Новый тип грамотрицательных, аэробных, солеустойчивых, активных, палочковидных и хищных бактерий ASxL5T был выделен из пруда с коровьим навозом в Ноттингемшире, Англия, и использовал Campylobacter в качестве добычи. Впоследствии в качестве добычи были обнаружены другие виды Campylobacter и члены семейства Enterobacteriaceae. После субкультивирования без клеток-хозяев на агаре Brain Heart Infusion Agar был достигнут слабый асептический рост. Оптимальные условия роста — 37 °C и pH 7. Просвечивающая электронная микроскопия выявила некоторые очень необычные морфологические особенности, связанные с наличием добычи. Филогенетический анализ с использованием последовательности гена 16S рРНК показал, что изолят относится к члену семейства морских спирулины, но не может быть четко классифицирован как член какого-либо известного рода. Полногеномное секвенирование ASxL5T подтвердило родство с представителями морских спирохет. Поиск в базе данных показал, что несколько ASxL5T имеют общие последовательности генов 16S рРНК с несколькими некультивируемыми бактериями из океана, поверхности суши и грунтовых вод. Мы предполагаем, что штамм ASxL5T представляет собой новый вид в новом роде. Мы рекомендуем название Venatorbacter cucullus gen. Ноябрь, сп. В ноябре в качестве типового штамма использовали ASxL5T.
Хищные бактерии — это бактерии, которые проявляют способность выслеживать и убивать другие живые бактерии для получения биосинтетических материалов и энергии. Это отличается от общего восстановления питательных веществ из мертвых микроорганизмов, а также от паразитических взаимодействий, при которых бактерии образуют тесные отношения со своим хозяином, не убивая его. Хищные бактерии прошли разные жизненные циклы, чтобы воспользоваться обильными источниками пищи в нишах, где они обитают (например, в морской среде обитания). Это таксономически разнообразная группа, которую объединяет только уникальный жизненный цикл стерилизации1. Примеры хищных бактерий были обнаружены в нескольких различных типах, в том числе: Proteobacteria, Bacteroides и Chlorella.3. Однако наиболее хорошо изученными хищными бактериями являются Bdellovibrio и Bdellovibrio и подобные им организмы (BALOs4). Хищные бактерии являются перспективным источником новых биологически активных соединений и антибактериальных средств5.
Считается, что хищные бактерии увеличивают микробное разнообразие и оказывают положительное влияние на здоровье, продуктивность и стабильность экосистем6. Несмотря на эти положительные свойства, исследований новых хищных бактерий мало из-за сложности культивирования бактерий и необходимости тщательного наблюдения за клеточными взаимодействиями, чтобы понять их сложные жизненные циклы. Эту информацию нелегко получить с помощью компьютерного анализа.
В эпоху растущей устойчивости к противомикробным препаратам изучаются новые стратегии воздействия на бактериальные патогены, такие как использование бактериофагов и хищных бактерий7,8. Бактерии ASxL5T были выделены в 2019 году с использованием технологии выделения фагов из коровьего навоза, собранного в Молочном центре Ноттингемского университета, Ноттингемшир. Целью исследования является выделение организмов, потенциальных в качестве агентов биологической борьбы. Campylobacter hyointestinalis — зоонозный патоген, который все чаще ассоциируется с кишечными заболеваниями человека10. Он повсеместно присутствует в сыворотке и используется в качестве хозяина-мишени.
Бактерия ASxL5T была выделена из говяжьего желе, поскольку было замечено, что бляшки, которые она образовывала на лужайке C. hyointestinalis, были похожи на бляшки, продуцируемые бактериофагами. Это неожиданный вывод, поскольку часть процесса выделения фагов включает фильтрацию через фильтр с размером пор 0,2 мкм, предназначенный для удаления бактериальных клеток. Микроскопическое исследование материала, выделенного из бляшки, показало, что мелкие грамотрицательные изогнутые палочковидные бактерии не накапливают полигидроксибутират (ПГБ). Асептическая культура, независимая от клеток-жертв, реализуется на богатой твердой среде (такой как мозго-сердечный агар (BHI) и кровяной агар (BA)), и ее рост является слабым. Его получают после пересева с использованием тяжелого инокулята. Он одинаково хорошо растет в микроаэробных (7% об. кислорода) и атмосферных кислородных условиях, но не в анаэробной атмосфере. Через 72 часа диаметр колонии был очень маленьким, достигая 2 мм, бежевого цвета, полупрозрачной, круглой, выпуклой и блестящей. Стандартное биохимическое тестирование затруднено, поскольку ASxL5T невозможно надежно культивировать в жидких средах, что позволяет предположить, что оно может зависеть от сложного жизненного цикла образования биопленки. Однако суспензия планшета показала, что ASxL5T является аэробным, положительным в отношении оксидазы и каталазы и может переносить 5% NaCl. ASxL5T устойчив к 10 мкг стрептомицина, но чувствителен ко всем другим протестированным антибиотикам. Бактериальные клетки ASxL5T исследовали с помощью ПЭМ (рис. 1). При выращивании без клеток-жертв на БА клетки ASxL5T представляют собой небольшие кампилобактерии со средней длиной 1,63 мкм (± 0,4), шириной 0,37 мкм (± 0,08) и одним длинным (до 5 мкм) полюсом. Половые жгутики. Примерно 1,6% клеток имеют ширину менее 0,2 мкм, что позволяет проходить через фильтрующее устройство. На вершине некоторых ячеек наблюдалось необычное структурное расширение, похожее на обтекатель (лат. cucullus) (см. стрелки на рисунках 1D, E, G). По-видимому, он состоит из избыточной внешней мембраны, что может быть связано с быстрым уменьшением размера периплазматической оболочки, в то время как внешняя мембрана остается неповрежденной и имеет «рыхлый» вид. Культивирование ASxL5T в отсутствие питательных веществ (в PBS) в течение длительного времени при 4 ° C привело к тому, что большинство (но не все) клеток показали кокковую морфологию (рис. 1C). Когда ASxL5T растет с Campylobacter jejuni в качестве добычи в течение 48 часов, средний размер клеток значительно длиннее и уже, чем у клеток, выращенных без хозяина (таблица 1 и рисунок 1E). Напротив, когда ASxL5T растет с E. coli в качестве добычи в течение 48 часов, средний размер клеток длиннее и шире, чем когда он растет без добычи (таблица 1), а длина клеток варьируется, обычно нитевидная (рис. 1F). При инкубации с Campylobacter jejuni или E. coli в качестве добычи в течение 48 часов клетки ASxL5T вообще не обнаруживали жгутиков. В таблице 1 суммированы наблюдения за изменениями размера клеток в зависимости от присутствия, отсутствия и типа добычи ASxL5T.
