Un nou tip de bacterii Gram-negative, aerobe, tolerante la sare, active, în formă de baston și prădătoare ASxL5T a fost izolat dintr-un iaz de bălegar de vacă din Nottinghamshire, Anglia, și a folosit Campylobacter ca pradă. Ulterior, alte specii de Campylobacter și membri ai familiei Enterobacteriaceae au fost descoperite ca pradă. După subcultură fără celule gazdă, s-a realizat o creștere aseptică slabă pe Brain Heart Infusion Agar. Condițiile optime de creștere sunt 37 °C și pH-ul este de 7. Microscopia electronică cu transmisie a evidențiat câteva caracteristici morfologice foarte neobișnuite legate de disponibilitatea prăzii. Analiza filogenetică folosind secvența genei ARNr 16S a indicat că izolatul este înrudit cu un membru al familiei Spirulina marine, dar nu poate fi clasificat în mod clar ca membru al vreunui gen cunoscut. Secvențierea întregului genom a ASxL5T a confirmat relația cu membrii spirochetelor marine. O căutare în baza de date a arătat că mai multe ASxL5T împărtășesc secvențele genei ARNr 16S cu mai multe bacterii necultivate din ocean, suprafața terestră și apele subterane. Sugerăm că tulpina ASxL5T reprezintă o nouă specie într-un nou gen. Vă recomandăm numele Venatorbacter cucullus gen. noiembrie, sp. În noiembrie, ASxL5T a fost folosită ca tip de tulpină.
Bacteriile prădătoare sunt bacterii care prezintă capacitatea de a vâna și ucide alte bacterii vii pentru a obține materiale biosintetice și energie. Aceasta este diferită de recuperarea generală a nutrienților din microorganismele moarte și este, de asemenea, diferită de interacțiunile parazitare, în care bacteriile formează o relație strânsă cu gazda lor fără a le ucide. Bacteriile prădătoare au evoluat diferite cicluri de viață pentru a profita de sursele de hrană abundente în nișele în care se găsesc (cum ar fi habitatele marine). Ele reprezintă un grup divers din punct de vedere taxonom, care sunt conectate doar prin ciclul lor unic de viață de sterilizare1. Exemple de bacterii prădătoare au fost găsite în mai multe phyla diferite, inclusiv: Proteobacteria, Bacteroides și Chlorella.3. Cu toate acestea, cele mai bine studiate bacterii prădătoare sunt Bdellovibrio și Bdellovibrio și organisme asemănătoare (BALOs4). Bacteriile prădătoare sunt o sursă promițătoare de noi compuși biologic activi și agenți antibacterieni5.
Se crede că bacteriile prădătoare sporesc diversitatea microbiană și au un impact pozitiv asupra sănătății, productivității și stabilității ecosistemului6. În ciuda acestor atribute pozitive, există puține studii asupra noilor bacterii prădătoare din cauza dificultății de a cultiva bacterii și a necesității de a observa cu atenție interacțiunile celulare pentru a înțelege ciclurile lor complexe de viață. Aceste informații nu sunt ușor de obținut din analiza computerizată.
Într-o eră de creștere a rezistenței antimicrobiene, sunt studiate noi strategii de țintire a agenților patogeni bacterieni, cum ar fi utilizarea bacteriofagelor și a bacteriilor prădătoare7,8. Bacteriile ASxL5T au fost izolate în 2019 folosind tehnologia de izolare a fagilor din bălegarul de vacă colectat de la Centrul de produse lactate al Universității din Nottingham, Nottinghamshire. Scopul investigației este izolarea organismelor cu potențial ca agenți de control biologic. Campylobacter hyointestinalis este un patogen zoonotic, care este din ce în ce mai mult asociat cu bolile intestinale umane10. Este omniprezent în ser și folosit ca gazdă țintă.
Bacteria ASxL5T a fost izolată din jeleul de vită deoarece s-a observat că plăcile pe care le-a format pe gazonul de C. hyointestinalis erau similare cu cele produse de bacteriofagi. Aceasta este o descoperire neașteptată, deoarece o parte a procesului de izolare a fagilor implică filtrarea printr-un filtru de 0,2 µm, care este conceput pentru a îndepărta celulele bacteriene. Examinarea microscopică a materialului extras din placă a arătat că bacteriile mici gram-negative curbate în formă de tijă nu au acumulat polihidroxibutirat (PHB). Cultura aseptică independentă de celulele pradă este realizată pe mediu solid bogat (cum ar fi agar-infuzie pentru inimă cerebrală (BHI) și agar-sânge (BA)), iar creșterea sa este slabă. Se obține după subcultură cu inocul greu îmbunătățit. Se dezvoltă la fel de bine în condiții microaerobe (7% v/v oxigen) și în condiții de oxigen atmosferic, dar nu într-o atmosferă anaerobă. După 72 de ore, diametrul coloniei era foarte mic, ajungând la 2 mm, și era bej, translucid, rotund, convex și strălucitor. Testarea biochimică standard este îngreunată deoarece ASxL5T nu poate fi cultivat în mod fiabil în medii lichide, ceea ce sugerează că se poate baza pe ciclul de viață complex al formării biofilmului. Cu toate acestea, suspensia plăcii a arătat că ASxL5T este aerob, pozitiv pentru oxidază și catalază și poate tolera 5% NaCl. ASxL5T este rezistent la 10 µg streptomicina, dar este sensibil la toate celelalte antibiotice testate. Celulele bacteriene ASxL5T au fost examinate prin TEM (Figura 1). Când sunt crescute fără celule de pradă pe BA, celulele ASxL5T sunt Campylobacter mici, cu o lungime medie de 1,63 μm (± 0,4), o lățime de 0,37 μm (± 0,08) și un singur pol lung (până la 5 μm). Flageli sexuali. Aproximativ 1,6% dintre celule par să aibă o lățime mai mică de 0,2 μm, ceea ce va permite trecerea prin dispozitivul de filtrare. O extensie structurală neobișnuită a fost observată pe partea superioară a unor celule, asemănătoare cu un caren (cucullus latin) (vezi săgețile din 1D, E, G). Aceasta pare să fie compusă din exces de membrană exterioară, care se poate datora reducerii rapide a dimensiunii învelișului periplasmatic, în timp ce membrana exterioară rămâne intactă, prezentând un aspect „lax”. Cultivarea ASxL5T în absența nutrienților (în PBS) pentru o lungă perioadă de timp la 4 ° C a dus la majoritatea (dar nu toate) celulele care prezintă o morfologie cocică (Figura 1C). Când ASxL5T crește cu Campylobacter jejuni ca pradă timp de 48 de ore, dimensiunea medie a celulei este semnificativ mai lungă și mai îngustă decât celulele crescute fără gazdă (Tabelul 1 și Figura 1E). În schimb, atunci când ASxL5T crește cu E. coli ca pradă timp de 48 de ore, dimensiunea medie a celulei este mai lungă și mai largă decât atunci când crește fără pradă (Tabelul 1), iar lungimea celulei este variabilă, de obicei prezentând filamentos (Figura 1F). Când au fost incubate cu Campylobacter jejuni sau E. coli ca pradă timp de 48 de ore, celulele ASxL5T nu au prezentat flageli deloc. Tabelul 1 rezumă observațiile privind modificările dimensiunii celulei pe baza prezenței, absenței și tipului de pradă ASxL5T.
