En ny type gramnegative, aerobiske, salttolerante, aktive, stavformede og rovbakterier ASxL5T ble isolert fra en kumøkkdam i Nottinghamshire, England, og brukte Campylobacter som sitt bytte. Deretter ble andre Campylobacter-arter og medlemmer av Enterobacteriaceae-familien oppdaget som byttedyr. Etter subkultur uten vertsceller ble svak aseptisk vekst oppnådd på Brain Heart Infusion Agar. De optimale vekstforholdene er 37 °C og pH er 7. Transmisjonselektronmikroskopi avslørte noen svært uvanlige morfologiske trekk knyttet til tilgjengeligheten av byttedyr. Fylogenetisk analyse ved bruk av 16S rRNA-gensekvensen indikerte at isolatet er relatert til et medlem av Marine Spirulina-familien, men kan ikke tydelig klassifiseres som et medlem av noen kjent slekt. Helgenomsekvensering av ASxL5T bekreftet forholdet til medlemmer av de marine spiroketene. Et databasesøk avslørte at flere ASxL5T-er deler 16S rRNA-gensekvenser med flere udyrkede bakterier fra havet, landoverflaten og grunnvannet. Vi foreslår at stammen ASxL5T representerer en ny art i en ny slekt. Vi anbefaler navnet Venatorbacter cucullus gen. november, sp. I november ble ASxL5T brukt som typestamme.
Rovbakterier er bakterier som viser evnen til å jakte og drepe andre levende bakterier for å få biosyntetiske materialer og energi. Dette er forskjellig fra den generelle gjenvinningen av næringsstoffer fra døde mikroorganismer, og det er også forskjellig fra parasittiske interaksjoner, der bakterier danner et nært forhold til verten uten å drepe dem. Rovbakterier har utviklet forskjellige livssykluser for å dra nytte av rikelig med matkilder i nisjene der de finnes (som marine habitater). De er en taksonomisk mangfoldig gruppe, som bare er forbundet med deres unike steriliseringslivssyklus1. Eksempler på rovbakterier er funnet i flere forskjellige phyla, inkludert: Proteobakterier, Bacteroides og Chlorella.3. Imidlertid er de mest godt studerte rovbakteriene Bdellovibrio og Bdellovibrio-og-lignende organismer (BALOs4). Rovbakterier er en lovende kilde til nye biologisk aktive forbindelser og antibakterielle midler5.
Rovbakterier antas å øke mikrobielt mangfold og ha en positiv innvirkning på økosystemets helse, produktivitet og stabilitet6. Til tross for disse positive egenskapene er det få studier på nye rovbakterier på grunn av vanskeligheten med å dyrke bakterier og behovet for å observere celleinteraksjoner nøye for å forstå deres komplekse livssykluser. Denne informasjonen er ikke lett å få fra dataanalyse.
I en tid med økende antimikrobiell resistens studeres nye strategier for målretting mot bakterielle patogener, for eksempel bruk av bakteriofager og rovbakterier7,8. ASxL5T-bakterier ble isolert i 2019 ved bruk av fagisoleringsteknologi fra kumøkk samlet inn fra Dairy Center ved University of Nottingham, Nottinghamshire. Formålet med undersøkelsen er å isolere organismer med potensial som biologiske kontrollmidler. Campylobacter hyointestinalis er et zoonotisk patogen som i økende grad forbindes med tarmsykdommer hos mennesker10. Den er allestedsnærværende i serum og brukes som målvert.
ASxL5T-bakterien ble isolert fra biffgelé fordi det ble observert at plakkene den dannet på plenen til C. hyointestinalis var lik de som ble produsert av bakteriofager. Dette er et uventet funn, fordi en del av fagisoleringsprosessen involverer filtrering gjennom et 0,2 µm filter, som er designet for å fjerne bakterieceller. Mikroskopisk undersøkelse av materialet ekstrahert fra plaketten viste at de små gramnegative buede stavformede bakteriene ikke akkumulerte polyhydroksybutyrat (PHB). Den aseptiske kulturen uavhengig av byttedyrceller realiseres på rikt fast medium (som hjernehjerteinfusjonsagar (BHI) og blodagar (BA)), og veksten er svak. Det oppnås etter subkultur med kraftig inokulum forbedres. Den vokser like godt under mikroaerobe (7 % v/v oksygen) og atmosfæriske oksygenforhold, men ikke i en anaerob atmosfære. Etter 72 timer var diameteren på kolonien veldig liten, og nådde 2 mm, og den var beige, gjennomskinnelig, rund, konveks og skinnende. Standard biokjemisk testing er hindret fordi ASxL5T ikke kan dyrkes pålitelig i flytende medier, noe som antyder at det kan stole på den komplekse livssyklusen til biofilmdannelse. Platesuspensjonen viste imidlertid at ASxL5T er aerob, positiv for oksidase og katalase, og tåler 5 % NaCl. ASxL5T er resistent mot 10 µg streptomycin, men er følsomt for alle andre testede antibiotika. ASxL5T-bakteriecellene ble undersøkt med TEM (Figur 1). Når de dyrkes uten bytteceller på BA, er ASxL5T-celler små Campylobacter, med en gjennomsnittlig lengde på 1,63 μm (± 0,4), en bredde på 0,37 μm (± 0,08), og en enkelt lang (opptil 5 μm) pol. Seksuell flagella. Omtrent 1,6 % av cellene ser ut til å ha en bredde på mindre enn 0,2 μm, noe som vil tillate passasje gjennom filteranordningen. En uvanlig strukturell forlengelse ble observert på toppen av noen celler, lik en kåpe (latin cucullus) (se pilene i 1D, E, G). Dette ser ut til å være sammensatt av overflødig ytre membran, noe som kan skyldes den raske reduksjonen i størrelsen på den periplasmatiske konvolutten, mens den ytre membranen forblir intakt, og viser et "løst" utseende. Dyrking av ASxL5T i fravær av næringsstoffer (i PBS) i lang tid ved 4 °C resulterte i at de fleste (men ikke alle) celler viste en kokkmorfologi (figur 1C). Når ASxL5T vokser med Campylobacter jejuni som byttedyr i 48 timer, er den gjennomsnittlige cellestørrelsen betydelig lengre og smalere enn celler dyrket uten vert (tabell 1 og figur 1E). I kontrast, når ASxL5T vokser med E. coli som byttedyr i 48 timer, er den gjennomsnittlige cellestørrelsen lengre og bredere enn når den vokser uten byttedyr (tabell 1), og cellelengden er variabel, og viser vanligvis filamentøs (Figur 1F). Når de ble inkubert med Campylobacter jejuni eller E. coli som byttedyr i 48 timer, viste ASxL5T-celler ingen flageller i det hele tatt. Tabell 1 oppsummerer observasjonene av endringer i cellestørrelse basert på tilstedeværelse, fravær og byttedyrtype av ASxL5T.
