Um novo tipo de bactéria Gram-negativa, aeróbica, tolerante ao sal, ativa, em forma de bastonete e predadora ASxL5T foi isolada de um lago de esterco de vaca em Nottinghamshire, Inglaterra, e usou Campylobacter como presa. Posteriormente, outras espécies de Campylobacter e membros da família Enterobacteriaceae foram descobertos como presas. Após subcultura sem células hospedeiras, foi alcançado um fraco crescimento asséptico no Brain Heart Infusion Agar. As condições ótimas de crescimento são 37 °C e o pH é 7. A microscopia eletrônica de transmissão revelou algumas características morfológicas muito incomuns relacionadas à disponibilidade de presas. A análise filogenética utilizando a sequência do gene 16S rRNA indicou que o isolado está relacionado a um membro da família Spirulina Marinha, mas não pode ser claramente classificado como membro de nenhum gênero conhecido. O sequenciamento do genoma completo de ASxL5T confirmou a relação com membros das espiroquetas marinhas. Uma pesquisa no banco de dados revelou que vários ASxL5Ts compartilham sequências do gene 16S rRNA com várias bactérias não cultivadas do oceano, da superfície terrestre e das águas subterrâneas. Sugerimos que a cepa ASxL5T representa uma nova espécie em um novo gênero. Recomendamos o nome Venatorbacter cucullus gen. Novembro, sp. Em novembro, ASxL5T foi usada como cepa tipo.
Bactérias predadoras são bactérias que apresentam a capacidade de caçar e matar outras bactérias vivas para obter materiais biossintéticos e energia. Isto é diferente da recuperação geral de nutrientes de microrganismos mortos, e também é diferente das interações parasitárias, nas quais as bactérias formam uma relação estreita com o seu hospedeiro sem matá-lo. As bactérias predadoras desenvolveram diferentes ciclos de vida para aproveitar as fontes abundantes de alimento nos nichos onde são encontradas (como os habitats marinhos). Eles constituem um grupo taxonomicamente diverso, conectado apenas pelo seu ciclo de vida de esterilização único1. Exemplos de bactérias predadoras foram encontrados em vários filos diferentes, incluindo: Proteobacteria, Bacteroides e Chlorella.3. No entanto, as bactérias predadoras mais bem estudadas são os organismos Bdellovibrio e Bdellovibrio-and-like (BALOs4). Bactérias predadoras são uma fonte promissora de novos compostos biologicamente ativos e agentes antibacterianos5.
Acredita-se que as bactérias predadoras melhoram a diversidade microbiana e têm um impacto positivo na saúde, produtividade e estabilidade dos ecossistemas6. Apesar desses atributos positivos, existem poucos estudos sobre novas bactérias predadoras devido à dificuldade de cultivo de bactérias e à necessidade de observar cuidadosamente as interações celulares para compreender seus complexos ciclos de vida. Esta informação não é fácil de obter a partir de análises computacionais.
Numa era de aumento da resistência antimicrobiana, novas estratégias para atingir patógenos bacterianos estão sendo estudadas, como o uso de bacteriófagos e bactérias predadoras7,8. As bactérias ASxL5T foram isoladas em 2019 usando tecnologia de isolamento de fagos de esterco de vaca coletado no Dairy Center da Universidade de Nottingham, Nottinghamshire. O objetivo da investigação é isolar organismos com potencial como agentes de controle biológico. Campylobacter hyointestinalis é um patógeno zoonótico, cada vez mais associado a doenças intestinais humanas10. É onipresente no soro e usado como hospedeiro alvo.
A bactéria ASxL5T foi isolada da geleia bovina porque foi observado que as placas que ela formou no gramado de C. hyointestinalis eram semelhantes às produzidas pelos bacteriófagos. Esta é uma descoberta inesperada, porque parte do processo de isolamento do fago envolve a filtragem através de um filtro de 0,2 µm, concebido para remover células bacterianas. O exame microscópico do material extraído da placa revelou que as pequenas bactérias gram-negativas curvas em forma de bastonete não acumulavam polihidroxibutirato (PHB). A cultura asséptica independente de células de presa é realizada em meio sólido rico (como ágar de infusão de cérebro e coração (BHI) e ágar sangue (BA)), e seu crescimento é fraco. É obtido após melhoramento de subcultivo com inóculo pesado. Cresce igualmente bem em condições microaeróbicas (7% v/v de oxigênio) e de oxigênio atmosférico, mas não em atmosfera anaeróbica. Após 72 horas, o diâmetro da colônia era muito pequeno, chegando a 2 mm, e era bege, translúcido, redondo, convexo e brilhante. Os testes bioquímicos padrão são dificultados porque o ASxL5T não pode ser cultivado de forma confiável em meio líquido, o que sugere que ele pode depender do complexo ciclo de vida da formação de biofilme. Porém, a suspensão da placa mostrou que o ASxL5T é aeróbio, positivo para oxidase e catalase e pode tolerar NaCl a 5%. ASxL5T é resistente a 10 µg de estreptomicina, mas é sensível a todos os outros antibióticos testados. As células bacterianas ASxL5T foram examinadas por TEM (Figura 1). Quando cultivadas sem células presas na BA, as células ASxL5T são pequenas Campylobacter, com comprimento médio de 1,63 μm (± 0,4), largura de 0,37 μm (± 0,08) e um único pólo longo (até 5 μm). Flagelos sexuais. Aproximadamente 1,6% das células parecem ter uma largura inferior a 0,2 μm, o que permitirá a passagem através do dispositivo de filtro. Uma extensão estrutural incomum foi observada no topo de algumas células, semelhante a uma carenagem (latim cucullus) (ver setas em 1D, E, G). Esta parece ser composta por excesso de membrana externa, o que pode ser devido à rápida redução do tamanho do envelope periplasmático, enquanto a membrana externa permanece intacta, apresentando aspecto "solto". A cultura de ASxL5T na ausência de nutrientes (em PBS) durante um longo período de tempo a 4°C resultou na maioria (mas não todas) das células apresentando uma morfologia cócica (Figura 1C). Quando ASxL5T cresce com Campylobacter jejuni como presa por 48 horas, o tamanho médio das células é significativamente mais longo e mais estreito do que as células cultivadas sem hospedeiro (Tabela 1 e Figura 1E). Em contraste, quando ASxL5T cresce com E. coli como presa durante 48 horas, o tamanho médio da célula é mais longo e mais largo do que quando cresce sem presa (Tabela 1), e o comprimento da célula é variável, geralmente mostrando filamentoso (Figura 1F). Quando incubadas com Campylobacter jejuni ou E. coli como presa durante 48 horas, as células ASxL5T não mostraram nenhum flagelo. A Tabela 1 resume as observações de mudanças no tamanho das células com base na presença, ausência e tipo de presa de ASxL5T.