Afișajul TEM al ASx5LT: (A) ASx5LT arată biciul lung; (B) baterie tipică ASx5LT; (C) celule de coci ASx5LT după incubare lungă fără nutrienți; (D) un grup de celule ASx5LT prezintă o anomalie (E) Grupul de celule ASx5LT incubat cu prada Campylobacter a prezentat o lungime crescută a celulei în comparație cu cele fără creșterea prazii (D) a prezentat, de asemenea, structură apicală; (F) Flageli filamentoși mari, celule ASx5LT, după incubarea cu prada E. coli; (G) O singură celulă ASx5LT după incubarea cu E. coli, prezentând o structură superioară neobișnuită. Bara reprezintă 1 μm.
Determinarea secvenței genei ARNr 16S (numărul de acces MT636545.1) permite căutările în bazele de date pentru a stabili secvențe similare cu cele din clasa Gammaproteobacteria și sunt cele mai apropiate de bacteriile marine din familia spirillum marine (Figura 2) și sunt membri ai genului Thalassolituus Cea mai apropiată rudă de Bacillus Marin. Secvența genei ARNr 16S este în mod clar diferită de bacteriile prădătoare aparținând familiei Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria). Comparațiile perechi ale B. bacteriovorus HD100T (tulpina tip, DSM 50701) și B. bacteriovorus DM11A au fost de 48,4% și 47,7%, iar pentru B. exovorus JSS a fost de 46,7%. Bacteriile ASxL5T au 3 copii ale genei ARNr 16S, dintre care două sunt identice una cu cealaltă, iar a treia este la 3 baze. Alte două izolate bacteriene prădătoare (ASx5S și ASx5O; numerele de acces ale genei ARNr 16S sunt MT636546.1 și, respectiv, MT636547.1) cu caracteristici morfologice și fenotipice similare din aceeași locație nu sunt aceleași, dar sunt diferite de ASxL5T și de bacteriile necultivate. secvențele de baze de date sunt grupate împreună cu alte genuri din Oceanospirillaceae (Figura 2). Întreaga secvență a genomului ASxL5T a fost determinată și salvată în baza de date NCBI, iar numărul de acces este CP046056. Genomul ASxL5T constă dintr-un cromozom circular de 2.831.152 bp cu un raport G + C de 56,1%. Secvența genomului conține 2653 CDS (total), dintre care 2567 se preconizează că codifică proteine, dintre care 1596 pot fi atribuite ca funcții presupuse (60,2%). Genomul conține 67 de gene care codifică ARN, inclusiv 9 ARNr (câte 3 pentru 5S, 16S și 23S) și 57 tARN. Caracteristicile genomice ale ASxL5T au fost comparate cu genomurile disponibile ale tulpinilor de cel mai apropiat tip relativ identificat din secvența genei ARNr 16S (Tabelul 2). Utilizați identitatea aminoacizilor (AAI) pentru a compara toate genomurile Thalassolituus disponibile cu ASxL5T. Cea mai apropiată secvență de genom disponibilă (incompletă) determinată de AAI este Thalassolituus sp. C2-1 (adăugați NZ_VNIL01000001). Această tulpină a fost izolată din sedimentele de adâncime ale șanțului Marianei, dar în prezent nu există informații fenotipice despre această tulpină pentru comparație. În comparație cu 2,82 Mb al lui ASxL5T, genomul organismului este mai mare la 4,36 Mb. Dimensiunea medie a genomului spirochetelor marine este de aproximativ 4,16 Mb (± 1,1; n = 92 genomi de referință complet investigați de la https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), astfel încât genomul ASxL5T este în conformitate cu ordine În comparație cu ceilalți membri, este destul de mic. Utilizați GToTree 1.5.54 pentru a genera un arbore filogenetic cu probabilitate maximă estimată bazat pe genom (Figura 3A), folosind secvențele de aminoacizi aliniate și legate ale a 172 de gene cu o singură copie specifice Gammaproteobacteria 11,12,13,14,15,16, 17,18. Analiza a arătat că este strâns legată de Thalassolituus, Bacterial Plane și Marine Bacterium. Cu toate acestea, aceste date indică faptul că ASxL5T este diferit de rudele sale din Spirulina marine și sunt disponibile datele despre secvența genomului său.
Arborele filogenetic care utilizează secvența genei ARNr 16S evidențiază poziția tulpinilor ASxL5T, ASxO5 și ASxS5 (cu intestine) în raport cu tulpinile de bacterii marine necultivate și din Spirulinaceae marine. Numărul de acces Genbank urmează numele tulpinii dintre paranteze. Utilizați ClustalW pentru a alinia secvențele și utilizați metoda probabilității maxime și modelul Tamura-Nei pentru a deduce relații filogenetice și efectuați 1000 de replicări ghidate în programul MEGA X. Numărul de pe ramură indică faptul că valoarea copiei ghidate este mai mare de 50%. Escherichia coli U/541T a fost utilizat ca un grup extern.