TEM-visning av ASx5LT: (A) ASx5LT viser lang pisk; (B) typisk ASx5LT-batteri; (C) kokker ASx5LT-celler etter lang inkubering uten næringsstoffer; (D) en gruppe ASx5LT-celler viser abnormitet (E) ASx5LT-cellegruppe inkubert med Campylobacter-byttedyr viste økt cellelengde sammenlignet med de uten byttedyrvekst (D) viste også apikal struktur; (F) Store filamentøse flagella, ASx5LT-celler, etter inkubasjon med E. coli byttedyr; (G) En enkelt ASx5LT-celle etter inkubering med E. coli, som viser en uvanlig toppstruktur. Søylen representerer 1 μm.
Bestemmelse av 16S rRNA-gensekvensen (aksesjonsnummer MT636545.1) gjør det mulig for databasesøk å etablere sekvenser som ligner de i Gammaproteobacteria-klassen, og er nærmest marine bakterier i den marine spirillum-familien (figur 2), og er medlemmer av Thalassolituus-slekten Den nærmeste slektningen til Marine Bacillus. 16S rRNA-gensekvensen er klart forskjellig fra rovbakteriene som tilhører familien Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria). De parvise sammenligningene av B. bacteriovorus HD100T (type stamme, DSM 50701) og B. bacteriovorus DM11A var 48,4 % og 47,7 %, og for B. exovorus JSS var den 46,7 %. ASxL5T-bakterier har 3 kopier av 16S rRNA-genet, hvorav to er identiske med hverandre, og den tredje er 3 baser fra hverandre. To andre predatoriske bakterieisolater (ASx5S og ASx5O; 16S rRNA-genaksessnummer er henholdsvis MT636546.1 og MT636547.1) med lignende morfologiske og fenotypiske egenskaper fra samme sted er ikke de samme, men de er forskjellige fra ASxL5T og ukulturelt. databasesekvenser er gruppert sammen med andre slekter i Oceanospirillaceae (Figur 2). Hele genomsekvensen til ASxL5T er bestemt og lagret i NCBI-databasen, og tilgangsnummeret er CP046056. Genomet til ASxL5T består av et sirkulært kromosom på 2 831 152 bp med et G + C-forhold på 56,1 %. Genomsekvensen inneholder 2653 CDS (totalt), hvorav 2567 er spådd å kode for proteiner, hvorav 1596 kan tilordnes som antatte funksjoner (60,2%). Genomet inneholder 67 RNA-kodende gener, inkludert 9 rRNA (3 hver for 5S, 16S og 23S) og 57 tRNA. De genomiske egenskapene til ASxL5T ble sammenlignet med de tilgjengelige genomene til stammer av den nærmeste relative typen identifisert fra 16S rRNA-gensekvensen (tabell 2). Bruk aminosyreidentitet (AAI) for å sammenligne alle tilgjengelige Thalassolituus-genomer med ASxL5T. Den nærmeste tilgjengelige (ufullstendige) genomsekvensen bestemt av AAI er Thalassolituus sp. C2-1 (legg til NZ_VNIL01000001). Denne stammen ble isolert fra dyphavssedimentene til Mariana-graven, men det er foreløpig ingen fenotypisk informasjon om denne stammen for sammenligning. Sammenlignet med ASxL5Ts 2,82 Mb, er organismens genom større med 4,36 Mb. Den gjennomsnittlige genomstørrelsen til marine spiroketter er omtrent 4,16 Mb (± 1,1; n = 92 komplette referansegenomer undersøkt fra https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), så genomet til ASxL5T er i tråd med rekkefølge Sammenlignet med de andre medlemmene er den ganske liten. Bruk GToTree 1.5.54 til å generere et genombasert estimert maksimal sannsynlighet fylogenetisk tre (Figur 3A), ved å bruke de justerte og koblede aminosyresekvensene til 172 enkeltkopigener spesifikke for Gammaproteobacteria 11,12,13,14,15,16, 17,18. Analysen viste at det er nært knyttet til Thalassolituus, Bacterial Plane og Marine Bacterium. Disse dataene indikerer imidlertid at ASxL5T er forskjellig fra slektningene i Marine Spirulina og genomsekvensdataene er tilgjengelige.
Det fylogenetiske treet som bruker 16S rRNA-gensekvensen fremhever posisjonen til ASxL5T-, ASxO5- og ASxS5-stammene (med innvollene) i forhold til de ukultiverte og marine bakteriestammene i Marine Spirulinaceae. Genbank-aksessnummeret følger stammenavnet i parentes. Bruk ClustalW for å justere sekvenser, og bruk maksimal sannsynlighetsmetode og Tamura-Nei-modell for å utlede fylogenetiske forhold, og utfør 1000 guidede replikasjoner i MEGA X-programmet. Tallet på grenen indikerer at den guidede kopiverdien er større enn 50 %. Escherichia coli U/541T ble brukt som en utgruppe.
(A) Et fylogenetisk tre basert på genomet, som viser forholdet mellom den marine Spirospiraceae-bakterien ASxL5T og dens nære slektninger, E. coli U 5/41T som en utgruppe. (B) Sammenlignet med T. oleivorans MIL-1T, er den funksjonelle kategorifordelingen av gener spådd basert på den orthologe gruppen (COG) klyngen av ASx5LT-protein. Figuren til venstre viser antall gener i hver funksjonell COG-kategori i hvert genom. Grafen til høyre viser prosentandelen av genomer som finnes i hver funksjonell COG-gruppe. (C) Sammenlignet med T. oleiverans MIL-1T, analysen av den komplette KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) modulære banen til ASxL5T.