TEM-изображение ASx5LT: (A) ASx5LT показывает длинный хлыст; (B) типичная батарея ASx5LT; (C) клетки кокка ASx5LT после длительной инкубации без питательных веществ; (D) группа клеток ASx5LT демонстрирует аномалию (E) Группа клеток ASx5LT, инкубированная с добычей Campylobacter, показала увеличенную длину клеток по сравнению с клетками без роста добычи (D) также показала апикальную структуру; (F) Большие нитчатые жгутики, клетки ASx5LT, после инкубации с добычей E. coli; (G) Одна клетка ASx5LT после инкубации с E. coli, демонстрирующая необычную верхнюю структуру. Полоса представляет собой 1 мкм.
Определение последовательности гена 16S рРНК (номер доступа MT636545.1) позволяет осуществлять поиск в базе данных для установления последовательностей, аналогичных последовательностям класса Gammaproteobacteria, которые наиболее близки к морским бактериям семейства морских спирилл (рис. 2) и являются членами рода Thalassolituus. Ближайший родственник морской бациллы. Последовательность гена 16S рРНК явно отличается от таковой у хищных бактерий семейства Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria). Парные сравнения B. бактериоворуса HD100T (типовой штамм, DSM 50701) и B. бактериоворуса DM11A составили 48,4% и 47,7%, а для B. exovorus JSS — 46,7%. Бактерии ASxL5T имеют 3 копии гена 16S рРНК, две из которых идентичны друг другу, а третья находится на расстоянии 3 оснований друг от друга. Два других хищных бактериальных изолята (ASx5S и ASx5O; номера доступа гена 16S рРНК — MT636546.1 и MT636547.1 соответственно) со схожими морфологическими и фенотипическими характеристиками из того же места не одинаковы, но они отличаются от ASxL5T и некультивируемого бактериального изолята. последовательности базы данных сгруппированы вместе с другими родами Oceanospirillaceae (рис. 2). Полная последовательность генома ASxL5T была определена и сохранена в базе данных NCBI, номер доступа — CP046056. Геном ASxL5T состоит из кольцевой хромосомы размером 2 831 152 п.н. с соотношением G + C 56,1%. Последовательность генома содержит 2653 CDS (всего), из которых, по прогнозам, 2567 кодируют белки, из которых 1596 могут быть отнесены к предполагаемым функциям (60,2%). Геном содержит 67 генов, кодирующих РНК, в том числе 9 рРНК (по 3 для 5S, 16S и 23S) и 57 тРНК. Геномные характеристики ASxL5T сравнивали с имеющимися геномами штаммов ближайшего родственного типа, идентифицированных по последовательности гена 16S рРНК (табл. 2). Используйте аминокислотную идентичность (AAI), чтобы сравнить все доступные геномы Thalassolituus с ASxL5T. Ближайшая доступная (неполная) последовательность генома, определенная с помощью AAI, - это Thalassolituus sp. C2-1 (добавьте NZ_VNIL01000001). Этот штамм был выделен из глубоководных отложений Марианской впадины, но в настоящее время нет фенотипической информации об этом штамме для сравнения. По сравнению с ASxL5T размером 2,82 МБ, геном организма больше и составляет 4,36 МБ. Средний размер генома морских спирохет составляет около 4,16 Мб (± 1,1; n = 92 полных эталонных генома, исследованных на https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), поэтому геном ASxL5T соответствует заказ По сравнению с другими участниками, он довольно мал. Используйте GToTree 1.5.54 для создания филогенетического дерева максимальной вероятности на основе генома (рис. 3A), используя выровненные и связанные аминокислотные последовательности 172 однокопийных генов, специфичных для Gammaproteobacteria 11,12,13,14,15,16, 17,18. Анализ показал, что он тесно связан с Thalassolituus, Bacterial Plane и Marine Bacterium. Однако эти данные указывают на то, что ASxL5T отличается от своих родственников морской спирулины, и данные о последовательности его генома доступны.
Филогенетическое дерево с использованием последовательности гена 16S рРНК подчеркивает положение штаммов ASxL5T, ASxO5 и ASxS5 (с кишками) относительно некультивируемых и морских штаммов бактерий морских спирулиновых. Инвентарный номер Genbank следует за названием штамма в скобках. Используйте ClustalW для выравнивания последовательностей, используйте метод максимального правдоподобия и модель Тамуры-Ней для вывода о филогенетических связях и выполните 1000 управляемых репликаций в программе MEGA X. Число на ветке означает, что значение управляемого копирования превышает 50 %. В качестве внешней группы использовали Escherichia coli U/541T.
(A) Филогенетическое дерево, основанное на геноме, показывающее связь между морской бактерией Spirospiraceae ASxL5T и ее близкими родственниками, E. coli U 5/41T, как внешней группой. (B) По сравнению с T. oleivorans MIL-1T распределение генов по функциональным категориям прогнозируется на основе кластера ортологичных групп (COG) белка ASx5LT. На рисунке слева показано количество генов в каждой функциональной категории COG в каждом геноме. График справа показывает процент геномов, содержащихся в каждой функциональной группе COG. (C) По сравнению с T. oleiverans MIL-1T, анализ полного модульного пути KEGG (Киотская энциклопедия генов и геномов) ASxL5T.