Exibição TEM do ASx5LT: (A) ASx5LT mostra chicote longo; (B) bateria ASx5LT típica; (C) células cocos ASx5LT após longa incubação sem nutrientes; (D) um grupo de células ASx5LT apresenta anormalidade (E) o grupo de células ASx5LT incubadas com presas de Campylobacter apresentou aumento no comprimento das células em comparação com aquelas sem crescimento de presas (D) também apresentou estrutura apical; (F) Flagelos Filamentosos Grandes, células ASx5LT, após incubação com presa de E. coli; (G) Uma única célula ASx5LT após incubação com E. coli, mostrando uma estrutura superior incomum. A barra representa 1 μm.
A determinação da sequência do gene 16S rRNA (número de acesso MT636545.1) permite pesquisas em bancos de dados para estabelecer sequências semelhantes às da classe Gammaproteobacteria e estão mais próximas das bactérias marinhas da família spirillum marinha (Figura 2) e são membros do gênero Thalassolituus O parente mais próximo do Bacillus Marinho. A sequência do gene 16S rRNA é claramente diferente da das bactérias predadoras pertencentes à família Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria). As comparações pareadas de B. bacteriovorus HD100T (cepa tipo, DSM 50701) e B. bacteriovorus DM11A foram de 48,4% e 47,7%, e para B. exovorus JSS foram de 46,7%. A bactéria ASxL5T possui 3 cópias do gene 16S rRNA, duas das quais são idênticas entre si e a terceira está separada por 3 bases. Dois outros isolados bacterianos predatórios (ASx5S e ASx5O; números de acesso do gene 16S rRNA são MT636546.1 e MT636547.1, respectivamente) com características morfológicas e fenotípicas semelhantes do mesmo local não são iguais, mas são diferentes de ASxL5T e bactérias não cultivadas as sequências do banco de dados estão agrupadas com outros gêneros em Oceanospirilaceae (Figura 2). Toda a sequência do genoma do ASxL5T foi determinada e salva no banco de dados NCBI, e o número de acesso é CP046056. O genoma do ASxL5T consiste em um cromossomo circular de 2.831.152 pb com uma proporção G + C de 56,1%. A sequência do genoma contém 2.653 CDS (total), dos quais se prevê que 2.567 codifiquem proteínas, dos quais 1.596 podem ser atribuídos como funções putativas (60,2%). O genoma contém 67 genes codificadores de RNA, incluindo 9 rRNAs (3 de cada para 5S, 16S e 23S) e 57 tRNAs. As características genômicas do ASxL5T foram comparadas com os genomas disponíveis de cepas do tipo relativo mais próximo identificado a partir da sequência do gene 16S rRNA (Tabela 2). Use identidade de aminoácidos (AAI) para comparar todos os genomas de Thalassolituus disponíveis com ASxL5T. A sequência do genoma disponível (incompleta) mais próxima determinada pela AAI é Thalassolituus sp. C2-1 (adicionar NZ_VNIL01000001). Esta cepa foi isolada de sedimentos profundos da Fossa das Marianas, mas atualmente não há informações fenotípicas sobre esta cepa para comparação. Comparado com os 2,82 Mb do ASxL5T, o genoma do organismo é maior, com 4,36 Mb. O tamanho médio do genoma das espiroquetas marinhas é de cerca de 4,16 Mb (± 1,1; n = 92 genomas de referência completos investigados em https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), então o genoma do ASxL5T está alinhado com o ordem Comparado com os outros membros, é bem pequeno. Use GToTree 1.5.54 para gerar uma árvore filogenética de máxima verossimilhança estimada baseada no genoma (Figura 3A), usando as sequências de aminoácidos alinhadas e ligadas de 172 genes de cópia única específicos para Gammaproteobacteria 11,12,13,14,15,16, 17,18. A análise mostrou que está intimamente relacionado com Thalassolituus, Plano Bacteriano e Bactéria Marinha. No entanto, estes dados indicam que o ASxL5T é diferente dos seus parentes na espirulina marinha e os dados da sua sequência genómica estão disponíveis.