Ved å bruke KEGG-databasen til å undersøke komponentgenene som er tilstede i ASxL5T-genomet, avslørte den typiske metabolske veien til aerob gamma Proteus. ASxL5T inneholder totalt 75 gener tilordnet bakterielle motorproteiner, inkludert gener involvert i kjemotaksi, flagellamontering og type IV fimbriae-system. I den siste kategorien er 9 av 10 gener ansvarlige for rykkingen til en rekke andre organismer. Genomet til ASxL5T inneholder en komplett tetrahydropyrimidinbiosyntesevei som deltar i den beskyttende responsen på osmotisk stress20, som forventet for halofiler. Genomet inneholder også mange komplette veier for kofaktorer og vitaminer, inkludert riboflavinsynteseveier. Selv om alkan 1-monooksygenase (alkB2) genet er tilstede i ASxL5T, er hydrokarbonutnyttelsesveien ikke fullstendig. I genomsekvensen til ASxL5T er homologer av gener identifisert som hovedansvarlige for nedbrytningen av hydrokarboner i T. oleiverans MIL-1T21, slik som TOL_2658 (alkB) og TOL_2772 (alkoholdehydrogenase), åpenbart fraværende. Figur 3B viser sammenligningen av gendistribusjon i COG-kategorien mellom ASxL5T og olivenolje MIL-1T. Totalt sett inneholder det mindre ASxL5T-genomet proporsjonalt færre gener fra hver COG-kategori sammenlignet med det større relaterte genomet. Når antall gener i hver funksjonell kategori uttrykkes som en prosentandel av genomet, noteres forskjeller i prosentandelen gener i kategoriene translasjon, ribosomstruktur og biogenese, og energiproduksjons- og konverteringsfunksjonskategoriene, som utgjør den større ASxL5T genom Prosentandelen sammenlignes med samme gruppe som er tilstede i T. oleiverans MIL-1T-genom. I kontrast, sammenlignet med ASxL5T-genomet, har T. oleivorans MIL-1T en høyere prosentandel av gener i replikasjons-, rekombinasjons- og reparasjons- og transkripsjonskategoriene. Interessant nok er den største forskjellen i innholdet i hver funksjonell kategori av de to genomene antallet ukjente gener som er tilstede i ASxL5T (figur 3B). En berikelsesanalyse av KEGG-moduler ble utført, hvor hver KEGG-modul representerer et sett med manuelt definerte funksjonelle enheter for merknader og biologisk tolkning av genomsekvensdata. Sammenligningen av gendistribusjon i den komplette KOG-modulveien til ASxL5T og oliven MIL-1T er vist i figur 3C. Denne analysen viser at selv om ASxL5T har en fullstendig svovel- og nitrogenmetabolsk vei, har ikke T. oleiverans MIL-1T det. I motsetning til dette har T. oleiverans MIL-1T en fullstendig cystein- og metioninmetabolsk vei, men den er ufullstendig i ASxL5T. Derfor har ASxL5T en karakteristisk modul for sulfatassimilering (definert som et sett med gener som kan brukes som fenotypiske markører, slik som metabolsk kapasitet eller patogenisitet; https://www.genome.jp/kegg/module.html) I T oleiverans MIL-1T. Å sammenligne geninnholdet til ASxL5T med listen over gener som antyder en rovlivsstil er ikke entydig. Selv om waaL-genet som koder for ligasen assosiert med O-antigen-polysakkaridet til kjernen, er tilstede i ASxL5T-genomet (men det er vanlig i mange gramnegative bakterier), kan tryptofan 2,3-dioksygenase (TDO) gener inkludere 60 aminosyrene sure områder som vanligvis finnes i rovbakterier som ikke er tilstede. Det er ingen andre predatoriske karakteristiske gener i ASxL5T-genomet, inkludert de som koder for enzymer involvert i isoprenoid biosyntese i mevalonatveien. Merk at det ikke er noe transkripsjonsregulerende gen gntR i rovdyrgruppen som ble undersøkt, men tre gntR-lignende gener kan identifiseres i ASxL5T.
De fenotypiske egenskapene til ASxL5T er oppsummert i tabell 3 og sammenlignet med de fenotypiske egenskapene til beslektede slekter 23, 24, 25, 26 og 27 rapportert i litteraturen. Isolater fra T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis og Oceanobacter kriegii er aktive, salttolerante, oksidasepositive stavformede legemer, men har nesten ingen andre fenotypiske egenskaper med ASxL5T. Gjennomsnittlig pH i havet er 8,1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77), noe som gjenspeiles i T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis og O. kriegii. ASxL5T er egnet for det større pH-området (4-9) som er typisk for ikke-marine arter. Fenotypiske egenskaper ved Thalassolituus sp. C2-1. Ukjent. Veksttemperaturområdet for ASxL5T er generelt bredere enn for marine stammer (4–42 °C), selv om noen, men ikke alle, T. marinus-isolater er varmetolerante. Manglende evne til å dyrke ASxL5T i buljongmedier forhindret ytterligere fenotypisk karakterisering. Bruk API 20E til å teste materialene skrapet fra BA-platen, ONPG, arginindihydrolase, lysindekarboksylase, ornitindekarboksylase, citratutnyttelse, urease, tryptofan-deaminase, gelatinhydrolyseenzym, testresultatene var alle negative, men ingen indol, acetoin og H2S ble produsert. Ufermenterte karbohydrater inkluderer: glukose, mannose, inositol, sorbitol, rhamnose, sukrose, melibiose, amygdalin og arabinose. Sammenlignet med de publiserte relaterte referansestammene, er den cellulære fettsyreprofilen til ASxL5T-stammen vist i tabell 4. De viktigste cellulære fettsyrene er C16:1ω6c og/eller C16:1ω7c, C16:0 og C18:1ω9. Hydroksyfettsyrer C12:0 3-OH og C10:0 3-OH finnes også. Forholdet mellom C16:0 i ASxL5T er høyere enn den rapporterte verdien for relaterte slekter. I kontrast, sammenlignet med den rapporterte T. marinus IMCC1826TT, er forholdet mellom C18:1ω7c og/eller C18:1ω6c i ASxL5T redusert. oleivorans MIL-1T og O. kriegii DSM 6294T, men ikke påvist i B. sanyensis KCTC 32220T. Sammenligning av fettsyreprofilene til ASxL5T og ASxLS avslørte subtile forskjeller i mengden av individuelle fettsyrer mellom de to stammene, som stemmer overens med den genomiske DNA-sekvensen til samme art. Ingen poly-3-hydroksybutyrat (PHB)-partikler ble påvist ved bruk av Sudan Black-testen.