Использование базы данных KEGG для изучения генов-компонентов, присутствующих в геноме ASxL5T, выявило типичный метаболический путь аэробного гамма-протея. ASxL5T содержит в общей сложности 75 генов, связанных с бактериальными моторными белками, включая гены, участвующие в хемотаксисе, сборке жгутиков и системе фимбрий IV типа. В последней категории 9 из 10 генов отвечают за подергивания ряда других организмов. Геном ASxL5T содержит полный путь биосинтеза тетрагидропиримидина, который участвует в защитном ответе на осмотический стресс20, как и ожидалось для галофилов. Геном также содержит множество полных путей для кофакторов и витаминов, включая пути синтеза рибофлавина. Хотя ген алкан-1-монооксигеназы (alkB2) присутствует в ASxL5T, путь утилизации углеводородов не является полным. В геномной последовательности ASxL5T явно отсутствуют гомологи генов, идентифицированных как основные ответственные за деградацию углеводородов T. oleiverans MIL-1T21, такие как TOL_2658 (alkB) и TOL_2772 (алкогольдегидрогеназа). На рисунке 3B показано сравнение распределения генов в категории COG между ASxL5T и оливковым маслом MIL-1T. В целом, меньший геном ASxL5T содержит пропорционально меньше генов из каждой категории COG по сравнению с более крупным родственным геномом. Когда количество генов в каждой функциональной категории выражается в процентах от генома, различия отмечаются в процентном соотношении генов в категориях трансляции, рибосомальной структуры и биогенеза, а также в категориях функций производства и преобразования энергии, которые составляют более крупный ASxL5T. геном. Процентное соотношение сравнивается с той же группой, присутствующей в геноме T. oleiverans MIL-1T. Напротив, по сравнению с геномом ASxL5T, T. oleivorans MIL-1T имеет более высокий процент генов в категориях репликации, рекомбинации и репарации, а также транскрипции. Интересно, что самая большая разница в содержании каждой функциональной категории двух геномов заключается в количестве неизвестных генов, присутствующих в ASxL5T (рис. 3B). Был проведен анализ обогащения модулей KEGG, где каждый модуль KEGG представляет собой набор вручную определенных функциональных единиц для аннотации и биологической интерпретации данных последовательности генома. Сравнение распределения генов в полном пути модуля KOG ASxL5T и оливкового MIL-1T показано на рисунке 3C. Этот анализ показывает, что, хотя ASxL5T имеет полный путь метаболизма серы и азота, T. oleiverans MIL-1T его не имеет. Напротив, у T. oleiverans MIL-1T имеется полный путь метаболизма цистеина и метионина, но он неполный у ASxL5T. Таким образом, ASxL5T имеет характерный модуль ассимиляции сульфатов (определяемый как набор генов, которые можно использовать в качестве фенотипических маркеров, таких как метаболическая способность или патогенность; https://www.genome.jp/kegg/module.html). В T .олеверанс МИЛ-1Т. Сравнение содержания генов ASxL5T со списком генов, предполагающих хищнический образ жизни, не дает результатов. Хотя ген waaL, кодирующий лигазу, связанную с полисахаридом О-антигена в ядре, присутствует в геноме ASxL5T (но он часто встречается у многих грамотрицательных бактерий), гены триптофан-2,3-диоксигеназы (TDO) могут включать 60 аминокислотных остатков. кислые области, обычно встречающиеся у хищных бактерий, которых нет. Других хищнических генов в геноме ASxL5T нет, в том числе кодирующих ферменты, участвующие в биосинтезе изопреноидов по мевалонатному пути. Обратите внимание, что в исследованной группе хищников нет гена, регулирующего транскрипцию gntR, но в ASxL5T можно идентифицировать три gntR-подобных гена.
Фенотипические характеристики ASxL5T суммированы в таблице 3 и сопоставлены с фенотипическими характеристиками родственных родов 23, 24, 25, 26 и 27, описанными в литературе. Изоляты T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis и Oceanobacter kriegii представляют собой активные, солеустойчивые, оксидазо-положительные палочковидные тельца, но почти не имеют других фенотипических характеристик с ASxL5T. Средний pH океана составляет 8,1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77), что отражено в T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis и O. криегии. ASxL5T подходит для более широкого диапазона pH (4–9), типичного для неморских видов. Фенотипическая характеристика Thalassolituus sp. С2-1. Неизвестный. Диапазон температур роста ASxL5T обычно шире, чем у морских штаммов (4–42 ° C), хотя некоторые, но не все изоляты T. marinus устойчивы к жаре. Невозможность выращивать ASxL5T в бульонной среде препятствовала дальнейшей фенотипической характеристике. Используйте API 20E для проверки материалов, соскобленных с пластины BA, ONPG, аргининдигидролазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, утилизации цитрата, уреазы, триптофандезаминазы, фермента гидролиза желатина, все результаты испытаний были отрицательными, но не было индола, ацетоина и H2S. были произведены. К неферментированным углеводам относятся: глюкоза, манноза, инозитол, сорбит, рамноза, сахароза, мелибиоза, амигдалин и арабиноза. По сравнению с опубликованными родственными эталонными штаммами профиль клеточных жирных кислот штамма ASxL5T показан в таблице 4. Основными клеточными жирными кислотами являются C16:1ω6c и/или C16:1ω7c, C16:0 и C18:1ω9. Также существуют гидроксижирные кислоты C12:0 3-OH и C10:0 3-OH. Соотношение C16:0 в ASxL5T выше, чем зарегистрированное значение родственных родов. Напротив, по сравнению с сообщенным T. marinus IMCC1826TT, соотношение C18:1ω7c и/или C18:1ω6c в ASxL5T снижено. oleivorans MIL-1T и O. kriegii DSM 6294T, но не обнаружен у B. sanyensis KCTC 32220T. Сравнение профилей жирных кислот ASxL5T и ASxLS выявило тонкие различия в количестве отдельных жирных кислот между двумя штаммами, которые соответствуют последовательности геномной ДНК одного и того же вида. С помощью Суданского черного теста не было обнаружено частиц поли-3-гидроксибутирата (ПГБ).