(A) Un arbore filogenetic bazat pe genom, care arată relația dintre bacteria Spirospiraceae marine ASxL5T și rudele sale apropiate, E. coli U 5/41T ca un grup extern. (B) În comparație cu T. oleivorans MIL-1T, distribuția categoriei funcționale a genelor este prezisă pe baza grupului ortolog (COG) al proteinei ASx5LT. Figura din stânga arată numărul de gene din fiecare categorie funcțională COG din fiecare genom. Graficul din dreapta arată procentul de genom conținut în fiecare grup funcțional COG. (C) În comparație cu T. oleiverans MIL-1T, analiza căii modulare complete KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) a ASxL5T.
Utilizarea bazei de date KEGG pentru a examina genele componente prezente în genomul ASxL5T a dezvăluit calea metabolică tipică a gama Proteus aerobă. ASxL5T conține un total de 75 de gene atribuite proteinelor motorii bacteriene, inclusiv gene implicate în chemotaxie, asamblarea flagelilor și sistemul de fimbrie de tip IV. În ultima categorie, 9 din 10 gene sunt responsabile pentru mișcarea de zguduire a unei game de alte organisme. Genomul ASxL5T conține o cale biosintetică completă a tetrahidropirimidinei care participă la răspunsul protector la stresul osmotic20, așa cum era de așteptat pentru halofili. Genomul conține, de asemenea, multe căi complete pentru cofactori și vitamine, inclusiv căile de sinteză a riboflavinei. Deși gena alcan 1-monooxigenază (alkB2) este prezentă în ASxL5T, calea de utilizare a hidrocarburilor nu este completă. În secvența genomului ASxL5T, omologii genelor identificate ca fiind responsabili în principal pentru degradarea hidrocarburilor din T. oleiverans MIL-1T21, cum ar fi TOL_2658 (alkB) și TOL_2772 (alcool dehidrogenaza) sunt în mod evident absenți. Figura 3B arată comparația distribuției genelor în categoria COG între ASxL5T și uleiul de măsline MIL-1T. În general, genomul ASxL5T mai mic conține proporțional mai puține gene din fiecare categorie COG în comparație cu genomul înrudit mai mare. Când numărul de gene din fiecare categorie funcțională este exprimat ca procent din genom, se notează diferențe în procentul de gene din categoriile de traducere, structura ribozomală și biogeneză și categoriile de funcții de producere și conversie a energiei, care constituie ASxL5T mai mare. genomul Procentul este comparat cu același grup prezent în genomul T. oleiverans MIL-1T. În schimb, în ​​comparație cu genomul ASxL5T, T. oleivorans MIL-1T are un procent mai mare de gene în categoriile de replicare, recombinare și reparare și transcripție. În mod interesant, cea mai mare diferență în conținutul fiecărei categorii funcționale a celor două genomi este numărul de gene necunoscute prezente în ASxL5T (Figura 3B). A fost efectuată o analiză de îmbogățire a modulelor KEGG, în care fiecare modul KEGG reprezintă un set de unități funcționale definite manual pentru adnotarea și interpretarea biologică a datelor secvenței genomului. Comparația distribuției genelor în calea completă a modulului KOG a ASxL5T și oliv MIL-1T este prezentată în Figura 3C. Această analiză arată că, deși ASxL5T are o cale metabolică completă a sulfului și azotului, T. oleiverans MIL-1T nu o are. În schimb, T. oleiverans MIL-1T are o cale metabolică completă a cisteinei și metioninei, dar este incompletă în ASxL5T. Prin urmare, ASxL5T are un modul caracteristic pentru asimilarea sulfatului (definit ca un set de gene care pot fi folosite ca markeri fenotipici, cum ar fi capacitatea metabolică sau patogenitatea; https://www.genome.jp/kegg/module.html) În T .leiverans MIL-1T. Compararea conținutului de gene al ASxL5T cu lista de gene care sugerează un stil de viață prădător este neconcludentă. Deși gena waaL care codifică ligaza asociată cu polizaharida antigenului O la miez este prezentă în genomul ASxL5T (dar este comună la multe bacterii Gram-negative), genele triptofan 2,3-dioxigenază (TDO) pot include cei 60 de aminoacizi. regiuni acide întâlnite frecvent în bacteriile prădătoare care nu sunt prezente. Nu există alte gene caracteristice prădătoare în genomul ASxL5T, inclusiv cele care codifică enzimele implicate în biosinteza izoprenoidului în calea mevalonatului. Rețineți că nu există o genă reglatoare transcripțională gntR în grupul de prădători examinat, dar trei gene asemănătoare gntR pot fi identificate în ASxL5T.
Caracteristicile fenotipice ale ASxL5T sunt rezumate în Tabelul 3 și comparate cu caracteristicile fenotipice ale genurilor înrudite 23, 24, 25, 26 și 27 raportate în literatură. Izolatele din T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis și Oceanobacter kriegii sunt corpi activi, toleranți la sare, oxidază-pozitivi în formă de baston, dar aproape că nu au alte caracteristici fenotipice cu ASxL5T. pH-ul mediu al oceanului este de 8,1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77), ceea ce se reflectă în T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis și O. kriegii. ASxL5T este potrivit pentru intervalul mai mare de pH (4-9) tipic speciilor nemarine. Caracteristicile fenotipice ale Thalassolituus sp. C2-1. Necunoscut. Intervalul de temperatură de creștere al ASxL5T este în general mai larg decât cel al tulpinilor marine (4–42 ° C), deși unele, dar nu toate izolatele de T. marinus sunt tolerante la căldură. Incapacitatea de a crește ASxL5T în medii de bulion a împiedicat caracterizarea fenotipică ulterioară. Utilizați API 20E pentru a testa materialele răzuite de pe placa BA, ONPG, arginina dihidrolază, lizin decarboxilază, ornitin decarboxilază, utilizarea citratului, urază, triptofan deaminaza, hidroliza gelatinei enzime, rezultatele testului au fost toate negative, dar fără indol, acetoină și H2S au fost produse. Carbohidrații nefermentați includ: glucoză, manoză, inozitol, sorbitol, ramnoză, zaharoză, melibioză, amigdalina și arabinoză. În comparație cu tulpinile de referință publicate, profilul de acizi grași celulari al tulpinii ASxL5T este prezentat în Tabelul 4. Principalii acizi grași celulari sunt C16:1ω6c și/sau C16:1ω7c, C16:0 și C18:1ω9. Există și acizi grași hidroxi C12:0 3-OH și C10:0 3-OH. Raportul C16:0 în ASxL5T este mai mare decât valoarea raportată a genurilor înrudite. În contrast, în comparație cu T. marinus IMCC1826TT raportat, raportul dintre C18:1ω7c și/sau C18:1ω6c în ASxL5T este redus. oleivorans MIL-1T și O. kriegii DSM 6294T, dar nu au fost detectate în B. sanyensis KCTC 32220T. Compararea profilurilor de acizi grași ale ASxL5T și ASxLS a relevat diferențe subtile în cantitatea de acizi grași individuali dintre cele două tulpini, care sunt în concordanță cu secvența ADN genomic a aceleiași specii. Nu au fost detectate particule de poli-3-hidroxibutirat (PHB) folosind testul Sudan Black.
