претставува збир на рачно дефинирани функционални единици за анотација и биолошко толкување на податоците од геномската секвенца. Споредбата на дистрибуцијата на гените во комплетната патека на KOG-модулот на ASxL5T и маслиново MIL-1T е прикажана на Слика 3В. Оваа анализа покажува дека иако ASxL5T има целосен метаболички пат на сулфур и азот, T. oleiverans MIL-1T нема. Спротивно на тоа, T. oleiverans MIL-1T има целосен метаболички пат на цистеин и метионин, но тој е нецелосен во ASxL5T. Затоа, ASxL5T има карактеристичен модул за асимилација на сулфат (дефиниран како збир на гени кои можат да се користат како фенотипски маркери, како што се метаболички капацитет или патогеност; https://www.genome.jp/kegg/module.html) Во Т олеиверни MIL-1T. Споредувањето на содржината на генот на ASxL5T со списокот на гени што укажуваат на предаторски начин на живот е неубедливо. Иако генот waaL што ја кодира лигазата поврзана со полисахаридот на O антигенот до јадрото е присутен во геномот ASxL5T (но е вообичаен кај многу Грам-негативни бактерии), гените на триптофан 2,3-диоксигеназа (TDO) може да вклучуваат 60 амино кисели области кои најчесто се наоѓаат во предаторски бактерии кои не се присутни. Не постојат други предаторски карактеристични гени во геномот ASxL5T, вклучувајќи ги и оние кои ги кодираат ензимите вклучени во биосинтезата на изопреноиди во мевалонатната патека. Забележете дека не постои транскрипциски регулаторен ген gntR во испитуваната група предатори, но три гени слични на gntR може да се идентификуваат во ASxL5T.
Фенотипските карактеристики на ASxL5T се сумирани во Табела 3 и се споредуваат со фенотипските карактеристики на сродните родови 23, 24, 25, 26 и 27 пријавени во литературата. Изолатите од T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis и Oceanobacter kriegii се активни, толерантни на сол, позитивни на оксидаза тела во облик на прачка, но речиси немаат други фенотипски карактеристики со ASxL5T. Просечната pH вредност на океанот е 8,1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77), што се рефлектира во T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis и O. криегии. ASxL5T е погоден за поголем опсег на pH (4-9) типичен за неморските видови. Фенотипски карактеристики на Thalassolituus sp. C2-1. Непознат. Температурниот опсег на раст на ASxL5T е генерално поширок од оној на морските соеви (4–42 °C), иако некои, но не сите изолати на T. marinus се отпорни на топлина. Неможноста да се одгледува ASxL5T во медиум за супа спречи понатамошна фенотипска карактеризација. Користете API 20E за тестирање на материјалите изгребани од BA плочата, ONPG, аргинин дихидролаза, лизин декарбоксилаза, орнитин декарбоксилаза, употреба на цитрати, уреаза, триптофан деаминаза, ензим за хидролиза на желатин, сите резултати од тестот беа негативни, но немаше индолин и H2S, беа произведени. Неферментираните јаглехидрати вклучуваат: гликоза, маноза, инозитол, сорбитол, рамноза, сахароза, мелибиоза, амигдалин и арабиноза. Во споредба со објавените поврзани референтни соеви, профилот на клеточните масни киселини на сојот ASxL5T е прикажан во Табела 4. Главните клеточни масни киселини се C16:1ω6c и/или C16:1ω7c, C16:0 и C18:1ω9. Постојат и хидрокси масни киселини C12:0 3-OH и C10:0 3-OH. Односот на C16:0 во ASxL5T е повисок од пријавената вредност на сродните родови. Спротивно на тоа, во споредба со пријавениот T. marinus IMCC1826TT, односот на C18:1ω7c и/или C18:1ω6c во ASxL5T е намален. oleivorans MIL-1T и O. kriegii DSM 6294T, но не се откриени во B. sanyensis KCTC 32220T. Споредувањето на профилите на масни киселини на ASxL5T и ASxLS откри суптилни разлики во количината на поединечни масни киселини помеѓу двата соеви, кои се во согласност со геномската ДНК секвенца од истиот вид. Не беа откриени честички од поли-3-хидроксибутират (PHB) користејќи го Суданскиот црн тест.