Хищническая активность бактерий ASxL5T была изучена для определения ареала добычи. Эта бактерия может образовывать бляшки на таких видах Campylobacter, как: Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T; Escherichia coli NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; C lari NCTC 11458 и C. upsaliensis NCTC 11541T. Используйте культуры, перечисленные в разделе метода «Определение диапазона хозяев», для тестирования более широкого спектра грамотрицательных и грамположительных бактерий. Результаты показывают, что ASxL5T также можно использовать в отношении Escherichia coli NCTC 86 и Citrobacter freundii NCTC 9750T. Бляшки образуются на Klebsiella oxytoca 11466. Взаимодействие TEM с E. coli NCTC 86 показано на рисунках 4A-D, а взаимодействие с Campylobacter jejuni PT14 и Campylobacter suis S12 показано на рисунках 4E-H в середине. Механизм атаки, по-видимому, различен в зависимости от протестированных типов жертв: одна или несколько клеток E. coli прикрепляются к каждой клетке ASxL5T и располагаются латерально вдоль расширенной клетки перед адсорбцией. Напротив, ASxL5T, по-видимому, прикрепляется к Campylobacter через единственную точку контакта, обычно в контакте с вершиной клетки-хищника и вблизи вершины клетки Campylobacter (рис. 4H).
ПЭМ, показывающая взаимодействие между ASx5LT и добычей: (AD) и добычей E. coli; (EH) и добыча C. jejuni. (A) Типичная клетка ASx5LT, соединенная с одной клеткой E. coli (EC); (B) Нитчатый ASx5LT, прикрепленный к одной клетке EC; (C) Нитевидная клетка ASx5LT, соединенная с несколькими клетками EC; (D) Прикрепление более мелких клеток ASx5LT к одной клетке E. coli (EC); (E) одна клетка ASx5LT, соединенная с клеткой Campylobacter jejuni (CJ); (F) ASx5LT атакует клетки C. hyointestinalis (CH); (G) две ячейки ASx5LT атаковали ячейку CJ; (H) Крупный план точки крепления ASx5LT возле вершины клетки CJ (полоска 0,2 мкм). Полоса соответствует 1 мкм на рисунках (A – G).
Хищные бактерии эволюционировали, чтобы использовать обильные источники добычи. Очевидно, что они широко присутствуют во многих различных средах. Из-за узкого размера членов популяции можно изолировать бактерии ASxL5T из суспензии с помощью метода разделения фагов. Геномная значимость ASxL5T для членов семейства морских бактерий Oceanospirillaceae удивительна, хотя этот организм толерантен к соли и может расти на среде, содержащей 5% соли. Анализ качества воды суспензии показал, что содержание хлорида натрия составляет менее 0,1%. Таким образом, грязь находится далеко от морской среды – как географически, так и химически. Присутствие трех родственных, но разных изолятов из одного и того же источника свидетельствует о том, что эти хищники процветают в этой неморской среде. Кроме того, анализ микробиома (файлы данных доступны по адресу https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990) показал, что одна и та же последовательность гена 16S рРНК расположена в 50 наиболее распространенных операционных таксонах (OTU ) В нескольких интервалах отбора проб грязи. В базе данных Genbank было обнаружено несколько некультивируемых бактерий, которые имеют последовательности гена 16S рРНК, аналогичные бактериям ASxL5T. Эти последовательности вместе с последовательностями ASxL5T, ASxS5 и ASxO5, по-видимому, представляют собой разные клады, отделенные от Thalassolituus и Oceanobacter (рис. 2). Три вида некультивируемых бактерий (GQ921362, GQ921357 и GQ921396) были выделены из трещинной воды на глубине 1,3 километра на южноафриканском золотом руднике в 2009 году, а два других (DQ256320 и DQ337006) были выделены из грунтовых вод (также в ЮАР). в 2005 году). Последовательность гена 16S рРНК, наиболее близкородственная ASxL5T, является частью последовательности гена 16S рРНК, полученной из накопительной культуры песчаных отложений, полученных с пляжей северной Франции в 2006 году (номер доступа AM29240828). Другая близкородственная последовательность гена 16S рРНК из некультивируемой бактерии HQ183822.1 была получена из резервуара для сбора, выщелоченного на муниципальной свалке в Китае. Очевидно, что бактерии ASxL5T не очень репрезентативны в таксономических базах данных, но эти последовательности некультивируемых бактерий, вероятно, представляют организмы, подобные ASxL5T, которые распространены по всему миру, обычно в сложных условиях. По данным полногеномного филогенетического анализа, ближайшим родственником ASxL5T является Thalassolituus sp. С2-1, Т. marinus, Т. oleivorans. И O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus является представителем морских облигатных бактерий фрагментации углеводородов (OHCB), которые широко распространены в морской и наземной среде и обычно становятся доминантными после инцидентов, связанных с загрязнением углеводородами30,31. Морские бактерии не входят в группу OHCB, но изолированы от морской среды.