A árvore filogenética usando a sequência do gene 16S rRNA destaca a posição das cepas ASxL5T, ASxO5 e ASxS5 (com os intestinos) em relação às cepas de bactérias marinhas e não cultivadas nas Spirulinaceae Marinhas. O número de acesso do Genbank segue o nome da cepa entre parênteses. Use ClustalW para alinhar sequências e use o método de máxima verossimilhança e o modelo Tamura-Nei para inferir relações filogenéticas e realizar 1000 replicações guiadas no programa MEGA X. O número na ramificação indica que o valor da cópia guiada é superior a 50%. Escherichia coli U/541T foi utilizada como grupo externo.
(A) Uma árvore filogenética baseada no genoma, mostrando a relação entre a bactéria marinha Spirospiraceae ASxL5T e seus parentes próximos, E. coli U 5/41T como grupo externo. (B) Em comparação com T. oleivorans MIL-1T, a distribuição da categoria funcional dos genes é prevista com base no agrupamento do grupo ortólogo (COG) da proteína ASx5LT. A figura à esquerda mostra o número de genes em cada categoria funcional de COG em cada genoma. O gráfico à direita mostra a porcentagem de genomas contidos em cada grupo funcional COG. (C) Comparado com T. oleiverans MIL-1T, a análise da via modular KEGG (Enciclopédia de Genes e Genomas) completa de ASxL5T.
O uso do banco de dados KEGG para examinar os genes componentes presentes no genoma ASxL5T revelou a via metabólica típica do gama aeróbio Proteus. ASxL5T contém um total de 75 genes atribuídos a proteínas motoras bacterianas, incluindo genes envolvidos na quimiotaxia, montagem de flagelos e sistema de fímbrias tipo IV. Na última categoria, 9 em cada 10 genes são responsáveis ​​pelos movimentos de contração de uma série de outros organismos. O genoma do ASxL5T contém uma via biossintética completa da tetrahidropirimidina que participa da resposta protetora ao estresse osmótico20, como esperado para halófilos. O genoma também contém muitas vias completas para cofatores e vitaminas, incluindo vias de síntese de riboflavina. Embora o gene da alcano 1-monooxigenase (alkB2) esteja presente em ASxL5T, a via de utilização de hidrocarbonetos não está completa. Na sequência do genoma de ASxL5T, homólogos de genes identificados como os principais responsáveis ​​pela degradação de hidrocarbonetos em T. oleiverans MIL-1T21, como TOL_2658 (alkB) e TOL_2772 (álcool desidrogenase) estão obviamente ausentes. A Figura 3B mostra a comparação da distribuição gênica na categoria COG entre ASxL5T e azeite MIL-1T. No geral, o genoma ASxL5T menor contém proporcionalmente menos genes de cada categoria COG em comparação com o genoma relacionado maior. Quando o número de genes em cada categoria funcional é expresso como uma porcentagem do genoma, diferenças são notadas na porcentagem de genes nas categorias de tradução, estrutura ribossômica e biogênese, e nas categorias de produção de energia e função de conversão, que constituem o ASxL5T maior. genoma A porcentagem é comparada com o mesmo grupo presente no genoma MIL-1T de T. oleiverans. Em contraste, comparado com o genoma ASxL5T, T. oleivorans MIL-1T possui uma porcentagem maior de genes nas categorias de replicação, recombinação e reparo e transcrição. Curiosamente, a maior diferença no conteúdo de cada categoria funcional dos dois genomas é o número de genes desconhecidos presentes no ASxL5T (Figura 3B). Foi realizada uma análise de enriquecimento dos módulos KEGG, onde cada módulo KEGG representa um conjunto de unidades funcionais definidas manualmente para anotação e interpretação biológica dos dados da sequência do genoma. A comparação da distribuição gênica na via completa do módulo KOG de ASxL5T e olive MIL-1T é mostrada na Figura 3C. Esta análise mostra que embora ASxL5T tenha uma via metabólica completa de enxofre e nitrogênio, T. oleiverans MIL-1T não tem. Em contraste, T. oleiverans MIL-1T possui uma via metabólica completa de cisteína e metionina, mas é incompleta em ASxL5T. Portanto, ASxL5T possui um módulo característico para assimilação de sulfato (definido como um conjunto de genes que podem ser usados ​​como marcadores fenotípicos, como capacidade metabólica ou patogenicidade; https://www.genome.jp/kegg/module.html) Em T .oliverans MIL-1T. Comparar o conteúdo genético do ASxL5T com a lista de genes que sugerem um estilo de vida predatório é inconclusivo. Embora o gene waaL que codifica a ligase associada ao polissacarídeo do antígeno O ao núcleo esteja presente no genoma ASxL5T (mas é comum em muitas bactérias Gram-negativas), os genes da triptofano 2,3-dioxigenase (TDO) podem incluir os 60 aminoácidos regiões ácidas comumente encontradas em bactérias predadoras que não estão presentes. Não existem outros genes característicos predatórios no genoma ASxL5T, incluindo aqueles que codificam enzimas envolvidas na biossíntese de isoprenóides na via do mevalonato. Observe que não há gene regulador transcricional gntR no grupo de predadores examinado, mas três genes semelhantes a gntR podem ser identificados em ASxL5T.
