Нови тип грам-негативних, аеробних, отпорних на со, активних, штапићастих и предаторских бактерија АСкЛ5Т изолован је из рибњака крављег балега у Нотингемширу у Енглеској и користио је Цампилобацтер као плен. Касније су друге врсте Цампилобацтер и чланови породице Ентеробацтериацеае откривени као плен. После субкултуре без ћелија домаћина, постигнут је слаб асептични раст на агару за инфузију мозга. Оптимални услови раста су 37 °Ц и пХ је 7. Трансмисиона електронска микроскопија открила је неке веома необичне морфолошке карактеристике везане за доступност плена. Филогенетска анализа коришћењем секвенце гена 16С рРНА показала је да је изолат повезан са чланом породице Марине Спирулина, али се не може јасно класификовати као члан било ког познатог рода. Секвенцирање целог генома АСкЛ5Т потврдило је везу са члановима морских спирохета. Претрага базе података открила је да неколико АСкЛ5Т дели секвенце гена 16С рРНА са неколико некултурних бактерија из океана, копнене површине и подземних вода. Предлажемо да сој АСкЛ5Т представља нову врсту у новом роду. Препоручујемо назив Венаторбацтер цуцуллус ген. новембар, сп. У новембру је АСкЛ5Т коришћен као типски сој.
Предаторске бактерије су бактерије које показују способност да лове и убијају друге живе бактерије како би добиле биосинтетичке материјале и енергију. Ово се разликује од општег опоравка хранљивих материја из мртвих микроорганизама, а такође се разликује од паразитских интеракција, у којима бактерије стварају блиску везу са својим домаћином, а да их не убијају. Предаторске бактерије су развиле различите животне циклусе како би искористиле предности богатих извора хране у нишама у којима се налазе (као што су морска станишта). Они су таксономски разнолика група, које повезује само њихов јединствени животни циклус стерилизације1. Примери предаторских бактерија пронађени су у неколико различитих типова, укључујући: Протеобацтериа, Бацтероидес и Цхлорелла.3. Међутим, најбоље проучаване предаторске бактерије су организми Бделловибрио и Бделловибрио и слични (БАЛОс4). Предаторске бактерије су обећавајући извор нових биолошки активних једињења и антибактеријских агенаса5.
Верује се да предаторске бактерије повећавају микробну разноликост и имају позитиван утицај на здравље, продуктивност и стабилност екосистема6. Упркос овим позитивним атрибутима, постоји неколико студија о новим предаторским бактеријама због потешкоћа у узгоју бактерија и потребе да се пажљиво посматрају интеракције ћелија да би се разумели њихови сложени животни циклуси. Ове информације није лако добити компјутерском анализом.
У ери све веће антимикробне резистенције, проучавају се нове стратегије за циљање бактеријских патогена, као што је употреба бактериофага и предаторских бактерија7,8. АСкЛ5Т бактерије су изоловане 2019. године коришћењем технологије изолације фага из крављег измета сакупљеног из Центра за млечне производе Универзитета у Нотингему, Нотингемшир. Сврха истраживања је да се изолују организми са потенцијалом као агенси биолошке контроле. Цампилобацтер хиоинтестиналис је зооноза, која се све више повезује са цревним обољењима људи10. У серуму је свеприсутан и користи се као циљни домаћин.