Фенотипические данные указывают на то, что ASxL5T является новым видом и членом ранее непризнанного рода семейства морских спироспировых. В настоящее время не существует четкого стандарта для отнесения вновь выделенных штаммов к новому роду. Предпринимались попытки определить универсальные границы родов, например, на основе процентного содержания в геноме консервативного белка (POCP), рекомендуется, чтобы пороговое значение было на 50% идентично эталонному штамму33. Другие предлагают использовать значения AAI, которые имеют преимущества перед POCP, поскольку их можно получить из неполных геномов34. Автор считает, что если значение ИАИ составляет менее 74% по сравнению с модельным штаммом модельного вида, штамм является представителем другого рода. Модельным родом морских spirillaceae является морская spirillum, а модельным штаммом – O. linum ATCC 11336T. Значение AAI между ASxL5T и O. linum ATCC 11336T составляет 54,34%, а значение AAI между ASxL5T и T. oleivorans MIL-1T (типовые штаммы рода) составляет 67,61%, что указывает на то, что ASxL5T представляет собой новый род, отличный от Thalassolituus. Используя последовательность гена 16S рРНК в качестве стандарта классификации, предполагаемая граница разграничения родов составляет 94,5%35. ASxL5T может быть отнесен к роду Thalassolituus, демонстрируя идентичность последовательности 16S рРНК с T. oleivorans MIL-1T на 95,03% и на 96,17%. Маринус IMCC1826T. Однако он также будет отнесен к роду Bacteroides, который имеет 94,64% идентичности гена 16S рРНК с B. sanyensis NV9, что указывает на то, что использование одного гена, такого как ген 16S рРНК, может привести к произвольной классификации и назначению. Другой предложенный метод использует ANI и показатель выравнивания генома (AF) для изучения кластеризации точек данных всех типов и нетиповых штаммов существующих родов. Автор рекомендует совмещать границу рода с точкой перегиба предполагаемого рода, специфичной для анализируемых таксонов. Однако если полных последовательностей генома изолятов Thalassolituus недостаточно, определить принадлежность ASxL5T к роду Thalassolituus этим методом невозможно. Из-за ограниченной доступности полных последовательностей генома для анализа все филогенетическое дерево генома следует интерпретировать с осторожностью. Во-вторых, методы сравнения целых геномов не могут объяснить существенные различия в размерах сравниваемых геномов. Они измерили сходство консервативных основных однокопийных генов между родственными родами, но не приняли во внимание большое количество генов, которых нет в гораздо меньшем геноме ASxL5T. Очевидно, что ASxL5T и группы, включающие Thalassolituus, Oceanobacter и Bacterioplanes, имеют общего предка, но эволюция пошла по другому пути, что привело к редукции генома, что, возможно, связано с адаптацией к хищническому образу жизни. Это контрастирует с T. oleivorans MIL-1T, который на 28% больше и эволюционировал под различным давлением окружающей среды, чтобы использовать углеводороды23,30. Интересное сравнение можно провести с облигатными внутриклеточными паразитами и симбионтами, такими как риккетсии, хламидии и бухнеры. Размер их генома составляет около 1 Мб. Способность использовать метаболиты клетки-хозяина приводит к потере генов, поэтому происходит значительная эволюционная геномная деградация. Эволюционные изменения от морских химических питательных организмов к хищническому образу жизни могут привести к аналогичному уменьшению размера генома. Анализ COG и KEGG подчеркивает количество генов, используемых для определенных функций, и глобальные различия в геномных путях между ASxL5T и T. oleivorans MIL-1T, которые не связаны с широкой доступностью мобильных генетических элементов. Разница в соотношении G+C всего генома ASxL5T составляет 56,1%, а T. oleivorans MIL-1T — 46,6%, что также свидетельствует о его сегрегации.
Изучение кодирующего содержимого генома ASxL5T дает функциональное представление о фенотипических характеристиках. Наличие генов, кодирующих фимбрии IV типа (Tfp), представляет особый интерес, поскольку они способствуют движению клеток, называемому социальным скольжением или конвульсиями, без жгутиков на поверхности. Согласно сообщениям, Tfp выполняет и другие функции, включая хищничество, патогенез, образование биопленок, естественное поглощение ДНК, автоматическую агрегацию и развитие клеток38. Геном ASxL5T содержит 18 генов, кодирующих дигуанилатциклазу (фермент, катализирующий превращение 2-гуанозинтрифосфата в гуанозин-2-фосфат и циклический диГМФ), и 6 генов, кодирующих соответствующий дигуанилат фосфат-дигуанилатциклазы. Ген эстеразы (катализирующий расщепление циклического ди-ГМФ до гуанозинмонофосфата) интересен тем, что цикл-ди-ГМФ является важным вторичным мессенджером, участвующим в развитии и разделении биопленок, движении, прикреплении клеток и вирулентности 39, 40 в этом процессе. Следует также отметить, что у Bdellovibrio бактериоворуса было показано, что двойной циклический GMP контролирует переход от свободного образа жизни к хищническому образу жизни41.
Большинство исследований хищных бактерий сосредоточено на Bdellovibrio, Bdellovibrio-подобных организмах и видах Myxococcus. Эти и другие известные примеры хищных бактерий образуют разнообразную группу. Несмотря на это разнообразие, был идентифицирован набор характерных семейств белков, которые отражают фенотипы 11 известных хищных бактерий3,22. Однако идентифицированы только гены, кодирующие лигазу О-антигена (waaL), что особенно часто встречается у грамотрицательных бактерий. Эта форма анализа не помогает определить ASxL5T как хищника, вероятно, потому, что он использует новую стратегию атаки. Наличие более разнообразных геномов хищных бактерий поможет разработать более точный анализ, учитывающий доказательства функциональных и экологических различий между членами группы. Примеры хищных бактерий, не включенных в этот анализ, включают представителей Cupriavidus necator42 и Bradymonabacteria43, поскольку по мере того, как исследователи исследуют различные микробные сообщества, выявляется больше хищных таксонов.