As características fenotípicas de ASxL5T estão resumidas na Tabela 3 e comparadas com as características fenotípicas dos gêneros relacionados 23, 24, 25, 26 e 27 relatadas na literatura. Isolados de T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis e Oceanobacter kriegii são corpos em forma de bastonete ativos, tolerantes ao sal e oxidase positivos, mas quase não apresentam outras características fenotípicas com ASxL5T. O pH médio do oceano é 8,1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77), o que se reflete em T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis e O. kriegii. ASxL5T é adequado para a faixa maior de pH (4-9) típica de espécies não marinhas. Características fenotípicas de Thalassolituus sp. C2-1. Desconhecido. A faixa de temperatura de crescimento do ASxL5T é geralmente mais ampla do que a das cepas marinhas (4–42 °C), embora alguns, mas não todos, os isolados de T. marinus sejam tolerantes ao calor. A incapacidade de cultivar ASxL5T em caldo impediu uma caracterização fenotípica adicional. Use API 20E para testar os materiais raspados da placa BA, ONPG, arginina diidrolase, lisina descarboxilase, ornitina descarboxilase, utilização de citrato, urease, triptofano desaminase, enzima de hidrólise de gelatina, os resultados do teste foram todos negativos, mas sem indol, acetoína e H2S foram produzidos. Os carboidratos não fermentados incluem: glicose, manose, inositol, sorbitol, ramnose, sacarose, melibiose, amigdalina e arabinose. Comparado com as cepas de referência relacionadas publicadas, o perfil de ácidos graxos celulares da cepa ASxL5T é mostrado na Tabela 4. Os principais ácidos graxos celulares são C16:1ω6c e/ou C16:1ω7c, C16:0 e C18:1ω9. Também existem ácidos graxos hidroxi C12:0 3-OH e C10:0 3-OH. A proporção de C16:0 em ASxL5T é superior ao valor relatado de gêneros relacionados. Em contraste, em comparação com o T. marinus IMCC1826TT relatado, a proporção de C18:1ω7c e/ou C18:1ω6c em ASxL5T é reduzida. oleivorans MIL-1T e O. kriegii DSM 6294T, mas não detectado em B. sanyensis KCTC 32220T. A comparação dos perfis de ácidos graxos de ASxL5T e ASxLS revelou diferenças sutis na quantidade de ácidos graxos individuais entre as duas cepas, que são consistentes com a sequência de DNA genômico da mesma espécie. Nenhuma partícula de poli-3-hidroxibutirato (PHB) foi detectada usando o teste Sudan black.
A atividade de predação da bactéria ASxL5T foi estudada para determinar o alcance da presa. Esta bactéria pode formar placas em espécies de Campylobacter, incluindo: Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T; Escherichia coli NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; Clarii NCTC 11458 e C. upsaliensis NCTC 11541T. Use as culturas listadas na seção de determinação da gama de hospedeiros do método para testar uma gama mais ampla de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. Os resultados mostram que o ASxL5T também pode ser utilizado em Escherichia coli NCTC 86 e Citrobacter freundii NCTC 9750T. Placas formadas em Klebsiella oxytoca 11466. A interação TEM com E. coli NCTC 86 é mostrada na Figura 4A-D, e a interação com Campylobacter jejuni PT14 e Campylobacter suis S12 é mostrada na Figura 4E-H no meio. O mecanismo de ataque parece ser diferente entre os tipos de presas testados, com uma ou mais células de E. coli ligadas a cada célula ASxL5T e posicionadas lateralmente ao longo da célula estendida antes da adsorção. Em contraste, o ASxL5T parece se ligar ao Campylobacter através de um único ponto de contato, geralmente em contato com o ápice da célula predadora e próximo ao ápice da célula do Campylobacter (Figura 4H).
TEM mostrando a interação entre ASx5LT e presa: (AD) e presa de E. coli; (EH) e presas de C. jejuni. (A) Uma célula ASx5LT típica conectada a uma única célula de E. coli (EC); (B) Um ASx5LT filamentoso ligado a uma única célula CE; (C) Uma célula ASx5LT filamentosa conectada a múltiplas células CE; (D) Anexo Células ASx5LT menores em uma única célula de E. coli (EC); (E) uma única célula ASx5LT conectada a uma célula Campylobacter jejuni (CJ); (F) ASx5LT ataca células de C. hyointestinalis (CH); (G) duas células One ASx5LT atacaram uma célula CJ; (H) Uma visão aproximada do ponto de fixação ASx5LT, próximo ao ápice da célula CJ (barra 0,2 μm). A barra representa 1 μm em (A – G).