Бактерија АСкЛ5Т је изолована из говеђег желеа јер је уочено да су плакови које је формирала на травњаку Ц. хиоинтестиналис слични онима које производе бактериофаги. Ово је неочекивано откриће, јер део процеса изолације фага укључује филтрирање кроз филтер од 0,2 µм, који је дизајниран да уклони бактеријске ћелије. Микроскопско испитивање материјала екстрахованог из плака открило је да мале грам-негативне закривљене штапићасте бактерије нису акумулирале полихидроксибутират (ПХБ). Асептична култура независна од ћелија плена се реализује на богатом чврстом медијуму (као што је инфузиони агар мозга (БХИ) и крвни агар (БА)), а њен раст је слаб. Добија се након субкултуре са јаким побољшањем инокулума. Подједнако добро расте у микроаеробним (7% в/в кисеоника) и атмосферским условима кисеоника, али не и у анаеробној атмосфери. После 72 сата, пречник колоније је био веома мали, достигао је 2 мм, и био је беж, провидан, округао, конвексан и сјајан. Стандардно биохемијско тестирање је отежано јер се АСкЛ5Т не може поуздано узгајати у течним медијима, што сугерише да се може ослањати на сложен животни циклус формирања биофилма. Међутим, суспензија плоче је показала да је АСкЛ5Т аеробан, позитиван на оксидазу и каталазу и да може толерисати 5% НаЦл. АСкЛ5Т је отпоран на 10 µг стрептомицина, али је осетљив на све друге тестиране антибиотике. АСкЛ5Т бактеријске ћелије су испитане ТЕМ (Слика 1). Када се узгајају без ћелија плена на БА, АСкЛ5Т ћелије су мали Цампилобацтер, са просечном дужином од 1,63 μм (± 0,4), ширином од 0,37 μм (± 0,08) и једним дугим (до 5 μм) полом. Сексуалне флагеле. Чини се да отприлике 1,6% ћелија има ширину мању од 0,2 μм, што ће омогућити пролаз кроз филтерски уређај. Уочено је необично структурно проширење на врху неких ћелија, слично оклопу (латински цуцуллус) (види стрелице на 1Д, Е, Г). Чини се да се састоји од вишка спољне мембране, што може бити последица брзог смањења величине периплазматског омотача, док спољна мембрана остаје нетакнута, показујући „лабави“ изглед. Узгој АСкЛ5Т у одсуству хранљивих материја (у ПБС) дуго времена на 4 ° Ц резултирало је да већина (али не све) ћелија показује кокну морфологију (слика 1Ц). Када АСкЛ5Т расте са Цампилобацтер јејуни као пленом током 48 сати, просечна величина ћелије је значајно дужа и ужа од ћелија које се узгајају без домаћина (Табела 1 и Слика 1Е). Насупрот томе, када АСкЛ5Т расте са Е. цоли као пленом током 48 сати, просечна величина ћелије је дужа и шира него када расте без плена (Табела 1), а дужина ћелије је променљива, обично показује филаментну (Слика 1Ф). Када су инкубиране са Цампилобацтер јејуни или Е. цоли као пленом током 48 сати, ћелије АСкЛ5Т уопште нису показивале флагеле. Табела 1 сумира запажања промена у величини ћелије на основу присуства, одсуства и типа плена АСкЛ5Т.
ТЕМ дисплеј АСк5ЛТ: (А) АСк5ЛТ приказује дугачак бич; (Б) типична АСк5ЛТ батерија; (Ц) ћелије кока АСк5ЛТ након дуге инкубације без хранљивих материја; (Д) група АСк5ЛТ ћелија показује абнормалност (Е) АСк5ЛТ ћелијска група инкубирана са пленом Цампилобацтер показала је повећану дужину ћелија у поређењу са онима без раста плена (Д) такође је показала апикалну структуру; (Ф) Велика филаментозна флагела, АСк5ЛТ ћелије, након инкубације са Е. цоли пленом; (Г) Једна АСк5ЛТ ћелија након инкубације са Е. цоли, која показује необичну горњу структуру. Трака представља 1 μм.