Predasjonsaktiviteten til ASxL5T-bakterier ble studert for å bestemme byttets rekkevidde. Denne bakterien kan danne plakk på Campylobacter-arter, inkludert: Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T; Escherichia coli NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; C lari NCTC 11458 og C. upsaliensis NCTC 11541T. Bruk kulturene som er oppført i vertsområdebestemmelsesdelen av metoden for å teste et bredere spekter av gramnegative og grampositive bakterier. Resultatene viser at ASxL5T også kan brukes i Escherichia coli NCTC 86 og Citrobacter freundii NCTC 9750T. Plakk dannet på Klebsiella oxytoca 11466. TEM-interaksjonen med E. coli NCTC 86 er vist i figur 4A-D, og ​​interaksjonen med Campylobacter jejuni PT14 og Campylobacter suis S12 er vist i figur 4E-H midt. Angrepsmekanismen ser ut til å være forskjellig mellom byttetypene som ble testet, med en eller flere E. coli-celler festet til hver ASxL5T-celle og plassert lateralt langs den utvidede cellen før adsorpsjon. I motsetning ser det ut til at ASxL5T fester seg til Campylobacter gjennom et enkelt kontaktpunkt, vanligvis i kontakt med toppen av rovdyrcellen og nær toppen av Campylobacter-cellen (Figur 4H).
TEM som viser interaksjonen mellom ASx5LT og byttedyr: (AD) og E. coli byttedyr; (EH) og C. jejuni byttedyr. (A) En typisk ASx5LT-celle koblet til en enkelt E. coli (EC)-celle; (B) En filamentøs ASx5LT festet til en enkelt EC-celle; (C) En filamentøs ASx5LT-celle koblet til flere EC-celler; (D) Vedlegg Mindre ASx5LT-celler på en enkelt E. coli (EC)-celle; (E) en enkelt ASx5LT-celle koblet til en Campylobacter jejuni (CJ)-celle; (F) ASx5LT angriper C. hyointestinalis (CH) celler; (G) to En ASx5LT-celle angrep en CJ-celle; (H) Et nærbilde av ASx5LT-festepunktet, nær toppen av CJ-cellen (bar 0,2 μm). Søylen representerer 1 μm i (A–G).
Rovbakterier har utviklet seg til å dra nytte av rikelig med byttedyr. Det er klart at de er tilstede i mange forskjellige miljøer. På grunn av den smale størrelsen på populasjonsmedlemmene er det mulig å isolere ASxL5T-bakterier fra slurryen ved bruk av fagseparasjonsmetoden. Den genomiske relevansen til ASxL5T for medlemmer av oceanospirillaceae-familien av marine bakterier er overraskende, selv om organismen er salttolerant og kan vokse på et medium som inneholder 5 % salt. Vannkvalitetsanalyse av slurryen viste at natriumkloridinnholdet var mindre enn 0,1 %. Derfor er gjørme langt unna det marine miljøet – både geografisk og kjemisk. Tilstedeværelsen av tre beslektede men forskjellige isolater fra samme kilde gir bevis på at disse rovdyrene trives i dette ikke-marine miljøet. I tillegg viste mikrobiomanalyse (datafiler tilgjengelig fra https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990) at den samme 16S rRNA-gensekvensen er plassert i de 50 mest utbredte operasjonelle taxaene (OTU) ) I noen få prøvetakingsintervaller av gjørmen. Flere udyrkede bakterier ble funnet i Genbank-databasen, som har 16S rRNA-gensekvenser som ligner på ASxL5T-bakterier. Disse sekvensene, sammen med sekvensene til ASxL5T, ASxS5 og ASxO5, ser ut til å representere forskjellige klader atskilt fra Thalassolituus og Oceanobacter (figur 2). Tre typer udyrkede bakterier (GQ921362, GQ921357 og GQ921396) ble isolert fra sprekkvannet på 1,3 kilometers dyp i den sørafrikanske gullgruven i 2009, og de to andre (DQ256320 og DQ337006 var også fra grunnvann) i 2005). 16S rRNA-gensekvensen som er nærmest knyttet til ASxL5T er en del av 16S rRNA-gensekvensen hentet fra anrikningskulturen av sandsedimenter hentet fra strendene i Nord-Frankrike i 2006 (aksesjonsnummer AM29240828). En annen nært beslektet 16S rRNA-gensekvens fra den udyrkede bakterien HQ183822.1 ble hentet fra en oppsamlingstank utvasket fra et kommunalt deponi i Kina. Åpenbart er ikke ASxL5T-bakterier veldig representative i taksonomiske databaser, men disse sekvensene fra ukultivede bakterier representerer sannsynligvis organismer som ligner på ASxL5T, som er distribuert over hele verden, vanligvis i utfordrende miljøer. Fra den fylogenetiske analysen av hele genomet er den nærmeste slektningen til ASxL5T Thalassolituus sp. C2-1, T. marinus, T. oleivorans. Og O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus er medlem av marine obligate hydrocarbon fragmentation bacteria (OHCB), som er utbredt i marine og terrestriske miljøer, og vanligvis blir den dominerende etter hendelser med hydrokarbonforurensning30,31. Marine bakterier er ikke medlemmer av OHCB-gruppen, men er isolert fra det marine miljøet.