Активноста на предаторството на бактериите ASxL5T беше проучувана за да се одреди опсегот на плен. Оваа бактерија може да формира плаки на видовите Campylobacter, вклучувајќи: Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T; Ешерихија коли NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; C лари NCTC 11458 и C. upsaliensis NCTC 11541T. Користете ги културите наведени во делот за одредување опсег на домаќин на методот за тестирање на поширок опсег на грам-негативни и грам-позитивни бактерии. Резултатите покажуваат дека ASxL5T може да се користи и во Escherichia coli NCTC 86 и Citrobacter freundii NCTC 9750T. Наслагите формирани на Klebsiella oxytoca 11466. Интеракцијата TEM со E. coli NCTC 86 е прикажана на Слика 4A-D, а интеракцијата со Campylobacter jejuni PT14 и Campylobacter suis S12 е прикажана на Слика 4E-H средината. Механизмот за напад се чини дека е различен помеѓу тестираните типови на плен, со една или повеќе E. coli клетки прикачени на секоја ASxL5T клетка и позиционирани странично по должината на продолжената ќелија пред адсорпцијата. Спротивно на тоа, се чини дека ASxL5T се прикачува на Campylobacter преку една точка на контакт, обично во контакт со врвот на клетката предатор и во близина на врвот на клетката Campylobacter (Слика 4H).
ТЕМ што ја покажува интеракцијата помеѓу ASx5LT и плен: (АД) и плен E. coli; (EH) и C. jejuni плен. (А) Типична ASx5LT клетка поврзана со единечна E. coli (EC) ќелија; (Б) Филаментозен ASx5LT прикачен на една EC клетка; (В) Филаментозна ASx5LT клетка поврзана со повеќе EC ќелии; (Г) Прикачување Помали ASx5LT клетки на една клетка на E. coli (EC); (Д) единечна ASx5LT клетка поврзана со клетка Campylobacter jejuni (CJ); (F) ASx5LT ги напаѓа клетките на C. hyointestinalis (CH); (Г) две Една ASx5LT ќелија нападна ќелија CJ; (H) Приказ одблиску на точката за прицврстување ASx5LT, во близина на врвот на ќелијата CJ (бар 0,2 μm). Лентата претставува 1 μm во (A–G).
Предаторските бактерии еволуирале за да ги искористат изобилните извори на плен. Очигледно, тие се широко присутни во многу различни средини. Поради тесната големина на членовите на популацијата, можно е да се изолираат бактериите ASxL5T од кашеста маса користејќи го методот на сепарација на фагот. Геномската релевантност на ASxL5T за членовите на семејството на морски бактерии oceanospirillaceae е изненадувачка, иако организмот е толерантен на сол и може да расте на средина што содржи 5% сол. Анализата на квалитетот на водата на кашеста маса покажа дека содржината на натриум хлорид е помала од 0,1%. Затоа, калта е далеку од морската средина - и географски и хемиски. Присуството на три поврзани, но различни изолати од истиот извор дава доказ дека овие предатори напредуваат во оваа неморска средина. Покрај тоа, анализата на микробиомот (датотеки со податоци достапни од https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990) покажа дека истата генска секвенца 16S rRNA се наоѓа во првите 50 најзастапени оперативни таксони (OTU ) Во неколку интервали на земање мостри од калта. Во базата на податоци Genbank беа пронајдени неколку некултурни бактерии, кои имаат генски секвенци од 16S rRNA слични на бактериите ASxL5T. Овие секвенци, заедно со секвенците на ASxL5T, ASxS5 и ASxO5, се чини дека претставуваат различни клади одвоени од Thalassolituus и Oceanobacter (Слика 2). Три вида некултурни бактерии (GQ921362, GQ921357 и GQ921396) беа изолирани од водата на пукнатините на длабочина од 1,3 километри во јужноафриканскиот рудник за злато во 2009 година, а другите два (DQ256320 и DQ337006 од Јужна Африка) во 2005 година). 16S rRNA генската секвенца најблиску поврзана со ASxL5T е дел од генската секвенца 16S rRNA добиена од културата на збогатување на песочни седименти добиени од плажите на северна Франција во 2006 година (пристапен број AM29240828). Друга тесно поврзана генска секвенца на 16S rRNA од некултурната бактерија HQ183822.1 е добиена од резервоар за собирање исцеден од општинска депонија во Кина. Очигледно, бактериите ASxL5T не се многу репрезентативни во таксономските бази на податоци, но овие секвенци од некултурни бактерии веројатно претставуваат организми слични на ASxL5T, кои се дистрибуирани низ целиот свет, обично во предизвикувачки средини. Од целата филогенетска анализа на геномот, најблизок однос на ASxL5T е Thalassolituus sp. C2-1, T. marinus, T. oleivorans. И O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus е член на морската задолжителна бактерија за фрагментација на јаглеводороди (OHCB), која е широко распространета во морските и копнените средини и обично станува доминантна по инцидентите со јаглеводородно загадување30,31. Морските бактерии не се членови на групата OHCB, туку се изолирани од морската средина.