As bactérias predatórias evoluíram para tirar vantagem de fontes abundantes de presas. Obviamente, eles estão amplamente presentes em diversos ambientes. Devido ao tamanho estreito dos membros da população, é possível isolar bactérias ASxL5T da pasta utilizando o método de separação de fagos. A relevância genômica do ASxL5T para os membros da família de bactérias marinhas oceanospirilaceae é surpreendente, embora o organismo seja tolerante ao sal e possa crescer em um meio contendo 5% de sal. A análise da qualidade da água da lama mostrou que o teor de cloreto de sódio era inferior a 0,1%. Portanto, a lama está longe do ambiente marinho – tanto geográfica como quimicamente. A presença de três isolados relacionados, mas diferentes, da mesma fonte fornece evidências de que estes predadores estão prosperando neste ambiente não marinho. Além disso, a análise do microbioma (arquivos de dados disponíveis em https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990) mostrou que a mesma sequência do gene 16S rRNA está localizada entre os 50 táxons operacionais mais abundantes (OTU ) Em alguns intervalos de amostragem da lama. Várias bactérias não cultivadas foram encontradas no banco de dados do Genbank, que possuem sequências do gene 16S rRNA semelhantes às bactérias ASxL5T. Estas sequências, juntamente com as sequências de ASxL5T, ASxS5 e ASxO5, parecem representar diferentes clados separados de Thalassolituus e Oceanobacter (Figura 2). Três tipos de bactérias não cultivadas (GQ921362, GQ921357 e GQ921396) foram isoladas da água da fissura a uma profundidade de 1,3 quilômetros na mina de ouro da África do Sul em 2009, e os outros dois (DQ256320 e DQ337006) eram de águas subterrâneas (também na África do Sul). em 2005). A sequência do gene 16S rRNA mais intimamente relacionada com ASxL5T faz parte da sequência do gene 16S rRNA obtida a partir da cultura de enriquecimento de sedimentos arenosos obtidos nas praias do norte da França em 2006 (número de acesso AM29240828). Outra sequência do gene 16S rRNA intimamente relacionada da bactéria não cultivada HQ183822.1 foi obtida de um tanque de coleta lixiviado de um aterro municipal na China. Obviamente, as bactérias ASxL5T não são altamente representativas em bases de dados taxonómicas, mas é provável que estas sequências de bactérias não cultivadas representem organismos semelhantes a ASxL5T, que estão distribuídos por todo o mundo, geralmente em ambientes desafiantes. Da análise filogenética do genoma completo, o parente mais próximo do ASxL5T é Thalassolituus sp. C2-1, T. marinus, T. oleivorans. E O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus é um membro da bactéria marinha obrigatória de fragmentação de hidrocarbonetos (OHCB), que é difundida em ambientes marinhos e terrestres, e geralmente se torna dominante após incidentes de poluição por hidrocarbonetos . As bactérias marinhas não são membros do grupo OHCB, mas estão isoladas do ambiente marinho.
Dados fenotípicos indicam que ASxL5T é uma espécie nova e membro de um gênero anteriormente não reconhecido na família das espirospiráceas marinhas. Atualmente não existe um padrão claro para classificar cepas recentemente isoladas em um novo gênero. Têm sido feitas tentativas para determinar os limites universais dos géneros, por exemplo, com base na percentagem do genoma de uma proteína conservadora (POCP), recomenda-se que o valor de corte seja 50% idêntico ao da estirpe de referência33. Outros sugerem a utilização de valores de AAI, que apresentam vantagens sobre o POCP porque podem ser obtidos a partir de genomas incompletos34. O autor acredita que se o valor do AAI for inferior a 74% em comparação com a cepa modelo da espécie modelo, a cepa é representativa de um gênero diferente. O gênero modelo nas espirilláceas marinhas é o spirillum marinho, e a cepa modelo é O. linum ATCC 11336T. O valor de AAI entre ASxL5T e O. linum ATCC 11336T é de 54,34%, e o valor de AAI entre ASxL5T e T. oleivorans MIL-1T (cepas do tipo gênero) é de 67,61%, indicando que ASxL5T representa um novo gênero diferente de Thalassolituus. Utilizando a sequência do gene 16S rRNA como padrão de classificação, o limite de delimitação do gênero sugerido é de 94,5%35. ASxL5T pode ser colocado no gênero Thalassolituus, mostrando 95,03% de identidade de sequência 16S rRNA com T. oleivorans MIL-1T e 96,17%. marinus IMCC1826T. No entanto, também será colocado no gênero Bacteroides que possui 94,64% de identidade do gene 16S rRNA com B. sanyensis NV9, indicando que o uso de um único gene, como o gene 16S rRNA, pode levar a classificação e atribuição arbitrárias. Outro método sugerido usa ANI e Pontuação de Alinhamento do Genoma (AF) para examinar o agrupamento de pontos de dados de todos os tipos e cepas não-tipo de gêneros existentes. O autor recomenda combinar o limite do gênero com o ponto de inflexão do gênero estimado específico para os táxons analisados. No entanto, se não houver sequências genómicas completas suficientes dos isolados de Thalassolituus, é impossível determinar se ASxL5T pertence ao género Thalassolituus por este método. Devido à disponibilidade limitada de sequências genômicas completas para análise, toda a árvore filogenética do genoma deve ser interpretada com cautela. Em segundo lugar, os métodos de comparação do genoma completo não podem explicar diferenças substanciais no tamanho dos genomas comparados. Eles mediram a similaridade de genes conservados de cópia única entre gêneros relacionados, mas não levaram em consideração o grande número de genes que não estão presentes no genoma muito menor de ASxL5T. Obviamente, ASxL5T e grupos como Thalassolituus, Oceanobacter e Bacterioplanes têm um ancestral comum, mas a evolução tomou um caminho diferente, levando a uma redução no genoma, que pode ser uma adaptação a um estilo de vida predatório. Isto contrasta com o T. oleivorans MIL-1T, que é 28% maior e evoluiu sob diferentes pressões ambientais para utilizar hidrocarbonetos . Uma comparação interessante pode ser feita com parasitas intracelulares obrigatórios e simbiontes, como Rickettsia, Chlamydia e Buchnera. O tamanho do genoma é de cerca de 1 Mb. A capacidade de utilizar metabólitos da célula hospedeira leva à perda de genes, portanto, sofreu degradação genômica evolutiva significativa. Mudanças evolutivas de organismos marinhos com nutrientes químicos para estilos de vida predatórios podem resultar numa redução semelhante no tamanho do genoma. A análise COG e KEGG destaca o número de genes utilizados para funções específicas e as diferenças globais nas vias genômicas entre ASxL5T e T. oleivorans MIL-1T, que não se devem à ampla disponibilidade de elementos genéticos móveis. A diferença na razão G + C de todo o genoma de ASxL5T é de 56,1%, e a de T. oleivorans MIL-1T é de 46,6%, o que também indica que é segregado.