Activitatea de prădare a bacteriilor ASxL5T a fost studiată pentru a determina intervalul de pradă. Această bacterie poate forma plăci pe speciile Campylobacter, inclusiv: Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T; Escherichia coli NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; C lari NCTC 11458 și C. upsaliensis NCTC 11541T. Utilizați culturile enumerate în secțiunea de determinare a intervalului de gazdă a metodei pentru a testa o gamă mai largă de bacterii Gram-negative și Gram-pozitive. Rezultatele arată că ASxL5T poate fi utilizat și în Escherichia coli NCTC 86 și Citrobacter freundii NCTC 9750T. Plăci formate pe Klebsiella oxytoca 11466. Interacțiunea TEM cu E. coli NCTC 86 este prezentată în Figura 4A-D, iar interacțiunea cu Campylobacter jejuni PT14 și Campylobacter suis S12 este prezentată în Figura 4E-H mijloc. Mecanismul de atac pare să fie diferit între tipurile de pradă testate, cu una sau mai multe celule E. coli atașate la fiecare celulă ASxL5T și poziționate lateral de-a lungul celulei extinse înainte de adsorbție. În schimb, ASxL5T pare să se atașeze de Campylobacter printr-un singur punct de contact, de obicei în contact cu vârful celulei prădătoare și aproape de vârful celulei Campylobacter (Figura 4H).
TEM care arată interacțiunea dintre ASx5LT și pradă: (AD) și prada E. coli; (EH) și C. jejuni prada. (A) O celulă tipică ASx5LT conectată la o singură celulă E. coli (EC); (B) Un ASx5LT filamentos atașat la o singură celulă EC; (C) O celulă ASx5LT filamentoasă conectată la mai multe celule EC; (D) Atașarea celulelor ASx5LT mai mici pe o singură celulă de E. coli (EC); (E) o singură celulă ASx5LT conectată la o celulă Campylobacter jejuni (CJ); (F) ASx5LT atacă celulele C. hyointestinalis (CH); (G) două celule One ASx5LT au atacat o celulă CJ; (H) O vedere de aproape a punctului de atașare ASx5LT, lângă vârful celulei CJ (bar 0,2 μm). Bara reprezintă 1 μm în (A–G).
Bacteriile prădătoare au evoluat pentru a profita de sursele abundente de pradă. Evident, ele sunt prezente pe scară largă în multe medii diferite. Datorită dimensiunii înguste a membrilor populației, este posibilă izolarea bacteriilor ASxL5T din suspensie folosind metoda de separare a fagilor. Relevanța genomică a ASxL5T pentru membrii familiei oceanospirillaceae de bacterii marine este surprinzătoare, deși organismul este tolerant la sare și poate crește pe un mediu care conține 5% sare. Analiza calității apei a suspensiei a arătat că conținutul de clorură de sodiu a fost mai mic de 0,1%. Prin urmare, noroiul este departe de mediul marin, atât din punct de vedere geografic, cât și chimic. Prezența a trei izolate înrudite, dar diferite din aceeași sursă oferă dovezi că acești prădători prosperă în acest mediu non-marin. În plus, analiza microbiomului (fișiere de date disponibile de la https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990) a arătat că aceeași secvență a genei ARNr 16S este situată în top 50 de taxoni operaționali cei mai abundenți (OTU). ) În câteva intervale de prelevare a noroiului. Mai multe bacterii necultivate au fost găsite în baza de date Genbank, care au secvențe de gene ARNr 16S similare cu bacteriile ASxL5T. Aceste secvențe, împreună cu secvențele ASxL5T, ASxS5 și ASxO5, par să reprezinte diferite clade separate de Thalassolituus și Oceanobacter (Figura 2). Trei tipuri de bacterii necultivate (GQ921362, GQ921357 și GQ921396) au fost izolate din apa fisurii la o adâncime de 1,3 kilometri în mina de aur din Africa de Sud în 2009, iar celelalte două (DQ256320 și DQ337006) au fost, de asemenea, din apele subterane din Africa de Sud. în 2005). Secvența genei 16S rARN cel mai strâns legată de ASxL5T face parte din secvența genei 16S rRNA obținută din cultura de îmbogățire a sedimentelor nisipoase obținute de pe plajele din nordul Franței în 2006 (numărul de acces AM29240828). O altă secvență de genă ARNr 16S strâns legată de la bacteria necultivată HQ183822.1 a fost obținută dintr-un rezervor de colectare levigat dintr-un depozit municipal din China. Evident, bacteriile ASxL5T nu sunt foarte reprezentative în bazele de date taxonomice, dar aceste secvențe din bacterii necultivate sunt probabil să reprezinte organisme similare cu ASxL5T, care sunt distribuite în întreaga lume, de obicei în medii provocatoare. Din întreaga analiză filogenetică a genomului, cea mai apropiată rudă de ASxL5T este Thalassolituus sp. C2-1, T. marinus, T. oleivorans. Și O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus este un membru al bacteriilor marine obligatorii de fragmentare a hidrocarburilor (OHCB), care este larg răspândită în mediile marine și terestre și devine de obicei dominantă după incidentele de poluare cu hidrocarburi30,31. Bacteriile marine nu sunt membre ale grupului OHCB, dar sunt izolate din mediul marin.