Fenotypiske data indikerer at ASxL5T er en ny art og et medlem av en tidligere ukjent slekt i den marine spirospiraceae-familien. Det er foreløpig ingen klar standard for å klassifisere nylig isolerte stammer i en ny slekt. Det er gjort forsøk på å bestemme universelle slektsgrenser, for eksempel, basert på prosentandelen av genomet til et konservativt protein (POCP), anbefales det at grenseverdien er 50 % identisk med referansestammen33. Andre foreslår å bruke AAI-verdier, som har fordeler fremfor POCP fordi de kan oppnås fra ufullstendige genomer34. Forfatteren mener at hvis AAI-verdien er mindre enn 74 % sammenlignet med modellstammen til modellarten, er stammen en representant for en annen slekt. Modellslekten i marine spirillaceae er marine spirillum, og modellstammen er O. linum ATCC 11336T. AAI-verdien mellom ASxL5T og O. linum ATCC 11336T er 54,34 %, og AAI-verdien mellom ASxL5T og T. oleivorans MIL-1T (stammer av slektstype) er 67,61 %, noe som indikerer at ASxL5T representerer en ny slekt som er forskjellig fra Thalassolituus. Ved å bruke 16S rRNA-gensekvensen som klassifiseringsstandard, er den foreslåtte slektsavgrensningsgrensen 94,5 %35. ASxL5T kan plasseres i Thalassolituus-slekten, og viser 95,03 % 16S rRNA-sekvensidentitet med T. oleivorans MIL-1T og 96,17 %. marinus IMCC1826T. Det vil imidlertid også bli plassert i Bacteroides-slekten som har 94,64 % 16S rRNA-genidentitet med B. sanyensis NV9, noe som indikerer at bruken av et enkelt gen som 16S rRNA-genet kan føre til vilkårlig klassifisering og tilordning. En annen foreslått metode bruker ANI og Genome Alignment Score (AF) for å undersøke grupperingen av datapunkter fra alle typer og ikke-type stammer av eksisterende slekter. Forfatteren anbefaler å kombinere slektsgrensen med bøyningspunktet til den estimerte slekten som er spesifikk for taxaen som analyseres. Imidlertid, hvis det ikke er nok komplette genomsekvenser fra Thalassolituus-isolater, er det umulig å avgjøre om ASxL5T tilhører Thalassolituus-slekten ved denne metoden. På grunn av den begrensede tilgjengeligheten av komplette genomsekvenser for analyse, bør hele genomets fylogenetiske tre tolkes med forsiktighet. For det andre kan ikke metoder for sammenligning av hele genomer redegjøre for vesentlige forskjeller i størrelsen på de sammenlignede genomene. De målte likheten mellom konserverte kjerne-enkeltkopi-gener mellom beslektede slekter, men tok ikke hensyn til det store antallet gener som ikke er tilstede i det mye mindre genomet til ASxL5T. Åpenbart har ASxL5T og grupper inkludert Thalassolituus, Oceanobacter og Bacterioplanes en felles stamfar, men evolusjonen har tatt en annen vei, noe som fører til en reduksjon i genomet, som kan være å tilpasse seg en rovlivsstil. Dette er i motsetning til T. oleivorans MIL-1T, som er 28 % større og har utviklet seg under ulike miljøpåvirkninger for å utnytte hydrokarboner23,30. En interessant sammenligning kan gjøres med obligate intracellulære parasitter og symbionter, som Rickettsia, Chlamydia og Buchnera. Deres genomstørrelse er omtrent 1 Mb. Evnen til å utnytte vertscellemetabolitter fører til gentap, så Gjennomgikk betydelig evolusjonær genomisk nedbrytning. Evolusjonære endringer fra marine kjemiske næringsorganismer til rovlivsstiler kan resultere i en tilsvarende reduksjon i genomstørrelse. COG- og KEGG-analysen fremhever antall gener som brukes for spesifikke funksjoner og de globale forskjellene i de genomiske veiene mellom ASxL5T og T. oleivorans MIL-1T, som ikke skyldes den utbredte tilgjengeligheten av mobile genetiske elementer. Forskjellen i G + C-forholdet til hele genomet til ASxL5T er 56,1 %, og det til T. oleivorans MIL-1T er 46,6 %, noe som også indikerer at det er segregert.
Undersøkelse av det kodende innholdet i ASxL5T-genomet gir funksjonell innsikt i fenotypiske egenskaper. Tilstedeværelsen av gener som koder for type IV fimbriae (Tfp) er av spesiell interesse fordi de fremmer cellebevegelse, kalt sosial gliding eller kramper, uten flageller på overflaten. Ifølge rapporter har Tfp andre funksjoner, inkludert predasjon, patogenese, biofilmdannelse, naturlig DNA-opptak, automatisk celleaggregering og utvikling38. ASxL5T-genomet inneholder 18 gener som koder for diguanylatcyklase (et enzym som katalyserer omdannelsen av 2 guanosintrifosfat til guanosin 2 fosfat og syklisk diGMP) og 6 gener som koder for det tilsvarende diguanylatcyklasefosfatdiguanylatet. Genet for esterase (katalyserer nedbrytningen av syklisk di-GMP til guanosinmonofosfat) er interessant fordi syklisk-di-GMP er en viktig andre budbringer involvert i biofilmutvikling og separasjon, bevegelse, cellefesting og virulens 39, 40 i prosessen. Det bør også bemerkes at i Bdellovibrio bacteriovorus har syklisk dobbel GMP vist seg å kontrollere overgangen mellom fritt liv og rovlivsstil41.
Mest forskning på rovbakterier har fokusert på Bdellovibrio, Bdellovibrio-lignende organismer og Myxococcus-arter. Disse og andre kjente eksempler på rovbakterier utgjør en mangfoldig gruppe. Til tross for dette mangfoldet er det identifisert et sett med karakteristiske proteinfamilier som gjenspeiler fenotypene til 11 kjente rovbakterier3,22. Imidlertid er bare gener som koder for O-antigenligase (waaL) blitt identifisert, noe som er spesielt vanlig hos gramnegative bakterier. Denne formen for analyse er ikke nyttig for å utpeke ASxL5T som et rovdyr, sannsynligvis fordi den bruker en ny angrepsstrategi. Tilgjengeligheten av mer varierte rovbakteriegenomer vil bidra til å utvikle finere oppløsningsanalyser som tar hensyn til bevis på funksjonelle og miljømessige forskjeller mellom gruppemedlemmer. Eksempler på rovbakterier som ikke er inkludert i denne analysen inkluderer medlemmer av Cupriavidus necator42 og Bradymonabacteria43, fordi etter hvert som forskere undersøker forskjellige mikrobielle samfunn, etableres flere rovtaxa.