Одређивање секвенце гена 16С рРНА (приступни број МТ636545.1) омогућава претрагама базе података да се успоставе секвенце сличне онима у класи Гаммапротеобацтериа, а најближе су морским бактеријама у породици морских спирилума (слика 2) и чланови су рода Тхалассолитуус Најближи рођак Марине Бациллус. Секвенца гена 16С рРНА се јасно разликује од предаторских бактерија које припадају породици Бделвибрионацеае (Делтапротеобацтериа). Поређења у пару Б. бацтериоворус ХД100Т (типски сој, ДСМ 50701) и Б. бацтериоворус ДМ11А била су 48,4% и 47,7%, а за Б. ековорус ЈСС 46,7%. АСкЛ5Т бактерије имају 3 копије гена 16С рРНА, од којих су две идентичне једна другој, а трећа је удаљена 3 базе. Два друга предаторска бактеријска изолата (АСк5С и АСк5О; приступни бројеви гена 16С рРНА су МТ636546.1 и МТ636547.1, респективно) са сличним морфолошким и фенотипским карактеристикама са исте локације нису исти, али се разликују од АСкЛ5Т и некултурног Баца секвенце базе података су груписане заједно са другим родовима у Оцеаноспириллацеае (слика 2). Целокупна секвенца генома АСкЛ5Т је одређена и сачувана у НЦБИ бази података, а приступни број је ЦП046056. Геном АСкЛ5Т се састоји од кружног хромозома од 2,831,152 бп са Г + Ц односом од 56,1%. Секвенца генома садржи 2653 ЦДС (укупно), од којих је предвиђено да 2567 кодира протеине, од којих се 1596 може доделити као претпостављене функције (60,2%). Геном садржи 67 гена који кодирају РНК, укључујући 9 рРНК (по 3 за 5С, 16С и 23С) и 57 тРНК. Геномске карактеристике АСкЛ5Т упоређене су са доступним геномима сојева најближег релативног типа идентификованог из секвенце гена 16С рРНА (Табела 2). Користите идентитет аминокиселина (ААИ) да бисте упоредили све доступне Тхалассолитуус геноме са АСкЛ5Т. Најближа доступна (непотпуна) секвенца генома коју одређује ААИ је Тхалассолитуус сп. Ц2-1 (додати НЗ_ВНИЛ01000001). Овај сој је изолован из дубокоморских седимената Маријанског рова, али тренутно нема фенотипских информација о овом соју ради поређења. У поређењу са АСкЛ5Т од 2,82 Мб, геном организма је већи на 4,36 Мб. Просечна величина генома морских спирохета је око 4,16 Мб (± 1,1; н = 92 комплетна референтна генома истражена са хттпс://ввв.нцби.нлм.них.гов/ассембли), тако да је геном АСкЛ5Т у складу са поредак У поређењу са осталим члановима, прилично је мали. Користите ГТоТрее 1.5.54 да генеришете филогенетско стабло максималне вероватноће засновано на геному (слика 3А), користећи усклађене и повезане секвенце аминокиселина 172 гена у једној копији специфичних за гамапротеобактерије 11,12,13,14,15,16, 17 ,18. Анализа је показала да је уско повезана са Тхалассолитуусом, бактеријском равнином и морском бактеријом. Међутим, ови подаци указују на то да се АСкЛ5Т разликује од својих рођака у морској спирулини и да су доступни подаци о секвенци његовог генома.
Филогенетско стабло које користи секвенцу гена 16С рРНА наглашава положај сојева АСкЛ5Т, АСкО5 и АСкС5 (са цревима) у односу на сојеве некултивисаних и морских бактерија у морским Спирулинацеае. Приступни број Генбанк прати назив соја у загради. Користите ЦлусталВ да поравнате секвенце и користите метод максималне вероватноће и Тамура-Неи модел да бисте закључили филогенетске односе и извршите 1000 вођених репликација у МЕГА Кс програму. Број на грани означава да је вредност вођене копије већа од 50%. Есцхерицхиа цоли У/541Т је коришћена као спољна група.
(А) Филогенетско стабло засновано на геному, које показује однос између морске бактерије Спироспирацеае АСкЛ5Т и њених блиских рођака, Е. цоли У 5/41Т као ван групе. (Б) У поређењу са Т. олеиворанс МИЛ-1Т, дистрибуција гена функционалне категорије је предвиђена на основу кластера ортологне групе (ЦОГ) протеина АСк5ЛТ. Слика са леве стране показује број гена у свакој функционалној категорији ЦОГ у сваком геному. Графикон са десне стране показује проценат генома садржаних у свакој функционалној ЦОГ групи. (Ц) У поређењу са Т. олеиверанс МИЛ-1Т, анализа комплетног КЕГГ (Кјото енциклопедија гена и генома) модуларног пута АСкЛ5Т.