Фенотипските податоци покажуваат дека ASxL5T е нов вид и член на претходно непризнаен род од фамилијата на морските spirospiraceae. Во моментов не постои јасен стандард за класификација на новоизолираните соеви во нов род. Направени се обиди да се утврдат универзалните граници на родовите, на пример, врз основа на процентот на геномот на конзервативен протеин (POCP), се препорачува граничната вредност да биде 50% идентична со референтниот сој33. Други предлагаат да се користат вредностите на AAI, кои имаат предности во однос на POCP бидејќи може да се добијат од нецелосни геноми34. Авторот верува дека ако вредноста на AAI е помала од 74% во споредба со моделот сој на моделскиот вид, сојот е претставник на различен род. Моделот род во морските spirillaceae е морски спирилум, а моделот сој е O. linum ATCC 11336T. Вредноста на AAI помеѓу ASxL5T и O. linum ATCC 11336T е 54,34%, а вредноста на AAI помеѓу ASxL5T и T. oleivorans MIL-1T (видови од типот) е 67,61%, што покажува дека ASxL5T претставува нов род различен од Thalas. Користејќи ја генската секвенца 16S rRNA како стандард за класификација, предложената граница за разграничување на родот е 94,5%35. ASxL5T може да се смести во родот Thalassolituus, покажувајќи 95,03% идентитет на секвенцата на 16S rRNA со T. oleivorans MIL-1T и 96,17%. маринус IMCC1826T. Сепак, ќе биде сместен и во родот Bacteroides кој има 94,64% идентитет на генот 16S rRNA со B. sanyensis NV9, што покажува дека употребата на еден ген како што е генот 16S rRNA може да доведе до произволна класификација и доделување. Друг предложен метод користи ANI и оценка за усогласување на геномот (AF) за да го испита групирањето на точките на податоци од сите типови и нетипови соеви на постоечките родови. Авторот препорачува комбинирање на границата на родот со точката на флексија на проценетиот род специфичен за таксони што се анализираат. Меѓутоа, ако нема доволно целосни геномски секвенци од изолатите на Thalassolituus, невозможно е да се одреди дали ASxL5T припаѓа на родот Thalassolituus со овој метод. Поради ограничената достапност на целосни геномски секвенци за анализа, целото филогенетско стебло на геномот треба да се толкува со претпазливост. Второ, методите за споредба на целиот геном не можат да објаснат значителни разлики во големината на споредените геноми. Тие ја измериле сличноста на зачуваните јадрени гени со една копија помеѓу сродните родови, но не го земале предвид големиот број гени кои не се присутни во многу помалиот геном на ASxL5T. Очигледно, ASxL5T и групите како Thalassolituus, Oceanobacter и Bacterioplanes имаат заеднички предок, но еволуцијата тргна по поинаков пат, што доведе до намалување на геномот, што може да се прилагоди на предаторски начин на живот. Ова е за разлика од T. oleivorans MIL-1T, кој е 28% поголем и еволуирал под различни еколошки притисоци за да користи јаглеводороди23,30. Може да се направи интересна споредба со задолжителните интрацелуларни паразити и симбионти, како што се Рикеција, Кламидија и Бухнера. Нивната големина на геном е околу 1 Mb. Способноста да се искористат метаболитите на клетката домаќин доведува до губење на гените, па затоа претрпе значителна еволутивна геномска деградација. Еволутивните промени од морски хемиски хранливи организми до предаторски начин на живот може да резултираат со слично намалување на големината на геномот. COG и KEGG анализата го нагласува бројот на гени кои се користат за специфични функции и глобалните разлики во геномските патишта помеѓу ASxL5T и T. oleivorans MIL-1T, кои не се должат на широката достапност на мобилни генетски елементи. Разликата во односот G + C на целиот геном на ASxL5T е 56,1%, а на T. oleivorans MIL-1T е 46,6%, што исто така укажува дека тој е сегрегиран.