O exame do conteúdo codificante do genoma ASxL5T fornece insights funcionais sobre características fenotípicas. A presença de genes que codificam fímbrias tipo IV (Tfp) é de particular interesse porque promovem o movimento celular, denominado deslizamento social ou convulsões, sem flagelos na superfície. Segundo relatos, a Tfp tem outras funções, incluindo predação, patogênese, formação de biofilme, captação natural de DNA, agregação e desenvolvimento celular automático38. O genoma ASxL5T contém 18 genes que codificam a diguanilato ciclase (uma enzima que catalisa a conversão de 2 guanosina trifosfato em guanosina 2 fosfato e diGMP cíclico) e 6 genes que codificam o correspondente diguanilato ciclase fosfato diguanilato. O gene da esterase (catalisando a degradação do di-GMP cíclico em monofosfato de guanosina) é interessante porque o cic-di-GMP é um importante segundo mensageiro envolvido no desenvolvimento e separação do biofilme, movimento, fixação celular e virulência 39, 40 no processo. Deve-se notar também que em Bdellovibrio bacteriovorus, foi demonstrado que o duplo GMP cíclico controla a transição entre a vida livre e o estilo de vida predatório .
A maioria das pesquisas sobre bactérias predadoras concentrou-se em Bdellovibrio, organismos semelhantes a Bdellovibrio e espécies de Myxococcus. Estes e outros exemplos conhecidos de bactérias predadoras formam um grupo diversificado. Apesar desta diversidade, foi identificado um conjunto de famílias de proteínas características que refletem os fenótipos de 11 bactérias predadoras conhecidas3,22. No entanto, apenas foram identificados genes que codificam a ligase do antígeno O (waaL), o que é particularmente comum em bactérias Gram-negativas. Esta forma de análise não é útil para designar o ASxL5T como predador, provavelmente porque utiliza uma nova estratégia de ataque. A disponibilidade de genomas bacterianos predatórios mais diversos ajudará a desenvolver análises de resolução mais refinadas que levem em conta evidências de diferenças funcionais e ambientais entre os membros do grupo. Exemplos de bactérias predadoras não incluídas nesta análise incluem membros de Cupriavidus necator42 e Bradymonabacteria43, porque à medida que os investigadores investigam diferentes comunidades microbianas, são estabelecidos mais taxa predatórios.
A característica mais notável das bactérias ASxL5T capturadas pela imagem TEM é sua morfologia única e flexível, que pode promover a interação com bactérias presas. O tipo de interação observada é diferente de outras bactérias predadoras e não foi descoberta ou relatada anteriormente. O ciclo de vida predatório ASxL5T proposto é mostrado na Figura 5. Existem poucos exemplos na literatura com estruturas apicais semelhantes às relatadas aqui, mas esses exemplos incluem Terasakiispira papahanaumokuakeensis, uma bactéria spirillum marinha com alargamento ocasional do ápice 44, e Alphaproteobacteria, Terasakiella pusilla , anteriormente pertencente ao gênero Oceanospirillum, exibindo o chamado "filme polar" 45. As formas de cocos são frequentemente observado em culturas mais antigas, especialmente para bactérias com formas curvas, como Vibrio, Campylobacter e Helicobacter 46, 47, 48, que podem representar um estado degradado. Mais trabalhos são necessários para esclarecer o ciclo de vida preciso da bactéria ASxL5T. Determinar como ele captura e ataca, e se seu genoma codifica compostos biologicamente ativos que podem ser usados ​​para fins médicos ou biotecnológicos.
Descrição de Venatorbacter gen. Novembro Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. é composto por venators de L. n. venator,'caçador' e Gr. n. bacter,'uma vara'. Venatorbacter,'uma vara de caça' . As células são aeróbicas, tolerantes ao sal, coloração de Gram curva negativa, atividade da catalase e da oxidase não se acumulam na faixa de temperatura de 4 a 42 °C. a faixa de 4-9 é incomum. Em caracóis marinhos, a maioria é intolerante ao pH ácido. Os principais ácidos graxos são C16:1ω6c e/ou C16:1ω7c, C16:0 e C18:1ω9 ; :0 3-OH são encontrados como hidroxiácidos graxos. Eles não crescem em caldo. O conteúdo de DNA G + C é de 56,1% em mol. Membros deste gênero apresentam resistência a Campylobacter e ao comportamento de predação de membros da família Enterobacteriaceae. A posição filogenética deste gênero está na família.