Den mest bemerkelsesverdige egenskapen til ASxL5T-bakterier fanget av TEM-bilde er dens unike og fleksible morfologi, som kan fremme interaksjon med byttedyrbakterier. Typen interaksjon som observeres er forskjellig fra andre rovbakterier og har ikke tidligere blitt oppdaget eller rapportert. Den foreslåtte ASxL5T rovlivssyklusen er vist i figur 5. Det er få eksempler i litteraturen med lignende apikale strukturer som vi rapporterer her, men disse eksemplene inkluderer Terasakiispira papahanaumokuakeensis, en marin spirillum-bakterie med sporadisk apex-forstørrelse 44, og Alphaproteobacteria, Terasakiella pusakiella , som tidligere tilhørte slekten Oceanospirillum, utstilling Den såkalte "polarfilmen" 45. Kokkeformer er ofte observert i eldre kulturer, spesielt for bakterier med buede former, som Vibrio, Campylobacter og Helicobacter 46, 47, 48, som kan representere en degradert tilstand. Ytterligere arbeid er nødvendig for å klargjøre den nøyaktige livssyklusen til ASxL5T-bakterier. For å finne ut hvordan den fanger og bytter, og om genomet koder for biologisk aktive forbindelser som kan brukes til medisinske eller bioteknologiske formål.
Beskrivelse av Venatorbacter gen. November Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. er sammensatt av venatorer fra L. n. venator, 'hunter' og Gr. n. bacter, 'en stang'. Venatorbacter, 'en jaktstang' Celler er aerobe, salttolerante, buede gramfarge-negative, treningsstaver og oksidaseaktivitet akkumuleres ikke. I temperaturområdet 4 til 42 °C Inngrodd pH-området på 4-9 er uvanlig I marine snegler er de fleste intolerante for sur pH. 0 og C18:1ω9; C12:0 3-OH og C10:0 3-OH er funnet som hydroksyfett syrer. De vokser ikke i buljongmedier. DNA G + C-innholdet er 56,1 mol%. Medlemmer av denne slekten viser motstand mot Campylobacter .
Beskrivelse av Venatorbacter cucullus sp. november Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus betyr kåpe).
I tillegg er det beskrivende trekk ved denne slekten at når de dyrkes på BA eller BHI, er cellene 1,63 µm lange og 0,37 µm brede. Koloniene på BHI-agar er svært små, og når 2 mm i diameter etter 72 timer. De er beige, gjennomskinnelige, runde, konvekse og skinnende. Medlemmene av denne arten kan bruke Escherichia coli og Klebsiella. Campylobacter og flere andre gramnegative bakterier tjener som byttedyr.
Den typiske stammen ASxL5T ble isolert fra biffmelk i Nottinghamshire, Storbritannia, og deponert i National Type Culture Collection (UK): tilgangsnummer NCTC 14397 og Netherlands Bacterial Culture Collection (NCCB) tilgangsnummer NCCB 100775. Den komplette genomsekvensen til ASxL5T har blitt deponert i Genbank i henhold til tillegget CP046056.
ASxL5T-bakterier ble isolert fra biffmelk ved bruk av fagisoleringsteknologi9,49. Oppslemmingen ble fortynnet 1:9 (vekt/volum) i SM-buffer (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,1 M NaCl, 8 mM MgSO4.7H2O og 0,01 % gelatin; Sigma Aldrich, Gillingham, Storbritannia), Inkuber deretter ved 4°C i 24 timer, roterende sakte for å eluere rovdyrene inn i bufferen. Suspensjonen ble sentrifugert ved 3000 g i 3 minutter. Supernatanten ble samlet og sentrifugert ved 13 000 g for andre gang i 5 minutter. Supernatanten ble deretter ført gjennom et 0,45 µm membranfilter (Minisart; Sartorius, Gottingen, Tyskland) og et 0,2 µm membranfilter (Minisart) for å fjerne eventuelle gjenværende bakterieceller. ASxL5T kan passere disse filtrene. En myk agarplen av Campylobacter enterosus S12 (NCBI-aksessnummer CP040464) fra samme slurry ble fremstilt ved bruk av standardteknikker. Den filtrerte slurryen ble fordelt på hver av disse vertscelleplatene i 10 ul dråper i tre eksemplarer og fikk tørke. Platen ble inkubert i en mikroaerofil tank ved 37°C i 48 timer under mikroaerobe forhold (5 % O2, 5 % H2, 10 % CO2 og 80 % N2). Den oppnådde synlige plakk ble ekstrahert inn i SM-buffer og overført til den friske plenen til C. hyointestinalis S12 for ytterligere å forplante de lyserte organismene. Når det er fastslått at bakteriene er årsaken til det lytiske plakket og ikke fagen, prøv å dyrke organismen uavhengig av verten og karakterisere den ytterligere. Den aerobe kulturen ble utført ved 37 °C med 5 % v/v defibrinert hesteblod (TCS Biosciences Lt, Buckingham, Storbritannia, supplement). I henhold til retningslinjene til National Clinical Standards Committee, brukes diskdiffusjonsmetoden for antibakteriell følsomhetstesting. BHI-agar ble dyrket ved 37 °C ved å bruke en skive som inneholdt følgende antibiotika (Oxoid) for aerob kultur: amoksicillin og klavulansyre 30 µg; cefotaxim 30 ug; streptomycin 10 ug; ciprofloksacin 5 µg; Ceftazidim 30 µg nalidiksinsyre 30 µg; Imipenem 10 ug; Azithromycin 15 ug; Kloramfenikol 30 ug; Cefoxitin 30 µg; tetracyklin 30 ug; Nitrofurantoin 300 ug; Aztreonam 30 µg; Ampicillin 10 ug; Cefpodoxime 10 ug; Trimetoprim-sulfametoksazol 25 µg. Salttoleransen ble etablert ved aerob inkubering på BHI-agarplater ved 37 °C. Ytterligere NaCl ble tilsatt til BHI-agarplatene for å gi et konsentrasjonsområde på opptil 10 % vekt/volum. pH-området bestemmes ved aerob kultur på BHI-agarplater ved 37°C, hvor pH-området er justert til mellom 4 og 9 med steril HCl eller steril NaOH, og mål-pH-verdien verifiseres før platen helles. For cellulær fettsyreanalyse ble ASxL5T dyrket på BHI-agar i 3 dager og aerob ved 37 °C. I henhold til MIDI (Sherlock Microbial Identification System, versjon 6.10) standardprotokollen til FERA Science Ltd, (York, UK), ble cellefettsyrer ekstrahert, forberedt og analysert.