Наиболее примечательной особенностью бактерий ASxL5T, запечатленных на ПЭМ-изображении, является их уникальная и гибкая морфология, которая может способствовать взаимодействию с бактериями-жертвами. Наблюдаемый тип взаимодействия отличается от других хищных бактерий и ранее не был обнаружен или описан. Предполагаемый хищнический жизненный цикл ASxL5T показан на рисунке 5. В литературе есть несколько примеров с подобными апикальными структурами, как мы сообщаем здесь, но эти примеры включают Terasakiiispira papahanaumokuakeensis, морскую бактерию-спириллу с периодическим увеличением вершины 44 и Alphaproteobacteria, Terasakiella pusilla. , ранее принадлежавший к роду Oceanospirillum, экспонирующий так называемую «полярную пленку». 45. Формы кокков часто наблюдаются в старых культурах, особенно у бактерий с изогнутыми формами, таких как Vibrio, Campylobacter и Helicobacter 46, 47, 48, которые могут представлять собой деградированное состояние. Необходима дальнейшая работа для выяснения точного жизненного цикла бактерий ASxL5T. Определить, как он ловит и охотится, и кодирует ли его геном биологически активные соединения, которые можно использовать в медицинских или биотехнологических целях.
Описание Venatorbacter gen. Ноябрьский Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. состоит из венаторов от L. n. venator, «охотник» и гр. n. bacter, «жезл». Venatorbacter, «охотничий жезл»). Клетки аэробные, солеустойчивые, изогнутые по Граму, каталазная и оксидазная активность положительны. В диапазоне температур 4°С. до 42 °C Вросший Диапазон pH 4-9 необычен. Большинство морских улиток не переносят кислый pH. Основными жирными кислотами являются C16:1ω6c и/или C16:1ω7c, C16:0 и C18:1ω9; C12:03-OH и C10:03-OH встречаются в виде гидроксижирных кислот. ДНК G+ не растет. Содержание С составляет 56,1 мол.%. Представители этого рода проявляют устойчивость к кампилобактериям и хищническому поведению представителей семейства Enterobacteriaceae. Филогенетическое положение этого рода - внутрисемейное.
Описание Venatorbacter cucullus sp. Ноябрь Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus означает «обтекатель»).
Кроме того, описательной особенностью этого рода является то, что при выращивании на BA или BHI клетки имеют длину 1,63 мкм и ширину 0,37 мкм. Колонии на агаре BHI очень маленькие, достигающие 2 мм в диаметре через 72 часа. Они бежевые, полупрозрачные, круглые, выпуклые и блестящие. Представители этого вида могут использовать Escherichia coli и Klebsiella. Добычей служат Campylobacter и ряд других грамотрицательных бактерий.
Типичный штамм ASxL5T был выделен из говяжьего молока в Ноттингемшире, Великобритания, и депонирован в Национальной коллекции типовых культур (Великобритания): номер доступа NCTC 14397 и номер доступа NCCB 100775 в коллекции бактериальных культур Нидерландов. Полная последовательность генома ASxL5T. был депонирован в Генбанке согласно приписке CP046056.
Бактерии ASxL5T были выделены из говяжьего молока с использованием технологии выделения фагов9,49. Суспензию разводили в соотношении 1:9 (мас./об.) в буфере SM (50 мМ Tris-HCl [pH 7,5], 0,1 М NaCl, 8 мМ MgSO4,7H2O и 0,01% желатина; Sigma Aldrich, Джиллингем, Великобритания). Затем инкубировали. при 4°C в течение 24 часов, медленно вращая, чтобы элюировать хищников в буфер. Суспензию центрифугировали при 3000 g в течение 3 минут. Супернатант собирали и центрифугировали при 13000 g второй раз в течение 5 минут. Затем супернатант пропускали через мембранный фильтр 0,45 мкм (Minisart; Sartorius, Геттинген, Германия) и мембранный фильтр 0,2 мкм (Minisart) для удаления любых оставшихся бактериальных клеток. ASxL5T может проходить через эти фильтры. Мягкий агаровый газон Campylobacter enterosus S12 (инвентарный номер NCBI CP040464) из той же суспензии готовили с использованием стандартных методик. Отфильтрованную суспензию распределяли по каждому из этих планшетов с клетками-хозяевами каплями по 10 мкл в трех экземплярах и давали высохнуть. Планшет инкубировали в микроаэрофильном резервуаре при 37°C в течение 48 часов в микроаэробных условиях (5% O2, 5% H2, 10% CO2 и 80% N2). Полученную видимую бляшку экстрагировали в буфер SM и переносили на свежий газон C. hyointestinalis S12 для дальнейшего размножения лизированных организмов. Как только будет установлено, что причиной литических бляшек являются бактерии, а не фаг, попытайтесь вырастить организм независимо от хозяина и дополнительно охарактеризовать его. Аэробную культуру проводили при 37 °C с использованием 5% об./об. дефибринированной лошадиной крови (TCS Biosciences Lt, Букингем, Великобритания, добавка). Согласно рекомендациям Национального комитета по клиническим стандартам, для тестирования чувствительности к антибактериальным препаратам используется метод дисковой диффузии. Агар BHI культивировали при 37°C, используя диск, содержащий следующие антибиотики (Оксоид) для аэробной культуры: амоксициллин и клавулановую кислоту 30 мкг; цефотаксим 30 мкг; стрептомицин 10 мкг; ципрофлоксацин 5 мкг; Цефтазидим 30 мкг Налидиксовая кислота 30 мкг; Имипенем 10 мкг; Азитромицин 15 мкг; хлорамфеникол 30 мкг; Цефокситин 30 мкг; Тетрациклин 30 мкг; Нитрофурантоин 300 мкг; Азтреонам 30 мкг; Ампициллин 10 мкг; цефподоксим 10 мкг; Триметоприм-Сульфаметоксазол 25 мкг. Солеустойчивость устанавливали путем аэробной инкубации на чашках с агаром BHI при 37°C. Дополнительное количество NaCl добавляли в чашки с агаром BHI, чтобы обеспечить диапазон концентраций до 10% мас./об. Диапазон pH определяют с помощью аэробной культуры на чашках с агаром BHI при 37°C, где диапазон pH доводят до значения от 4 до 9 с помощью стерильной HCl или стерильного NaOH, а целевое значение pH проверяют перед заливкой чашки. Для анализа клеточных жирных кислот ASxL5T культивировали на агаре BHI в течение 3 дней в аэробных условиях при 37 °C. В соответствии со стандартным протоколом MIDI (Sherlock Microbial Identification System, версия 6.10) компании FERA Science Ltd (Йорк, Великобритания) жирные кислоты из клеток экстрагировали, получали и анализировали.