Коришћење КЕГГ базе података за испитивање компонентних гена присутних у геному АСкЛ5Т открило је типичан метаболички пут аеробног гама Протеуса. АСкЛ5Т садржи укупно 75 гена додељених бактеријским моторним протеинима, укључујући гене укључене у хемотаксију, склапање флагела и систем фимбрија типа ИВ. У последњој категорији, 9 од 10 гена је одговорно за трзање низа других организама. Геном АСкЛ5Т садржи комплетан биосинтетски пут тетрахидропиримидина који учествује у заштитном одговору на осмотски стрес20, како се очекује за халофиле. Геном такође садржи много комплетних путева за кофакторе и витамине, укључујући путеве синтезе рибофлавина. Иако је ген алкан 1-монооксигеназе (алкБ2) присутан у АСкЛ5Т, пут коришћења угљоводоника није потпун. У секвенци генома АСкЛ5Т, хомолози гена који су идентификовани као главни одговорни за деградацију угљоводоника у Т. олеиверанс МИЛ-1Т21, као што су ТОЛ_2658 (алкБ) и ТОЛ_2772 (алкохол дехидрогеназа) очигледно су одсутни. Слика 3Б приказује поређење дистрибуције гена у категорији ЦОГ између АСкЛ5Т и маслиновог уља МИЛ-1Т. Све у свему, мањи АСкЛ5Т геном садржи пропорционално мање гена из сваке категорије ЦОГ у поређењу са већим сродним геномом. Када се број гена у свакој функционалној категорији изрази као проценат генома, примећују се разлике у процентима гена у категоријама транслације, структуре рибозома и биогенезе, као и категоријама функција производње и конверзије енергије, које чине већи АСкЛ5Т. геном Проценат је упоређен са истом групом присутном у геному Т. олеиверанс МИЛ-1Т. Насупрот томе, у поређењу са АСкЛ5Т геномом, Т. олеиворанс МИЛ-1Т има већи проценат гена у категоријама репликације, рекомбинације и поправке и транскрипције. Занимљиво је да је највећа разлика у садржају сваке функционалне категорије два генома број непознатих гена присутних у АСкЛ5Т (слика 3Б). Урађена је анализа обогаћивања КЕГГ модула, где сваки КЕГГ модул представља скуп ручно дефинисаних функционалних јединица за анотацију и биолошку интерпретацију података о секвенци генома. Поређење дистрибуције гена у комплетном путу КОГ модула АСкЛ5Т и МИЛ-1Т маслине приказано је на слици 3Ц. Ова анализа показује да иако АСкЛ5Т има потпуни метаболички пут сумпора и азота, Т. олеиверанс МИЛ-1Т нема. Насупрот томе, Т. олеиверанс МИЛ-1Т има потпун метаболички пут цистеина и метионина, али је непотпун у АСкЛ5Т. Стога, АСкЛ5Т има карактеристичан модул за асимилацију сулфата (дефинисан као скуп гена који се могу користити као фенотипски маркери, као што су метаболички капацитет или патогеност; хттпс://ввв.геноме.јп/кегг/модуле.хтмл) У Т олеиверанс МИЛ-1Т. Поређење садржаја гена АСкЛ5Т са листом гена који указују на предаторски начин живота је неубедљиво. Иако је вааЛ ген који кодира лигазу повезану са полисахаридом антигена О у језгру присутан у геному АСкЛ5Т (али је уобичајен код многих грам-негативних бактерија), гени триптофан 2,3-диоксигеназе (ТДО) могу укључивати 60 амино аминокиселина. киселе регије које се обично налазе у предаторским бактеријама које нису присутне. Нема других предаторских карактеристичних гена у АСкЛ5Т геному, укључујући оне који кодирају ензиме укључене у биосинтезу изопреноида на путу мевалоната. Имајте на уму да у испитиваној групи предатора не постоји регулаторни ген за транскрипцију гнтР, али се у АСкЛ5Т могу идентификовати три гена слична гнтР-у.