Испитувањето на содржината на кодирање на геномот ASxL5T обезбедува функционални увиди во фенотипските карактеристики. Присуството на гени кои кодираат фимбрии од тип IV (Tfp) е од особен интерес бидејќи тие промовираат движење на клетките, наречено социјално лизгање или конвулзии, без флагели на површината. Според извештаите, Tfp има и други функции, вклучувајќи предација, патогенеза, формирање на биофилм, природно навлегување на ДНК, автоматска агрегација и развој на клетките38. Геномот ASxL5T содржи 18 гени кои кодираат дигуанилат циклаза (ензим кој ја катализира конверзијата на 2 гванозин трифосфат во гванозин 2 фосфат и цикличен diGMP) и 6 гени кои го кодираат соодветниот дигуанилат циклаза фосфат. Генот за естераза (ја катализира разградувањето на цикличниот ди-GMP до гванозин монофосфат) е интересен затоа што цикл-ди-GMP е важен втор гласник вклучен во развојот и сепарацијата на биофилмот, движењето, врзувањето на клетките и вирулентноста 39, 40 во процесот. Исто така, треба да се забележи дека кај Bdellovibrio bacteriovorus, цикличниот двоен GMP се покажа дека ја контролира транзицијата помеѓу слободниот живот и предаторскиот начин на живот41.
Повеќето истражувања за грабливи бактерии се фокусираа на Bdellovibrio, организми слични на Bdellovibrio и видови Myxococcus. Овие и други познати примери на грабливи бактерии формираат разновидна група. И покрај оваа разновидност, идентификувани се збир на карактеристични протеински семејства кои ги рефлектираат фенотиповите на 11 познати предаторски бактерии3,22. Сепак, идентификувани се само гени кои кодираат O антиген лигаза (waaL), што е особено честа појава кај Грам-негативните бактерии. Оваа форма на анализа не е корисна за означување на ASxL5T како предатор, веројатно затоа што користи нова стратегија за напад. Достапноста на поразновидни предаторски бактериски геноми ќе помогне да се развијат анализи со попрецизна резолуција што ќе ги земе предвид доказите за функционалните и еколошките разлики помеѓу членовите на групата. Примери на грабливи бактерии кои не се вклучени во оваа анализа вклучуваат членови на Cupriavidus necator42 и Bradymonabacteria43, бидејќи додека истражувачите истражуваат различни микробни заедници, се воспоставуваат повеќе предаторски таксони.
Најзабележителната карактеристика на бактериите ASxL5T снимени со TEM слика е нејзината единствена и флексибилна морфологија, која може да промовира интеракција со бактериите плен. Типот на забележана интеракција е различен од другите грабливи бактерии и не е претходно откриен или пријавен. Предложениот ASxL5T предаторски животен циклус е прикажан на слика 5. Во литературата има неколку примери со слични апикални структури како што известуваме овде, но овие примери вклучуваат Terasakiispira papahanaumokuakeensis, морска бактерија спирилум со повремено зголемување на врвот 44 и Alphabacteriapusillarateo , порано припаѓале на родот Oceanospillum, изложен на таканаречениот „поларен филм“ 45. Формите на коки често се забележани во постарите култури, особено за бактериите со заоблени форми, како што се Vibrio, Campylobacter и Helicobacter 46, 47, 48, кои може да претставуваат деградирана состојба . Потребна е дополнителна работа за да се разјасни прецизниот животен циклус на бактериите ASxL5T. Да се ​​утврди како фаќа и плен, и дали неговиот геном шифрира биолошки активни соединенија кои можат да се користат за медицински или биотехнолошки цели.