Для TEM ASxL5T культивировали в аэробных условиях путем равномерного распределения на BA при 37°C в течение 24 часов, а затем собирали в 1 мл 3% (об./об.) глутаральдегида в 0,1 М какодилатном буфере при комнатной температуре. Фиксировали в течение 1 часа, затем центрифугировали. при 10000 г в течение 3 минут. Затем осторожно ресуспендируйте осадок в 600 мкл 0,1 М какодилатного буфера. Перенесите фиксированную суспензию ASxL5T в формварную/углеродную пленку на медной сетке 200 меш. Бактерии окрашивали 0,5% (мас./об.) уранилацетатом в течение 1 минуты и исследовали с помощью ПЭМ с использованием микроскопа TEI Tecnai G2 12 Biotwin. Как упоминалось выше, объедините одинаковое количество жертв и хищников в бульоне NZCYM (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Лафборо) и инкубируйте в течение 48 часов в микроаэробных условиях Campylobacter или Campylobacter при 37°C. Взаимодействие хищника и жертвы также был исследован TEM. Аэробные условия для кишечной палочки. Независимо исследуйте добычу и хищные бактерии, чтобы определить любые изменения в морфологии клеток из-за хищничества. Для оптической микроскопии накопления ПОБ использовали метод Судана Блэка.
Выращивайте ночные культуры ASxL5T, размазывая ростки на чашках BHI или BA стерильным тампоном. Соберите клетки ASxL5T и приостановите их в MRD (CM0733, Oxoid), а затем поместите их при 4 ° C на 7 дней, чтобы заморить клетки голодом. Эталонную или лабораторную бактериальную культуру NCTC инокулировали в бульон BHI или питательный бульон № 2 (CM007, Oxoid), инкубировали в течение ночи, центрифугировали при 13000 g и ресуспендировали в MRD до тех пор, пока OD600 не становился 0,4. Культура: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, Klebsiella oxytoca 11466, Leuconostoc NCTC. 10817, Listeria Special бактерии NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, Rhodococcus подводный гамбургер NCTC 1621T, кишечные бактерии Salmonella Mondeville NCTC 5747, слизь NCTC 10861, Staphylococcus aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. Хозяина Campylobacter инкубировали в микроаэробных условиях на чашках BA при 37°C и суспендировали в бульоне NZCYM. Тестируемыми хозяевами Campylobacter являются: C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11458, C. lari NCTC 11458, C. jejuni. PT14, C... Соберите клетки в MRD, центрифугируйте при 13 000 g и ресуспендируйте в MRD до тех пор, пока OD600 не станет 0,4. Добавьте аликвоту 0,5 мл суспензии к 5 мл расплавленного верхнего агара NZCYM (0,6% агара) и вылейте на нижнюю пластину с 1,2% NZCYM. После отверждения и сушки серийно разведенный ASxL5T распределяли в виде капель по 20 мкл на каждую газонную доску в трех экземплярах. Температура и атмосфера культуры зависят от потребностей тест-бактерий.
Используйте набор бактериальной геномной ДНК GenElute™ (Sigma Aldridge) для получения ДНК из бактериальных изолятов. Для ПЦР-амплификации гена 16S рРНК и определения последовательности продукта с использованием химии терминации красителя (Eurofins Value Read Service, Германия) использовали стандартные методы. Используйте программу BLAST-N для сравнения этих последовательностей с другими последовательностями генов 16S рРНК для идентификации и сбора близкородственных видов. Они выравниваются с помощью ClustalW в программе MEGA X. Филогенетическое дерево было реконструировано с помощью MEGA X с использованием метода максимального правдоподобия на основе модели Тамура-Ней с 1000 управляемыми копиями54. Используйте набор геномной ДНК PureLink™ (Fisher Scientific, Лафборо, Великобритания) для извлечения ДНК для полногеномного секвенирования. Последовательность генома ASxL5T определяли с использованием комбинации Illumina MiSeq, которая состоит из двусторонних ридов длиной 250 п.о., состоящих из библиотеки, приготовленной с использованием набора для мечения Nextera, и ридов длиной от 2 до 20 килобайт с платформы PacBio. Исследовательский центр геномного секвенирования ДНК при Университете Сембии. Геном был собран с использованием CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen, Орхус, Дания). Культуры ASxL5T хранятся в Национальной коллекции типовых культур (Великобритания) и коллекции бактериальных культур Нидерландов (NCCB). Для сравнения использовались следующие геномы родственных организмов: Thalassolituus oleivorans MIL-1T (номер доступа HF680312, полный); Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (инвентарный номер BMYY01000001, неполный); Oceanobacter kriegii DSM 6294T (инвентарный номер NZ_AUGV00000000, неполный); DSM 5604T сообщества Marinamonas (добавлен ASM436330v1, неполный), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (добавлен MTSD02000001, неполный) и Thalassolituus sp. C2-1 (добавить NZ_VNIL01000001, неполное). Используйте портал генома JGI36 по адресу https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page=, чтобы определить показатель выравнивания (AF) и среднюю идентичность нуклеиновой кислоты (ANI). Попарно. Для определения идентичности аминокислот (AAI) использовали метод Родригеса-Р и Константинидиса55. Используйте GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 для создания предполагаемого филогенетического дерева максимальной вероятности. Входной геном, представляющий доступный эталонный геном, выбирается из эталонных родов, идентифицированных как родственные ASxL5T из филогении 16S рРНК. Аннотировал дерево с помощью интерактивного онлайн-инструмента «Древо жизни» (https://itol.embl.de/). Функциональная аннотация и анализ генома ASxL5T проводится с помощью онлайн-инструмента BlastKOALA KEGG с использованием обогащенного модуля KEGG (Киотская энциклопедия генов и геномов). Распределение категорий COG (ортологичных групп) определяется с помощью онлайн-инструмента eggNOG-mapper.