Datele fenotipice indică faptul că ASxL5T este o specie nouă și un membru al unui gen nerecunoscut anterior din familia spirospiraceae marine. În prezent, nu există un standard clar pentru a clasifica tulpinile nou izolate într-un nou gen. Au fost făcute încercări de a determina limitele genurilor universale, de exemplu, pe baza procentului de genom al unei proteine ​​conservatoare (POCP), se recomandă ca valoarea limită să fie 50% identică cu tulpina de referință33. Alții sugerează utilizarea valorilor AAI, care au avantaje față de POCP deoarece pot fi obținute din genomi incompleti34. Autorul consideră că dacă valoarea AAI este mai mică de 74% în comparație cu tulpina model a speciei model, tulpina este un reprezentant al unui gen diferit. Genul model din spirillaceae marine este spirillum marin, iar tulpina model este O. linum ATCC 11336T. Valoarea AAI între ASxL5T și O. linum ATCC 11336T este de 54,34%, iar valoarea AAI între ASxL5T și T. oleivorans MIL-1T (tulpini de tip gen) este de 67,61%, indicând faptul că ASxL5T reprezintă un nou gen diferit de Thalassolituus. Folosind secvența genei ARNr 16S ca standard de clasificare, limita sugerată de delimitare a genului este de 94,5%35. ASxL5T poate fi plasat în genul Thalassolituus, prezentând 95,03% identitate de secvență de ARNr 16S cu T. oleivorans MIL-1T și 96,17%. marinus IMCC1826T. Cu toate acestea, va fi plasat și în genul Bacteroides care are 94,64% identitate a genei ARNr 16S cu B. sanyensis NV9, ceea ce indică faptul că utilizarea unei singure gene, cum ar fi gena ARNr 16S, poate duce la clasificare și atribuire arbitrară. O altă metodă sugerată utilizează ANI și Scorul de aliniere a genomului (AF) pentru a examina gruparea punctelor de date de la toate tipurile și tulpinile non-tip ale genurilor existente. Autorul recomandă combinarea limitei genului cu punctul de inflexiune al genului estimat specific taxonilor analizați. Cu toate acestea, dacă nu există suficiente secvențe complete de genom din izolatele Thalassolituus, este imposibil să se determine dacă ASxL5T aparține genului Thalassolituus prin această metodă. Datorită disponibilității limitate a secvențelor complete ale genomului pentru analiză, întregul arbore filogenetic al genomului trebuie interpretat cu prudență. În al doilea rând, metodele de comparare a întregului genom nu pot explica diferențele substanțiale în dimensiunea genomului comparat. Ei au măsurat asemănarea genelor de bază conservate cu o singură copie între genurile înrudite, dar nu au luat în considerare numărul mare de gene care nu sunt prezente în genomul mult mai mic al ASxL5T. Evident, ASxL5T și grupuri precum Thalassolituus, Oceanobacter și Bacterioplanes au un strămoș comun, dar evoluția a luat o cale diferită, ceea ce duce la o reducere a genomului, care poate fi adaptarea la un stil de viață prădător. Acest lucru este în contrast cu T. oleivorans MIL-1T, care este cu 28% mai mare și a evoluat sub diferite presiuni ale mediului pentru a utiliza hidrocarburi23,30. O comparație interesantă poate fi făcută cu paraziții și simbioții intracelulari obligați, cum ar fi Rickettsia, Chlamydia și Buchnera. Dimensiunea genomului lor este de aproximativ 1 Mb. Capacitatea de a utiliza metaboliții celulei gazdă duce la pierderea genelor, așa că a suferit o degradare genomică evolutivă semnificativă. Schimbările evolutive de la organismele nutritive chimice marine la stilurile de viață prădătoare pot duce la o reducere similară a dimensiunii genomului. Analiza COG și KEGG evidențiază numărul de gene utilizate pentru funcții specifice și diferențele globale în căile genomice dintre ASxL5T și T. oleivorans MIL-1T, care nu se datorează disponibilității pe scară largă a elementelor genetice mobile. Diferența în raportul G + C al întregului genom al ASxL5T este de 56,1%, iar cea a T. oleivorans MIL-1T este de 46,6%, ceea ce indică, de asemenea, că este segregat.
Examinarea conținutului de codificare al genomului ASxL5T oferă perspective funcționale asupra caracteristicilor fenotipice. Prezența genelor care codifică fimbriae de tip IV (Tfp) este de interes deosebit deoarece promovează mișcarea celulelor, numită alunecare socială sau convulsii, fără flageli la suprafață. Potrivit rapoartelor, Tfp are alte funcții, inclusiv prădarea, patogeneza, formarea biofilmului, absorbția naturală a ADN-ului, agregarea și dezvoltarea automată a celulelor38. Genomul ASxL5T conține 18 gene care codifică diguanylat ciclază (o enzimă care catalizează conversia 2 guanozin trifosfat în guanozin 2 fosfat și diGMP ciclic) și 6 gene care codifică diguanylat ciclază fosfat diguanylate. Gena pentru esterază (care catalizează degradarea di-GMP ciclic la monofosfat de guanozină) este interesantă deoarece cycl-di-GMP este un al doilea mesager important implicat în dezvoltarea și separarea biofilmului, mișcarea, atașarea celulelor și virulența 39, 40 în acest proces. De asemenea, trebuie remarcat faptul că la Bdellovibrio bacteriovorus, s-a demonstrat că GMP dublu ciclic controlează tranziția dintre viața liberă și stilul de viață prădător41.