For TEM ble ASxL5T dyrket aerobt ved å spre jevnt på BA ved 37 °C i 24 timer, og deretter høstet inn i 1 ml 3 % (v/v) glutaraldehyd i 0,1 M kakodylatbuffer ved romtemperatur. Fiks i 1 time, og sentrifuger deretter ved 10 000 g i 3 minutter. Resuspender deretter pelleten forsiktig i 600 μl 0,1 M kakodylatbuffer. Overfør den faste ASxL5T-suspensjonen til Formvar/karbonfilmen på et 200 mesh kobbergitter. Bakteriene ble farget med 0,5 % (vekt/volum) uranylacetat i 1 minutt og undersøkt med TEM ved bruk av et TEI Tecnai G2 12 Biotwin-mikroskop. Som nevnt ovenfor, kombiner det samme antall byttedyr og rovdyr i NZCYM-buljong (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) og inkuber i 48 timer under mikroaerobe forhold av Campylobacter eller Campylobacter ved 37 °C, Samspillet mellom rovdyr og byttedyr ble også undersøkt av TEM. Aerobe forhold for Escherichia coli. Uavhengig undersøk byttedyr og rovbakterier for å bestemme eventuelle endringer i cellemorfologi på grunn av predasjon. Sudan black-metoden ble brukt for optisk mikroskopi av PHB-akkumulering.
Dyrk ASxL5T-kulturer over natten ved å smøre vekst på BHI- eller BA-plater med en steril vattpinne. Samle ASxL5T-celler og suspender dem i MRD (CM0733, Oxoid), og plasser dem deretter ved 4 °C i 7 dager for å sulte ut cellene. NCTC-referanse- eller laboratorie-bakteriekulturen ble inokulert i BHI-buljong eller nr. 2-næringsbuljong (CM007, Oxoid), inkubert over natten, sentrifugert ved 13 000 g og resuspendert i MRD til OD600 var 0,4. Kultur: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, LeNCiella 4oxyto6, LeNCiella 14oxyto6 10817, Listeria Special bacteria NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, Rhodococcus undersjøisk hamburger NCTC 1621T, Salmonella intestinal bacteria NCTC 10318 NCTC 10861, Staphylococcus aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. Campylobacter-verten ble mikroaerobt inkubert på BA-plater ved 37°C NZ og CYM suspendert. De testede Campylobacter-vertene er: C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11458, C. lari NCTC 11458, C.i lari je. PT14, C... Samle celler i MRD, sentrifuger ved 13 000 g og resuspender i MRD til OD600 er 0,4. Tilsett en alikvot av 0,5 ml suspensjon til 5 ml smeltet NZCYM toppagar (0,6 % agar) og hell den på en 1,2 % NZCYM bunnplate. Etter herding og tørking ble den seriefortynnede ASxL5T fordelt som 20 µl dråper på hvert plenbrett i tre eksemplarer. Kulturtemperaturen og atmosfæren avhenger av kravene til testbakteriene.
Bruk GenElute™ bakteriell genomisk DNA-sett (Sigma Aldridge) for å forberede DNA fra bakterieisolater. Standardmetoder ble brukt for PCR-amplifisering av 16S rRNA-gen og produktsekvensbestemmelse ved bruk av fargestofftermineringskjemi (Eurofins Value Read Service, Tyskland). Bruk BLAST-N-programmet til å sammenligne disse sekvensene med andre 16S rRNA-gensekvenser for å identifisere og samle nært beslektede arter. Disse er justert ved hjelp av ClustalW i MEGA X-programmet. Det fylogenetiske treet ble rekonstruert ved bruk av MEGA X ved bruk av maksimal sannsynlighetsmetoden basert på Tamura-Nei-modellen, med 1000 guidede kopier54. Bruk PureLink™ Genomic DNA Kit (Fisher Scientific, Loughborough, Storbritannia) for å trekke ut DNA for helgenomsekvensering. Genomsekvensen til ASxL5T ble bestemt ved å bruke Illumina MiSeq-kombinasjonen, som består av 250 bp dobbeltsidige avlesninger sammensatt av et bibliotek utarbeidet ved bruk av Nextera-merkesettet og 2 til 20 kb lange avlesninger fra PacBio-plattformen. Genomics DNA Sequencing Research Facility ved Sembia University. Genomet ble satt sammen ved hjelp av CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen, Aarhus, Danmark). ASxL5T-kulturer er deponert i National Type Culture Collection (UK) og Netherlands Bacterial Culture Collection (NCCB). Genomene til beslektede organismer brukt til sammenligning er: Thalassolituus oleivorans MIL-1T (aksesjonsnummer HF680312, komplett); Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (aksesjonsnummer BMYY01000001, ufullstendig); Oceanobacter kriegii DSM 6294T (aksesjonsnummer NZ_AUGV00000000, ufullstendig); Marinamonas community DSM 5604T (lagt til ASM436330v1, ufullstendig), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (lagt til MTSD02000001, ufullstendig) og Thalassolituus sp. C2-1 (legg til NZ_VNIL01000001, ufullstendig). Bruk JGI Genome Portal36 på https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page= for å bestemme alignment score (AF) og gjennomsnittlig nukleinsyreidentitet (ANI). I par. Metoden til Rodriguez-R & Konstantinidis55 ble brukt for å bestemme aminosyreidentitet (AAI). Bruk GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 for å generere et estimert fylogenetisk tre med maksimal sannsynlighet. Inngangsgenomet som representerer det tilgjengelige referansegenomet er valgt fra referanseslekter identifisert som relatert til ASxL5T fra 16S rRNA-fylogenien. Kommenterte treet ved å bruke det interaktive livets tre online-verktøy (https://itol.embl.de/). Den funksjonelle merknaden og analysen av ASxL5T-genomet utføres ved å bruke BlastKOALA KEGG online-verktøy ved å bruke KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) modulberikelsesdistribusjon. Fordelingen av COG-kategorier (ortologe grupper) bestemmes ved hjelp av eggNOG-mapper online-verktøyet.