Опис на Venatorbacter gen. Ноември Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. е составен од венатори од L. n. venator, 'ловец' и гр. n. bacter, 'а прачка'. Venatorbacter, 'ловечка прачка' Клетките се аеробни, толерантни на сол, заоблени дамки од грамови, а активноста на каталазата и оксидазата не е Се акумулира во температурен опсег од 4 до 42 °C. С16:0 и С18:1ω9 ; хидрокси масни киселини Содржината на ДНК G + C е 56,1 мол семејството.
Опис на Venatorbacter cucullus sp. Ноември Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus значи облекање).
Дополнително, описната карактеристика на овој род е тоа што кога се одгледуваат на BA или BHI, клетките се долги 1,63 µm и широки 0,37 µm. Колониите на BHI агар се многу мали, достигнувајќи дијаметар од 2 mm по 72 часа. Тие се беж, проѕирни, тркалезни, конвексни и сјајни. Припадниците на овој вид можат да користат ешерихија коли и клебсиела. Campylobacter и неколку други грам-негативни бактерии служат како плен.
Типичниот сој ASxL5T беше изолиран од говедско млеко во Нотингемшир, ОК, и депониран во Националната колекција на типови култури (Велика Британија): пристапен број NCTC 14397 и холандска колекција за бактериска култура (NCCB) пристапен број NCCB 100775. Целосната геномска секвенца на ASxL е депониран во Genbank според додавањето на CP046056.
Бактериите ASxL5T беа изолирани од говедско млеко користејќи технологија за изолација на фаг9,49. Кашеста маса беше разредена 1:9 (w/v) во SM пуфер (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,1 M NaCl, 8 mM MgSO4.7H2O и 0,01% желатин; Sigma Aldrich, Gillingham, UK), потоа инкубирајте на 4°C за 24 часа, полека ротирајќи за да се излупат предатори во тампон. Суспензијата се центрифугира на 3000 g за 3 минути. Супернатантот беше собран и центрифугиран на 13.000 g по втор пат за 5 минути. Супернатантот потоа помина низ мембрански филтер од 0,45 µm (Minisart; Sartorius, Gottingen, Германија) и мембрански филтер од 0,2 µm (Minisart) за да се отстранат сите преостанати бактериски клетки. ASxL5T може да ги помине овие филтри. Мек агар тревник од Campylobacter enterosus S12 (NCBI пристапен број CP040464) од истата кашеста маса беше подготвен со користење на стандардни техники. Филтрираната кашеста маса беше дистрибуирана на секоја од овие клеточни плочи домаќини во капки од 10 µl во три примероци и се остава да се исуши. Плочата беше инкубирана во микроаерофилен резервоар на 37°C 48 часа под микроаеробни услови (5% O2, 5% H2, 10% CO2 и 80% N2). Добиената видлива плоча беше екстрахирана во SM пуфер и пренесена на свежиот тревник на C. hyointestinalis S12 за понатамошно размножување на лизираните организми. Откако ќе се утврди дека бактериите се причина за литичката плоча, а не фагот, обидете се да го развиете организмот независно од домаќинот и дополнително да го карактеризирате. Аеробната култура беше изведена на 37 °C со 5% v/v дефибринирана коњска крв (TCS Biosciences Lt, Buckingham, UK, додаток). Според упатствата на Националниот комитет за клинички стандарди, методот на дифузија на дискот се користи за тестирање на антибактериска чувствителност. BHI агарот беше култивиран на 37 °C користејќи диск кој ги содржи следните антибиотици (Oxoid) за аеробна култура: амоксицилин и клавуланска киселина 30 µg; цефотаксим 30 μg; стрептомицин 10 μg; ципрофлоксацин 5 μg; Цефтазидим 30 µg Налидиксична киселина 30 µg; Имипенем 10 µg; Азитромицин 15 μg; Хлорамфеникол 30 μg; Цефокситин 