Перес Дж., Мораледа-Муньос А., Маркос-Торрес Ф.Дж. и Муньос-Дорадо Дж. Бактериальное хищничество: 75 лет и оно продолжается! . среда. микроорганизм. 18, 766–779 (2016).
Линарес-Отойя, Л. и др. Разнообразие и антибактериальный потенциал хищных бактерий на перуанском побережье. Мартовские наркотики. 15. Е308. https://doi.org/10.3390/md15100308 (2017).
Пастернак З. и др. По их генам вы поймете их: геномные характеристики хищных бактерий. ISME J. 7, 756–769 (2013).
Сокетт, Р.Э. Хищный образ жизни бактериофага Bdellovibrio. установить. Пасторские микробы. 63, 523–539 (2009).
Корп Дж., Вела Гурович М.С. и Нетт М. Антибиотики из хищных бактерий. Байльштейн Дж. Гистохимия 12, 594–607 (2016).
Джонке Дж., Фрауне С., Бош ТКГ, Хентшель У. и Шуленбург Х. Bdellovibrio и подобные организмы являются предикторами разнообразия микробиома в различных популяциях хозяев. микроорганизм. Экология. 79, 252–257 (2020).
Вила Дж., Морено-Моралес Дж. и Баллесте-Дельпьер К. Узнайте о текущем состоянии новых антибактериальных средств. клинический. микроорганизм. Заразить. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2019.09.015 (2019).
Хобли, Л. и др. Двойное хищничество фага и фага может уничтожить добычу E. coli без единого нападения. Дж. Бактерии. 202, е00629-19. https://doi.org/10.1128/JB.00629-19 (2020).
Эль-Шибины А., Коннертон П.Л. и Коннертон И.Ф. Количество и разнообразие кампилобактерий и бактериофагов, выделенных во время цикла кормления кур, находящихся на свободном выгуле, и органических кур. Среда применения. микроорганизм. 71, 1259–1266 (2005).
Уилкинсон, Д.А. и др. Обновление геномной таксономии и эпидемиологии свиней Campylobacter. наука. Представитель 8, 2393. https://doi.org/10.1038/s41598-018-20889-x (2018).
Ли, доктор медицинских наук GToTree: Удобный рабочий процесс для системной геномики. Биоинформатика 35, 4162–4164 (2019).
Эдгар, RC MUSCLE: метод множественного выравнивания последовательностей, уменьшающий сложность времени и пространства. Биологическая информация BMC. 5, 113 (2004).
Капелла-Гутьеррес С., Силла-Мартинес Х. М. и Габальдон Т. TrimAl: инструмент для автоматического выравнивания и обрезки в крупномасштабном филогенетическом анализе. Биоинформатика 25, 1972–1973 (2009).
Хаятт Д., ЛоКашио П.Ф., Хаузер Л.Дж. и Убербахер, Прогнозирование стартового сайта трансляции гена EC и метагеномной последовательности. Биоинформатика 28, 2223-2230 (2012).
Шен, В. и Сюн, Дж. TaxonKit: Межплатформенный и эффективный набор инструментов классификации NCBI. Био Rxiv. (По состоянию на 1 июня 2021 г.); https://www.biorxiv.org/content/10.1101/513523v1 (2019).
Прайс, Миннесота, Дехал, П.С. и Аркин, А.П. FastTree 2-приближенное дерево максимального правдоподобия с большим выравниванием. PLoS One 5, e9490 (2010 г.).
Танге, О. GNU Parallel. (По состоянию на 1 июня 2021 г.); https://zenodo.org/record/1146014#.YOHaiJhKiUk (2018).
Канехиса, М. и Гото, С. КЕГГ: Киотская энциклопедия генов и геномов. Исследование нуклеиновых кислот. 28, 27–30 (2000).
Чехия, Л. и др. Роль экстремолитов эктоина и гидроксиэктоина как защитников стресса и питательных веществ: генетика, системная геномика, биохимия и структурный анализ. Джин (Базель). 9. Е177. https://doi.org/10.3390/genes9040177 (2018).
Грегсон Б.Х., Методиева Г., Методиев М.В., Голышин П.Н., МакКью Б.А. Дифференциальная экспрессия белков при росте облигатной морской бактерии, разлагающей углеводороды Thalassolituus oleivorans MIL-1, при росте алканов со средней и длинной цепью. передний. микроорганизм. 9, 3130 (2018).
Пастернак З., Бен Сассон Т., Коэн Ю., Сегев Э. и Юркевич Э. Новый метод сравнительной геномики для определения фенотипически-специфичных показателей выявляет специфическое наследование у хищных бактерий. Публичная научная библиотека №1. 10. е0142933. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142933 (2015).
Якимов М.М. и др. Ген Thalassolituus oleivorans. Ноябрь, сп. nov., новый тип морских бактерий, специализирующийся на использовании углеводородов. интернациональность. Дж. Система. эволюция. микроорганизм. 54, 141–148 (2004).
Ван Ю., Ю М., Лю Ю., Ян Х. и Чжан XH Bacterioplanoides pacificum gen. Ноябрь, сп. В ноябре он отделился от морской воды, циркулирующей в южной части Тихого океана. интернациональность. Дж. Система. эволюция. микроорганизм. 66, 5010–5015 (2016).