Majoritatea cercetărilor asupra bacteriilor prădătoare s-au concentrat pe Bdellovibrio, organisme asemănătoare Bdellovibrio și speciile Myxococcus. Acestea și alte exemple cunoscute de bacterii prădătoare formează un grup divers. În ciuda acestei diversități, au fost identificate un set de familii de proteine ​​caracteristice care reflectă fenotipurile a 11 bacterii prădătoare cunoscute3,22. Cu toate acestea, au fost identificate doar genele care codifică O antigen ligaza (waaL), ceea ce este deosebit de comun în bacteriile Gram-negative. Această formă de analiză nu este utilă în desemnarea ASxL5T ca prădător, probabil pentru că folosește o strategie nouă de atac. Disponibilitatea unor genomi bacterieni prădători mai diversi va ajuta la dezvoltarea unor analize de rezoluție mai fine care iau în considerare dovezile diferențelor funcționale și de mediu între membrii grupului. Exemple de bacterii prădătoare care nu sunt incluse în această analiză includ membrii Cupriavidus necator42 și Bradymonabacteria43, deoarece pe măsură ce cercetătorii investighează diferite comunități microbiene, se stabilesc mai mulți taxoni prădători.
Cea mai notabilă caracteristică a bacteriilor ASxL5T capturate de imaginea TEM este morfologia sa unică și flexibilă, care poate promova interacțiunea cu bacteriile pradă. Tipul de interacțiune observat este diferit de alte bacterii prădătoare și nu a fost descoperit sau raportat anterior. Ciclul de viață prădător ASxL5T propus este prezentat în Figura 5. Există puține exemple în literatură cu structuri apicale similare cu cele raportate aici, dar aceste exemple includ Terasakiispira papahanaumokuakeensis, o bacterie spirillum marine cu mărire ocazională a apexului 44 și Alphaproteobacteria, Terasakiella pusilla , aparținând anterior genului Oceanospirillum, expunând așa-numitul „film polar” 45. Formele de cocci sunt adesea observate în culturile mai vechi, în special pentru bacteriile cu forme curbate, precum Vibrio, Campylobacter și Helicobacter 46, 47, 48, care pot reprezenta o stare degradată. Sunt necesare lucrări suplimentare pentru a clarifica ciclul de viață precis al bacteriilor ASxL5T. Pentru a determina modul în care captează și pradă și dacă genomul său codifică compuși biologic activi care pot fi utilizați în scopuri medicale sau biotehnologice.
Descrierea Venatorbacter gen. November Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. este compus din venators din L. n. venator,'hunter' si Gr. n. bacter,'o rod'. Venatorbacter,'a hunting Rod'). Celulele sunt aerobe, tolerante la sare, curbate, catalază și activitate de oxidază nu se acumulează 42 °C Intervalul de pH de 4-9 este neobișnuit La melcii marini, cei mai mulți sunt intoleranți la pH acid :0 3-OH și C10:0 3-OH se găsesc ca acizi grași hidroxi medii de bulion. Conținutul de ADN G + C este de 56,1 % mol. Membrii acestui gen prezintă rezistență la Campylobacter Iar comportamentul de prădare al membrilor familiei Enterobacteriaceae este în familie.
Descrierea Venatorbacter cucullus sp. noiembrie Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus înseamnă caren).
În plus, caracteristica descriptivă a acestui gen este că atunci când sunt crescute pe BA sau BHI, celulele au 1,63 µm lungime și 0,37 µm lățime. Coloniile de pe agar BHI sunt foarte mici, ajungând la 2 mm în diametru după 72 de ore. Sunt bej, translucide, rotunde, convexe și strălucitoare. Membrii acestei specii pot folosi Escherichia coli și Klebsiella. Campylobacter și alte câteva bacterii Gram-negative servesc drept pradă.
Tulpina tipică ASxL5T a fost izolată din laptele de vită în Nottinghamshire, Regatul Unit și depusă în Colecția Națională de Cultură de Tip (Marea Britanie): numărul de acces NCTC 14397 și numărul de acces NCCB 100775 în Țările de Jos Bacterial Culture Collection (NCCB). Secvența completă a genomului ASxL5T a fost depus în Genbank conform adăugării CP046056.
Bacteriile ASxL5T au fost izolate din laptele de vită folosind tehnologia de izolare a fagilor9,49. Suspensia a fost diluată 1:9 (g/v) în tampon SM (50 mM Tris-HCI [pH 7,5], 0,1 M NaCI, 8 mM MgSO4,7H2O și 0,01% gelatină; Sigma Aldrich, Gillingham, UK), apoi se incubează la 4°C timp de 24 de ore, rotindu-se încet pentru a elua prădătorii în tampon. Suspensia a fost centrifugată la 3000 g timp de 3 minute. Supernatantul a fost colectat și centrifugat la 13.000 g pentru a doua oară timp de 5 minute. Supernatantul a fost apoi trecut printr-un filtru cu membrană de 0,45 um (Minisart; Sartorius, Gottingen, Germania) și un filtru cu membrană de 0,2 um (Minisart) pentru a îndepărta orice celule bacteriene rămase. ASxL5T poate trece aceste filtre. Un gazon de agar moale de Campylobacter enterosus S12 (număr de acces NCBI CP040464) din aceeași suspensie a fost preparat folosind tehnici standard. Suspensia filtrată a fost distribuită pe fiecare dintre aceste plăci cu celule gazdă în picături de 10 ui în triplicat și lăsată să se usuce. Placa a fost incubată într-un rezervor microaerofil la 37°C timp de 48 de ore în condiții microaerobe (5% O2, 5% H2, 10% CO2 și 80% N2). Placa vizibilă obținută a fost extrasă în tampon SM și transferată pe gazonul proaspăt de C. hyointestinalis S12 pentru a propaga în continuare organismele lizate. Odată ce s-a stabilit că bacteriile sunt cauza plăcii litice și nu fagul, încercați să creșteți organismul independent de gazdă și să îl caracterizați în continuare. Cultura aerobă a fost efectuată la 37 °C cu 5% v/v sânge de cal defibrinat (TCS Biosciences Lt, Buckingham, Marea Britanie, supliment). Conform ghidurilor Comitetului Național de Standarde Clinice, metoda de difuzie pe disc este utilizată pentru testarea susceptibilității antibacteriene. Geloza BHI a fost cultivată la 37 °C utilizând un disc care conține următoarele antibiotice (Oxoid) pentru cultura aerobă: amoxicilină și acid clavulanic 30 pg; cefotaximă 30 ug; streptomicina 10 ug; ciprofloxacină 5 ug; Ceftazidimă 30 ug Acid nalidixic 30 ug; Imipenem 10 ug; Azitromicină 15 ug; Cloramfenicol 30 ug; Cefoxitin 30 ug; Tetraciclină 30 ug; Nitrofurantoină 300 ug; Aztreonam 30 ug; Ampicilină 10 ug; Cefpodoximă 10 ug; Trimetoprim-Sulfametoxazol 25 µg. Toleranța la sare a fost stabilită prin incubare aerobă pe plăci de agar BHI la 37 °C. S-a adăugat NaCI suplimentar pe plăcile de agar BHI pentru a furniza un interval de concentrație de până la 10% g/v. Intervalul de pH este determinat prin cultură aerobă pe plăci de agar BHI la 37°C, unde intervalul de pH a fost ajustat între 4 și 9 cu HCI steril sau NaOH steril, iar valoarea pH-ului țintă este verificată înainte de turnarea plăcii. Pentru analiza acizilor grași celulari, ASxL5T a fost cultivat pe agar BHI timp de 3 zile și aerob la 37 °C. Conform protocolului standard MIDI (Sherlock Microbial Identification System, versiunea 6.10) al FERA Science Ltd, (York, Marea Britanie), acizii grași celulari au fost extrași, preparați și analizați.