Pérez, J., Moraleda-Muñoz, A., Marcos-Torres, FJ og Muñoz-Dorado, J. Bakteriell predasjon: 75 år og det fortsetter! . miljø. mikroorganisme. 18, 766–779 (2016).
Linares-Otoya, L. etc. Mangfold og antibakterielt potensial for rovbakterier på den peruanske kystlinjen. mars narkotika. 15. E308. https://doi.org/10.3390/md15100308 (2017).
Pasternak, Z. et al. Gjennom genene deres vil du forstå dem: de genomiske egenskapene til rovbakterier. ISME J. 7, 756–769 (2013).
Sockett, RE Den rovlivsstilen til bakteriofagen Bdellovibrio. installere. Pastormikrober. 63, 523–539 (2009).
Korp, J., Vela Gurovic, MS & Nett, M. Antibiotika fra rovbakterier. Beilstein J. Histochemistry 12, 594–607 (2016).
Johnke, J., Fraune, S., Bosch, TCG, Hentschel, U. & Schulenburg, H. Bdellovibrio og lignende organismer er prediktorer for mikrobiom-mangfold i forskjellige vertspopulasjoner. mikroorganisme. Økologi. 79, 252–257 (2020).
Vila, J., Moreno-Morales, J. og Ballesté-Delpierre, C. Oppdag den nåværende statusen til nye antibakterielle midler. klinisk. mikroorganisme. Infisere. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2019.09.015 (2019).
Hobley, L. et al. Den doble predasjonen av fag og fag kan utrydde E. coli byttedyr uten en eneste predasjon. J. Bakterier. 202, e00629-19. https://doi.org/10.1128/JB.00629-19 (2020).
El-Shibiny, A., Connerton, PL & Connerton, IF Antallet og mangfoldet av Campylobacter og bakteriofager isolert under fôringssyklusen til frittgående og økologiske kyllinger. Applikasjonsmiljø. mikroorganisme. 71, 1259–1266 (2005).
Wilkinson, DA etc. Oppdater den genomiske taksonomien og epidemiologien til Campylobacter-svin. vitenskap. Representant 8, 2393. https://doi.org/10.1038/s41598-018-20889-x (2018).
Lee, MD GToTree: Brukervennlig arbeidsflyt for systemgenomikk. Bioinformatics 35, 4162–4164 (2019).
Edgar, RC MUSCLE: En flersekvensjusteringsmetode som reduserer tid og romkompleksitet. BMC biologisk informasjon. 5, 113 (2004).
Capella-Gutiérrez, S., Silla-Martínez, JM & Gabaldón, T. TrimAl: Et verktøy for automatisk justering og trimming i storskala fylogenetisk analyse. Bioinformatikk 25, 1972–1973 (2009).
Hyatt, D., LoCascio, PF, Hauser, LJ & Uberbacher, EC-gen og metagenomisk sekvenstranslasjonsstartsideprediksjon. Bioinformatics 28, 2223-2230 (2012).
Shen, W. & Xiong, J. TaxonKit: Kryssplattform og effektivt NCBI-klassifiseringsverktøysett. Bio Rxiv. (Åpnet 1. juni 2021); https://www.biorxiv.org/content/10.1101/513523v1 (2019).
Pris, MN, Dehal, PS & Arkin, AP FastTree 2-omtrent maksimal sannsynlighetstre med stor justering. PLoS One 5, e9490 (2010).
Tange, O. GNU Parallell. (Åpnet 1. juni 2021); https://zenodo.org/record/1146014#.YOHaiJhKiUk (2018).
Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Nukleinsyreforskning. 28, 27-30 (2000).
Tsjekkia, L. etc. Rollen til ekstremolyttene ektoin og hydroksyektoin som stressbeskyttere og næringsstoffer: genetikk, systemgenomikk, biokjemi og strukturanalyse. Gene (Basel). 9. E177. https://doi.org/10.3390/genes9040177 (2018).
Gregson, BH, Metodieva, G., Metodiev, MV, Golyshin, PN & McKew, BA Differensiell proteinekspresjon under veksten av den obligate marine hydrokarbonnedbrytende bakterien Thalassolituus oleivorans MIL-1 under veksten av middels og langkjedede alkaner. front. mikroorganisme. 9, 3130 (2018).
Pasternak, Z., Ben Sasson, T., Cohen, Y., Segev, E., og Jurkevitch, E. En ny komparativ genomikkmetode for å definere fenotypiske spesifikke indikatorer avslører spesifikk arv i rovbakterier. Public Science Library One. 10. e0142933. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142933 (2015).
Yakimov, MM, etc. Thalassolituus oleivorans genet. november, sp. nov., en ny type marine bakterier som spesialiserer seg på bruk av hydrokarboner. internasjonalitet. J. System. utvikling. mikroorganisme. 54, 141–148 (2004).
Wang, Y., Yu, M., Liu, Y., Yang, X. & Zhang, XH Bacterioplanoides pacificum gen. november, sp. I november skilte den seg fra sjøvannet som sirkulerte i det sørlige Stillehavet. internasjonalitet. J. System. utvikling. mikroorganisme. 66, 5010–5015 (2016).