30 μg; Тетрациклин 30 μg; Нитрофурантоин 300 μg; Азтреонам 30 μg; Ампицилин 10 µg; Цефподоксим 10 µg; Триметоприм-Сулфаметоксазол 25 µg. Толеранцијата на сол беше воспоставена со аеробна инкубација на BHI агар плочи на 37 °C. Дополнителен NaCl беше додаден на плочите со агар BHI за да се обезбеди опсег на концентрација до 10% w/v. Опсегот на pH се одредува со аеробна култура на BHI-агар плочи на 37°C, каде што опсегот на pH е прилагоден помеѓу 4 и 9 со стерилен HCl или стерилен NaOH, а целната pH вредност се проверува пред да се истури плочата. За анализа на клеточните масни киселини, ASxL5T беше култивиран на BHI агар 3 дена и аеробен на 37 °C. Според стандардниот протокол MIDI (Sherlock Microbial Identification System, верзија 6.10) на FERA Science Ltd, (Јорк, ОК), клеточните масни киселини беа екстрахирани, подготвени и анализирани.
За TEM, ASxL5T се култивираше аеробно со рамномерно ширење на BA на 37°C во тек на 24 часа, а потоа се собираше во 1 ml од 3% (v/v) глутаралдехид во 0,1 M какодилатен пуфер на собна температура Фиксирајте 1 час, а потоа центрифугирајте на 10.000 g за 3 минути. Потоа нежно повторно суспендирајте го пелетот во 600 μl 0,1 M какодилатен пуфер. Префрлете ја фиксираната суспензија ASxL5T во Formvar/carbon филм на бакарна решетка од 200 mesh. Бактериите беа обоени со 0,5% (w/v) уранил ацетат за 1 минута и испитани со TEM со помош на микроскоп TEI Tecnai G2 12 Biotwin. Како што споменавме погоре, комбинирајте ист број плен и предатор во супа од NZCYM (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) и инкубирајте 48 часа под микроаеробни услови на Campylobacter или Campylobacter на 37°C, Интеракцијата на предатор и плен бил прегледан и од ТЕМ. Аеробни услови за ешерихија коли. Независно испитајте плен и грабливи бактерии за да ги одредите какви било промени во клеточната морфологија поради предаторство. Суданската црна метода беше користена за оптичка микроскопија на акумулацијата на PHB.
Одгледувајте ги културите ASxL5T преку ноќ со размачкање на растот на BHI или BA плочите со стерилен брис. Соберете ASxL5T клетки и суспендирајте ги во MRD (CM0733, Oxoid), а потоа ставете ги на 4°C 7 дена за да ги изгладнете клетките. Референтната NCTC или лабораториска бактериска култура беше инокулирана во супа од BHI или хранлива супа бр. 2 (CM007, Oxoid), инкубирана преку ноќ, центрифугирана на 13.000 g и повторно суспендирана во MRD додека OD600 не биде 0,4. Култура: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, Klebsiella,TCU114oxy 10817, Listeria Специјални бактерии NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, Rhodococcus подморски хамбургер NCTC 1621T, NCTC 1621T, Salmonellage57 тест NCTC 10861, Staphylococcus aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. Домаќинот Campylobacter беше микроаеробно инкубиран на BA плочи и на 37YM°C суспендирани на 37YM°C. Тестирани домаќини на Campylobacter се: C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 111485 C. jejuni PT14, C... Соберете клетки во MRD, центрифугирајте на 13.000 g и повторно суспендирајте во MRD додека OD600 не биде 0,4. Додадете дел од 0,5 ml суспензија во 5 ml стопен NZCYM горен агар (0,6% агар) и истурете го на долната плоча од 1,2% NZCYM. По стврднувањето и сушењето, сериски разредениот ASxL5T беше дистрибуиран како капки од 20 µl на секоја табла за тревник во три примероци. Температурата и атмосферата на културата зависат од барањата на испитуваните бактерии.