Pentru TEM, ASxL5T a fost cultivat aerob prin împrăștiere uniformă pe BA la 37°C timp de 24 de ore și apoi recoltat în 1 ml de glutaraldehidă 3% (v/v) în tampon cacodilat 0,1 M la temperatura camerei Fix timp de 1 oră, apoi centrifugat. la 10.000 g timp de 3 minute. Apoi resuspendați ușor peletul în 600 μl tampon cacodilat 0,1 M. Transferați suspensia ASxL5T fixă ​​pe filmul Formvar/carbon pe o rețea de cupru de 200 de mesh. Bacteriile au fost colorate cu acetat de uranil 0,5% (g/v) timp de 1 minut și examinate prin TEM folosind un microscop TEI Tecnai G2 12 Biotwin. După cum sa menționat mai sus, combinați același număr de pradă și prădător în bulionul NZCYM (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) și incubați timp de 48 de ore în condiții microaerobe de Campylobacter sau Campylobacter la 37°C, Interacțiunea prădător și pradă a fost examinat și de TEM. Condiții aerobe pentru Escherichia coli. Examinați în mod independent prada și bacteriile prădătoare pentru a determina orice modificări ale morfologiei celulare din cauza prădării. Metoda Sudan Black a fost utilizată pentru microscopia optică a acumulării PHB.
Creșteți culturi ASxL5T peste noapte prin ungerea creșterii pe plăci BHI sau BA cu un tampon steril. Colectați celulele ASxL5T și suspendați-le în MRD (CM0733, Oxoid), apoi puneți-le la 4 ° C timp de 7 zile pentru a înfometa celulele. Cultura bacteriană de referință sau stoc de laborator NCTC a fost inoculată în bulion BHI sau bulion nutritiv nr. 2 (CM007, Oxoid), incubat peste noapte, centrifugat la 13.000 g și resuspendat în MRD până când OD600 a fost 0,4. Cultură: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, Klebsiella oxytoca, Lebsiella oxytoca NCTC18146c6, Listeria Bacteriile speciale NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, Rhodococcus submarine hamburger NCTC 1621T, Salmonella bacterii intestinale Mondeville NCTC 5786TC, Stalocophy 5786TC, 10. aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. Gazda Campylobacter a fost incubată microaerob pe plăci BA la 37°C și suspendată în bulion NZCYM. Gazdele Campylobacter testate sunt: ​​C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11458, C. lari NCTC 11458, C.11458 NCTC . PT14, C... Se colectează celulele în MRD, se centrifughează la 13.000 g și se resuspend în MRD până când OD600 este 0,4. Se adaugă o alicotă de 0,5 ml suspensie la 5 ml topit NZCYM top agar (0,6% agar) și se toarnă pe o placă inferioară NZCYM 1,2%. După întărire și uscare, ASxL5T diluat în serie a fost distribuit sub formă de picături de 20 pl pe fiecare placă de gazon în trei exemplare. Temperatura și atmosfera culturii depind de cerințele bacteriilor de testat.
Folosiți GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma Aldridge) pentru a prepara ADN-ul din izolate bacteriene. Metodele standard au fost utilizate pentru amplificarea PCR a genei ARNr 16S și determinarea secvenței produsului folosind chimia de terminare a coloranților (Eurofins Value Read Service, Germania). Utilizați programul BLAST-N pentru a compara aceste secvențe cu alte secvențe ale genei ARNr 16S pentru a identifica și colecta specii strâns înrudite. Acestea sunt aliniate folosind ClustalW în programul MEGA X. Arborele filogenetic a fost reconstruit folosind MEGA X utilizând metoda maximă de probabilitate bazată pe modelul Tamura-Nei, cu 1000 de copii ghidate54. Utilizați PureLink™ Genomic DNA Kit (Fisher Scientific, Loughborough, Marea Britanie) pentru a extrage ADN-ul pentru secvențierea întregului genom. Secvența genomului ASxL5T a fost determinată folosind combinația Illumina MiSeq, care constă din citiri cu două capete de 250 bp compuse dintr-o bibliotecă pregătită folosind kitul de etichetare Nextera și citiri lungi de 2 până la 20 kb de pe platforma PacBio. Genomics DNA Sequencing Research Facility de la Universitatea Sembia. Genomul a fost asamblat folosind CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen, Aarhus, Danemarca). Culturile ASxL5T sunt depuse în Colecția Națională de Cultură de Tip (Marea Britanie) și în Colecția de Cultură Bacteriană din Țările de Jos (NCCB). Genomii organismelor înrudite utilizate pentru comparație sunt: ​​Thalassolituus oleivorans MIL-1T (număr de acces HF680312, complet); Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (număr de acces BMYY01000001, incomplet); Oceanobacter kriegii DSM 6294T (număr de acces NZ_AUGV00000000, incomplet); Comunitatea Marinamonas DSM 5604T (adăugat ASM436330v1, incomplet), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (adăugat MTSD02000001, incomplet) și Thalassolituus sp. C2-1 (adăugați NZ_VNIL01000001, incomplet). Utilizați JGI Genome Portal36 la https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page= pentru a determina scorul de aliniere (AF) și identitatea medie a acidului nucleic (ANI). În perechi. Metoda Rodriguez-R & Konstantinidis55 a fost utilizată pentru a determina identitatea aminoacizilor (AAI). Utilizați GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 pentru a genera un arbore filogenetic cu probabilitate maximă estimată. Genomul de intrare care reprezintă genomul de referință disponibil este selectat din genurile de referință identificate ca fiind legate de ASxL5T din filogenia ARNr 16S. Adnotat arborele folosind instrumentul online interactiv arborele vieții (https://itol.embl.de/). Adnotarea funcțională și analiza genomului ASxL5T se efectuează utilizând instrumentul online BlastKOALA KEGG utilizând distribuția de îmbogățire a modulului KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Distribuția categoriilor COG (grupuri ortologe) este determinată folosind instrumentul online eggNOG-mapper.