Descrição de Venatorbacter cucullus sp. Novembro Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus significa carenagem).
Além disso, a característica descritiva deste gênero é que quando cultivadas em BA ou BHI, as células têm 1,63 µm de comprimento e 0,37 µm de largura. As colônias no ágar BHI são muito pequenas, atingindo 2 mm de diâmetro após 72 horas. São bege, translúcidos, redondos, convexos e brilhantes. Os membros desta espécie podem usar Escherichia coli e Klebsiella. Campylobacter e várias outras bactérias Gram-negativas servem como presas.
A cepa típica ASxL5T foi isolada de leite bovino em Nottinghamshire, Reino Unido, e depositada na National Type Culture Collection (Reino Unido): número de acesso NCTC 14397 e número de acesso da Dutch Bacterial Culture Collection (NCCB) NCCB 100775. A sequência completa do genoma de ASxL5T foi depositado no Genbank conforme acréscimo do CP046056.
As bactérias ASxL5T foram isoladas do leite bovino usando tecnologia de isolamento de fagos9,49. A pasta foi diluída 1:9 (p/v) em tampão SM (Tris-HCl 50 mM [pH 7,5], NaCl 0,1 M, MgSO4.7H2O 8 mM e gelatina 0,01%; Sigma Aldrich, Gillingham, Reino Unido). a 4°C durante 24 horas, girando lentamente para eluir os predadores para o tampão. A suspensão foi centrifugada a 3000g por 3 minutos. O sobrenadante foi coletado e centrifugado a 13.000g pela segunda vez por 5 minutos. O sobrenadante foi então passado através de um filtro de membrana de 0,45 µm (Minisart; Sartorius, Gottingen, Alemanha) e um filtro de membrana de 0,2 µm (Minisart) para remover quaisquer células bacterianas restantes. ASxL5T pode passar por esses filtros. Um gramado de ágar macio de Campylobacter enterosus S12 (número de acesso NCBI CP040464) a partir da mesma pasta foi preparado usando técnicas padrão. A pasta filtrada foi distribuída em cada uma destas placas de células hospedeiras em gotículas de 10 µl em triplicado e deixada secar. A placa foi incubada em tanque microaerofílico a 37°C por 48 horas sob condições microaeróbicas (5% O2, 5% H2, 10% CO2 e 80% N2). A placa visível obtida foi extraída em tampão SM e transferida para o gramado fresco de C. hyointestinalis S12 para propagar ainda mais os organismos lisados. Uma vez determinado que as bactérias são a causa da placa lítica e não o fago, tente fazer crescer o organismo independentemente do hospedeiro e caracterizá-lo melhor. A cultura aeróbica foi realizada a 37 ° C com sangue de cavalo desfibrinado a 5% v / v (TCS Biosciences Lt, Buckingham, Reino Unido, suplemento). De acordo com as diretrizes do Comitê Nacional de Padrões Clínicos, o método de difusão em disco é usado para testes de suscetibilidade antibacteriana. O ágar BHI foi cultivado a 37 °C utilizando um disco contendo os seguintes antibióticos (Oxoid) para cultura aeróbia: amoxicilina e ácido clavulânico 30 µg; cefotaxima 30 µg; estreptomicina 10 µg; ciprofloxacina 5 µg; Ceftazidima 30 µg Ácido nalidíxico 30 µg; Imipenem 10 µg; Azitromicina 15 µg; Cloranfenicol 30 µg; Cefoxitina 30 µg; Tetraciclina 30 µg; Nitrofurantoína 300 µg; Aztreonam 30 µg; Ampicilina 10 µg; Cefpodoxima 10 µg; Trimetoprim-Sulfametoxazol 25 µg. A tolerância ao sal foi estabelecida por incubação aeróbica em placas de ágar BHI a 37 °C. NaCl adicional foi adicionado às placas de ágar BHI para fornecer uma faixa de concentração de até 10% p/v. A faixa de pH é determinada por cultura aeróbica em placas de ágar BHI a 37°C, onde a faixa de pH foi ajustada para entre 4 e 9 com HCl estéril ou NaOH estéril, e o valor de pH alvo é verificado antes de despejar a placa. Para análise de ácidos graxos celulares, o ASxL5T foi cultivado em ágar BHI por 3 dias e aeróbio a 37 °C. De acordo com o protocolo padrão MIDI (Sherlock Microbial Identification System, versão 6.10) da FERA Science Ltd, (York, Reino Unido), os ácidos graxos celulares foram extraídos, preparados e analisados.