Користете GenElute™ бактериска геномска ДНК комплет (Sigma Aldridge) за да подготвите ДНК од бактериски изолати. Беа користени стандардни методи за PCR засилување на генот 16S rRNA и определување на секвенцата на производот со користење на хемијата за завршување на бојата (Eurofins Value Read Service, Германија). Користете ја програмата BLAST-N за да ги споредите овие секвенци со други генски секвенци на 16S rRNA за да ги идентификувате и соберете тесно поврзаните видови. Тие се порамнети со помош на ClustalW во програмата MEGA X. Филогенетското стебло беше реконструирано со помош на MEGA X користејќи го методот на максимална веројатност заснован на моделот Тамура-Неи, со 1000 водени копии54. Користете го комплетот PureLink™ Genomic DNA (Fisher Scientific, Loughborough, UK) за да извлечете ДНК за секвенционирање на целиот геном. Геномската секвенца на ASxL5T беше одредена со помош на комбинацијата Illumina MiSeq, која се состои од 250 bp двократни читања составени од библиотека подготвена со помош на комплетот за означување Nextera и долги отчитувања од 2 до 20 kb од платформата PacBio. Истражувачки капацитет за секвенционирање на ДНК на геномика на Универзитетот во Сембија. Геномот беше составен со користење на CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen, Aarhus, Данска). Културите ASxL5T се депонирани во Националната колекција на типови култури (Велика Британија) и колекцијата за бактериска култура во Холандија (NCCB). Геномите на сродните организми кои се користат за споредба се: Thalassolituus oleivorans MIL-1T (пристапен број HF680312, комплетен); Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (пристапен број BMYY01000001, нецелосен); Oceanobacter kriegii DSM 6294T (пристапен број NZ_AUGV00000000, нецелосен); Marinamonas заедница DSM 5604T (додаден ASM436330v1, нецелосен), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (додаден MTSD02000001, нецелосен) и Thalassolituus sp. C2-1 (додадете NZ_VNIL01000001, нецелосно). Користете го JGI Genome Portal36 на https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page= за да го одредите резултатот за усогласување (AF) и просечниот идентитет на нуклеинска киселина (ANI). Во парови. Методот на Rodriguez-R & Konstantinidis55 беше користен за одредување на идентитетот на аминокиселините (AAI). Користете GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 за да генерирате проценета максимална веројатност за филогенетско дрво. Влезниот геном што го претставува достапниот референтен геном е избран од референтните родови идентификувани како поврзани со ASxL5T од филогенијата на 16S rRNA. Забележано е дрвото користејќи ја интерактивната онлајн алатка дрвото на животот (https://itol.embl.de/). Функционалната прибелешка и анализа на геномот ASxL5T се врши со помош на онлајн алатката BlastKOALA KEGG со помош на дистрибуцијата за збогатување на модулот KEGG (Кјото енциклопедија на гени и геном). Распределбата на категориите COG (ортологни групи) се одредува со помош на онлајн алатката eggNOG-mapper.
Pérez, J., Moraleda-Muñoz, A., Marcos-Torres, FJ и Muñoz-Dorado, J. Бактериска грабеж: 75 години и продолжува! . животната средина. микроорганизам. 18, 766-779 (2016).
Linares-Otoya, L. итн. Разновидност и антибактериски потенцијал на грабливи бактерии на перуанското крајбрежје. Март лекови. 15. E308. https://doi.org/10.3390/md15100308 (2017).
Пастернак, З. и сор. Преку нивните гени ќе ги разберете: геномските карактеристики на предаторските бактерии. ISME J. 7, 756-769 (2013).
Sockett, RE Предаторскиот начин на живот на бактериофагот Bdellovibrio. инсталирај. Пасторски микроби. 63, 523-539 (2009).
Korp, J., Vela Gurovic, MS & Nett, M. Антибиотици од предаторски бактерии. Beilstein J. Histochemistry 12, 594-607 (2016).