Pérez, J., Moraleda-Muñoz, A., Marcos-Torres, FJ și Muñoz-Dorado, J. Predarea bacteriană: 75 de ani și continuă! . mediu. microorganism. 18, 766–779 (2016).
Linares-Otoya, L. etc. Diversitatea și potențialul antibacterian al bacteriilor prădătoare de pe litoralul peruan. Martie droguri. 15. E308. https://doi.org/10.3390/md15100308 (2017).
Pasternak, Z. şi colab. Prin genele lor, le vei înțelege: caracteristicile genomice ale bacteriilor prădătoare. ISME J. 7, 756–769 (2013).
Sockett, RE Stilul de viață prădător al bacteriofagului Bdellovibrio. instala. Microbii pastori. 63, 523–539 (2009).
Korp, J., Vela Gurovic, MS & Nett, M. Antibiotice din bacterii prădătoare. Beilstein J. Histochemistry 12, 594–607 (2016).
Johnke, J., Fraune, S., Bosch, TCG, Hentschel, U. & Schulenburg, H. Bdellovibrio și organisme similare sunt predictori ai diversității microbiomului în diferite populații gazdă. microorganism. Ecologie. 79, 252–257 (2020).
Vila, J., Moreno-Morales, J. și Ballesté-Delpierre, C. Descoperiți starea actuală a noilor agenți antibacterieni. clinic. microorganism. Infecta. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2019.09.015 (2019).
Hobley, L. şi colab. Dubla prădare a fagului și fagului poate eradica prada E. coli fără o singură prădare. J. Bacteriile. 202, e00629-19. https://doi.org/10.1128/JB.00629-19 (2020).
El-Shibiny, A., Connerton, PL și Connerton, IF Numărul și diversitatea Campylobacterului și bacteriofagelor izolați în timpul ciclului de hrănire al puiilor de pădure și organici. Mediul de aplicație. microorganism. 71, 1259–1266 (2005).
Wilkinson, DA etc. Actualizați taxonomia genomică și epidemiologia porcinelor Campylobacter. ştiinţă. Reprezentant 8, 2393. https://doi.org/10.1038/s41598-018-20889-x (2018).
Lee, MD GToTree: Flux de lucru ușor de utilizat pentru genomica sistemelor. Bioinformatica 35, 4162–4164 (2019).
Edgar, RC MUSCLE: O metodă de aliniere a secvențelor multiple care reduce complexitatea timpului și spațiului. Informații biologice BMC. 5, 113 (2004).
Capella-Gutiérrez, S., Silla-Martínez, JM & Gabaldón, T. TrimAl: Un instrument pentru alinierea și tăierea automată în analiza filogenetică la scară largă. Bioinformatica 25, 1972–1973 (2009).
Hyatt, D., LoCascio, PF, Hauser, LJ și Uberbacher, gena EC și traducerea secvenței metagenomice începe predicția site-ului. Bioinformatica 28, 2223-2230 (2012).
Shen, W. & Xiong, J. TaxonKit: Setul de instrumente de clasificare NCBI multi-platformă și eficient. Bio Rxiv. (Accesat la 1 iunie 2021); https://www.biorxiv.org/content/10.1101/513523v1 (2019).
Price, MN, Dehal, PS & Arkin, AP FastTree 2-arborele de probabilitate maximă aproximativă cu aliniere mare. PLoS One 5, e9490 (2010).
Tange, O. GNU Parallel. (Accesat la 1 iunie 2021); https://zenodo.org/record/1146014#.YOHaiJhKiUk (2018).
Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: Enciclopedia Kyoto a genelor și genomurilor. Cercetarea acidului nucleic. 28, 27-30 (2000).
Republica Cehă, L. etc. Rolul extremoliților ectoină și hidroxiectoină ca protectori de stres și nutrienți: genetică, genomica sistemului, biochimie și analiză structurală. Gene (Basel). 9. E177. https://doi.org/10.3390/genes9040177 (2018).
Gregson, BH, Metodieva, G., Metodiev, MV, Golyshin, PN și McKew, BA Expresia diferențială a proteinei în timpul creșterii bacteriei marine obligatorii de degradare a hidrocarburilor Thalassolituus oleivorans MIL-1 în timpul creșterii alcanilor cu lanț mediu și lung. faţă. microorganism. 9, 3130 (2018).
Pasternak, Z., Ben Sasson, T., Cohen, Y., Segev, E. și Jurkevitch, E. O nouă metodă genomică comparativă pentru definirea indicatorilor specifici fenotipici relevă moștenirea specifică în marca bacteriilor prădătoare. Biblioteca Publică de Științe Unu. 10. e0142933. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142933 (2015).
Yakimov, MM etc. Gena Thalassolituus oleivorans. noiembrie, sp. nov., un nou tip de bacterii marine specializate în utilizarea hidrocarburilor. internaţionalitate. J. Sistem. evoluţie. microorganism. 54, 141–148 (2004).
Wang, Y., Yu, M., Liu, Y., Yang, X. & Zhang, XH Bacterioplanoides pacificum gen. noiembrie, sp. În noiembrie, s-a separat de apa de mare care circula în Pacificul de Sud. internaţionalitate. J. Sistem. evoluţie. microorganism. 66, 5010–5015 (2016).