Para TEM, ASxL5T foi cultivado aeróbio espalhando-se uniformemente em BA a 37°C por 24 horas e depois colhido em 1 ml de glutaraldeído a 3% (v/v) em tampão cacodilato 0,1 M em temperatura ambiente Fix por 1 hora, depois centrifugar a 10.000 g por 3 minutos. Em seguida, ressuspender suavemente o pellet em 600 μl de tampão cacodilato 0,1 M. Transfira a suspensão ASxL5T fixa para o filme Formvar/carbono em uma grade de cobre de malha 200. As bactérias foram coradas com acetato de uranila a 0,5% (p/v) durante 1 minuto e examinadas por TEM utilizando um microscópio TEI Tecnai G2 12 Biotwin. Como mencionado acima, combinar o mesmo número de presas e predadores em caldo NZCYM (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) e incubar durante 48 horas sob condições microaeróbicas de Campylobacter ou Campylobacter a 37°C. também foi examinado por TEM. Condições aeróbicas para Escherichia coli. Examine de forma independente presas e bactérias predadoras para determinar quaisquer alterações na morfologia celular devido à predação. O método Sudan black foi utilizado para microscopia óptica de acumulação de PHB.
Cultive culturas ASxL5T durante a noite espalhando o crescimento em placas BHI ou BA com um cotonete estéril. Colete células ASxL5T e suspenda-as em MRD (CM0733, Oxoid) e depois coloque-as a 4°C por 7 dias para matar as células de fome. A referência NCTC ou cultura bacteriana estoque de laboratório foi inoculada em caldo BHI ou caldo nutriente No. 2 (CM007, Oxoid), incubada durante a noite, centrifugada a 13.000 g e ressuspensa em MRD até que a DO600 fosse 0,4. Cultura: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, Klebsiella oxytoca 11466, Leuconostoc NCTC 10817, Listeria Special bacteria NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, hambúrguer submarino Rhodococcus NCTC 1621T, bactéria intestinal Salmonella Mondeville NCTC 5747, mucilagem NCTC 10861, Staphylococcus aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. O hospedeiro Campylobacter foi incubado microaerobicamente em placas BA a 37°C e suspenso em caldo NZCYM. Os hospedeiros Campylobacter testados são: C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11458, C. lari NCTC 11458, C. jejuni PT14 , C... Coletar células em MRD, centrifugar a 13.000g e ressuspender em MRD até que OD600 seja 0,4. Adicione uma alíquota de 0,5 ml de suspensão a 5 ml de ágar superior NZCYM derretido (ágar 0,6%) e despeje-o em uma placa inferior NZCYM a 1,2%. Após cura e secagem, o ASxL5T diluído em série foi distribuído como gotículas de 20 µl em cada tábua de gramado em triplicado. A temperatura e a atmosfera da cultura dependem dos requisitos das bactérias de teste.
Use o GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma Aldridge) para preparar DNA a partir de isolados bacterianos. Métodos padrão foram utilizados para amplificação por PCR do gene 16S rRNA e determinação da sequência do produto utilizando química de terminação de corante (Eurofins Value Read Service, Alemanha). Use o programa BLAST-N para comparar essas sequências com outras sequências do gene 16S rRNA para identificar e coletar espécies intimamente relacionadas. Estes são alinhados usando ClustalW no programa MEGA X. A árvore filogenética foi reconstruída usando MEGA X utilizando o método de máxima verossimilhança baseado no modelo Tamura-Nei, com 1000 cópias guiadas54. Use o kit PureLink™ Genomic DNA (Fisher Scientific, Loughborough, Reino Unido) para extrair DNA para sequenciamento do genoma completo. A sequência do genoma do ASxL5T foi determinada usando a combinação Illumina MiSeq, que consiste em leituras duplas de 250 pb compostas por uma biblioteca preparada usando o kit de rotulagem Nextera e leituras longas de 2 a 20 kb da plataforma PacBio. Centro de Pesquisa de Sequenciamento de DNA Genômico na Universidade de Sembia. O genoma foi montado usando CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen, Aarhus, Dinamarca). As culturas ASxL5T são depositadas na National Type Culture Collection (Reino Unido) e na Dutch Bacterial Culture Collection (NCCB). Os genomas de organismos relacionados utilizados para comparação são: Thalassolituus oleivorans MIL-1T (número de acesso HF680312, completo); Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (número de acesso BMYY01000001, incompleto); Oceanobacter kriegii DSM 6294T (número de acesso NZ_AUGV00000000, incompleto); Comunidade Marinamonas DSM 5604T (adicionado ASM436330v1, incompleto), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (adicionado MTSD02000001, incompleto) e Thalassolituus sp. C2-1 (adicionar NZ_VNIL01000001, incompleto). Use o JGI Genome Portal36 em https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page= para determinar a pontuação de alinhamento (AF) e a identidade média de ácido nucleico (ANI). Em pares. O método de Rodriguez-R & Konstantinidis55 foi utilizado para determinar a identidade de aminoácidos (IAA). Use GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 para gerar uma árvore filogenética de máxima verossimilhança estimada. O genoma de entrada que representa o genoma de referência disponível é selecionado a partir de gêneros de referência identificados como relacionados ao ASxL5T da filogenia 16S rRNA. Anotou a árvore usando a ferramenta on-line interativa da árvore da vida (https://itol.embl.de/). A anotação funcional e a análise do genoma ASxL5T são realizadas usando a ferramenta online BlastKOALA KEGG usando a distribuição de enriquecimento do módulo KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). A distribuição das categorias COG (grupos ortólogos) é determinada usando a ferramenta online eggNOG-mapper.
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