Johnke, J., Fraune, S., Bosch, TCG, Hentschel, U. & Schulenburg, H. Bdellovibrio и слични организми се предиктори за разновидноста на микробиомот кај различни популации домаќини. микроорганизам. Екологија. 79, 252-257 (2020).
Vila, J., Moreno-Morales, J. и Ballesté-Delpierre, C. Откријте го моменталниот статус на новите антибактериски агенси. клинички. микроорганизам. Зарази. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2019.09.015 (2019).
Hobley, L. et al. Двојната грабливка на фагот и фагот може да го искорени пленот на E. coli без ниту еден плен. J. Бактерии. 202, e00629-19. https://doi.org/10.1128/JB.00629-19 (2020).
El-Shibiny, A., Connerton, PL & Connerton, IF. Апликациско опкружување. микроорганизам. 71, 1259-1266 (2005).
Wilkinson, DA итн. Ажурирајте ја геномската таксономија и епидемиологија на свињите Campylobacter. науката. Претставник 8, 2393. https://doi.org/10.1038/s41598-018-20889-x (2018).
Ли, MD GToTree: Работен тек лесен за корисникот за системска геномика. Биоинформатика 35, 4162–4164 (2019).
Едгар, RC MUSCLE: Метод на усогласување со повеќе секвенци што ја намалува сложеноста на времето и просторот. BMC биолошки информации. 5, 113 (2004).
Capella-Gutiérrez, S., Silla-Martínez, JM & Gabaldón, T. TrimAl: Алатка за автоматско усогласување и отсекување во филогенетска анализа од големи размери. Биоинформатика 25, 1972–1973 (2009).
Hyatt, D., LoCascio, PF, Hauser, LJ & Uberbacher, EC ген и метагеномска секвенца предвидување на почетната локација на преводот. Биоинформатика 28, 2223-2230 (2012).
Shen, W. & Xiong, J. TaxonKit: Крос-платформски и ефикасен комплет алатки за класификација на NCBI. Bio Rxiv. (Пристапено на 1 јуни 2021 година); https://www.biorxiv.org/content/10.1101/513523v1 (2019).
Цена, MN, Dehal, PS & Arkin, AP FastTree 2-приближно дрво на максимална веројатност со големо порамнување. PLoS One 5, e9490 (2010).
Танге, О. ГНУ Паралелно. (Пристапено на 1 јуни 2021 година); https://zenodo.org/record/1146014#.YOHaiJhKiUk (2018).
Канехиса, М. и Гото, С. КЕГГ: Енциклопедија на гени и геноми од Кјото. Истражување на нуклеинска киселина. 28, 27-30 (2000).
Чешка, L. итн. Улогата на екстремолитите ектоин и хидроксиектоин како заштитници на стрес и хранливи материи: генетика, системска геномика, биохемија и структурна анализа. ген (Базел). 9. E177. https://doi.org/10.3390/genes9040177 (2018).
Gregson, BH, Metodieva, G., Metodiev, MV, Golyshin, PN & McKew, BA Диференцијална протеинска експресија за време на растот на задолжителната морска бактерија која разградува јаглеводороди Thalassolituus oleivorans MIL-1 за време на растот на алканите со среден и долг ланец. предниот дел. микроорганизам. 9, 3130 (2018).
Пастернак, З., Бен Сасон, Т., Коен, Ј., Сегев, Е. и Јуркевич, Е. Нов метод на компаративна геномика за дефинирање на фенотипски специфични индикатори открива специфично наследство кај предаторските бактерии. Јавна научна библиотека Еден. 10. e0142933. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142933 (2015).
Јакимов, М.М., итн Thalassolituus oleivorans ген. ноември, сп. Ноември, нов тип на морски бактерии кои се специјализирани за употреба на јаглеводороди. интернационалноста. J. Систем. еволуција. микроорганизам. 54, 141-148 (2004).
Wang, Y., Yu, M., Liu, Y., Yang, X. & Zhang, XH Bacterioplanoides pacificum gen. ноември, сп. Во ноември се одвои од морската вода што циркулира во Јужниот Пацифик. интернационалноста. J. Систем. еволуција. микроорганизам. 66, 5010–5015 (2016).