Фенотипске карактеристике АСкЛ5Т су сажете у табели 3 и упоређене са фенотипским карактеристикама сродних родова 23, 24, 25, 26 и 27 објављеним у литератури. Изолати из Т. маринус, Т. олеворанс, Б. саниенсис и Оцеанобацтер криегии су активна тела у облику штапа, отпорна на со, оксидаза позитивна, али немају скоро никакве друге фенотипске карактеристике са АСкЛ5Т. Просечна пХ вредност океана је 8,1 (хттпс://оцеан.си.еду/оцеан-лифе/инвертебратес/оцеан-ацидифицатион#сецтион_77), што се одражава на Т. маринус, Т. олеворанс, Б. саниенсис и О. криегии. АСкЛ5Т је погодан за већи пХ опсег (4-9) типичан за не-морске врсте. Фенотипске карактеристике Тхалассолитуус сп. Ц2-1. Непознато. Опсег температуре раста АСкЛ5Т је генерално шири него код морских сојева (4–42 °Ц), иако су неки, али не сви изолати Т. маринус, отпорни на топлоту. Немогућност да се расте АСкЛ5Т у медијуму бујона спречила је даљу фенотипску карактеризацију. Користите АПИ 20Е за тестирање материјала саструганих са БА плоче, ОНПГ, аргинин дихидролазе, лизин декарбоксилазе, орнитин декарбоксилазе, искоришћења цитрата, уреазе, триптофан деаминазе, ензима хидролизе желатина, сви резултати теста су били негативни, али без индола и Х2С, су произведени. Неферментисани угљени хидрати укључују: глукозу, манозу, инозитол, сорбитол, рамнозу, сахарозу, мелибиозу, амигдалин и арабинозу. У поређењу са објављеним сродним референтним сојевима, профил ћелијске масне киселине соја АСкЛ5Т приказан је у табели 4. Главне ћелијске масне киселине су Ц16:1ω6ц и/или Ц16:1ω7ц, Ц16:0 и Ц18:1ω9. Постоје и хидрокси масне киселине Ц12:0 3-ОХ и Ц10:0 3-ОХ. Однос Ц16:0 у АСкЛ5Т је већи од пријављене вредности сродних родова. Насупрот томе, у поређењу са пријављеним Т. маринус ИМЦЦ1826ТТ, однос Ц18:1ω7ц и/или Ц18:1ω6ц у АСкЛ5Т је смањен. олеиворанс МИЛ-1Т и О. криегии ДСМ 6294Т, али није откривен у Б. саниенсис КЦТЦ 32220Т. Упоређивање профила масних киселина АСкЛ5Т и АСкЛС открило је суптилне разлике у количини појединачних масних киселина између два соја, које су у складу са секвенцом геномске ДНК исте врсте. Никакве честице поли-3-хидроксибутирата (ПХБ) нису откривене коришћењем суданског црног теста.
Предаторска активност АСкЛ5Т бактерија је проучавана да би се одредио опсег плена. Ова бактерија може да формира плакове на врстама Цампилобацтер, укључујући: Цампилобацтер суис 11608Т, Цампилобацтер јејуни ПТ14, Цампилобацтер јејуни 12662, Цампилобацтер јејуни НЦТЦ 11168Т; Есцхерицхиа цоли НЦТЦ 12667; Ц. хелветицус НЦТЦ 12472; Ц лари НЦТЦ 11458 и Ц. упсалиенсис НЦТЦ 11541Т. Користите културе наведене у одељку методе за одређивање опсега домаћина да бисте тестирали шири спектар грам-негативних и грам-позитивних бактерија. Резултати показују да се АСкЛ5Т може користити и код Есцхерицхиа цоли НЦТЦ 86 и Цитробацтер фреундии НЦТЦ 9750Т. Плакови формирани на Клебсиелла окитоца 11466. ТЕМ интеракција са Е. цоли НЦТЦ 86 је приказана на слици 4А-Д, а интеракција са Цампилобацтер јејуни ПТ14 и Цампилобацтер суис С12 је приказана на слици 4Е-Х у средини. Чини се да се механизам напада разликује између тестираних типова плена, са једном или више ћелија Е. цоли које су причвршћене за сваку АСкЛ5Т ћелију и постављене бочно дуж проширене ћелије пре адсорпције. Насупрот томе, чини се да се АСкЛ5Т везује за Цампилобацтер кроз једну тачку контакта, обично у контакту са врхом ћелије предатора и близу врха ћелије Цампилобацтер (слика 4Х).
ТЕМ који показује интеракцију између АСк5ЛТ и плена: (АД) и плен Е. цоли; (ЕХ) и Ц. јејуни плен. (А) Типична АСк5ЛТ ћелија повезана са једном ћелијом Е. цоли (ЕЦ); (Б) филаментозна АСк5ЛТ везана за једну ЕЦ ћелију; (Ц) филаментозна АСк5ЛТ ћелија повезана са више ЕЦ ћелија; (Д) Причвршћивање мањих АСк5ЛТ ћелија на једну ћелију Е. цоли (ЕЦ); (Е) једна АСк5ЛТ ћелија повезана са ћелијом Цампилобацтер јејуни (ЦЈ); (Ф) АСк5ЛТ напада ћелије Ц. хиоинтестиналис (ЦХ); (Г) две Оне АСк5ЛТ ћелије су напале ЦЈ ћелију; (Х) Поглед изблиза на тачку везивања АСк5ЛТ, близу врха ЦЈ ћелије (бар 0,2 μм). Трака представља 1 μм у (А–Г).
Предаторске бактерије су еволуирале да би искористиле обиље извора плена. Очигледно, они су широко присутни у многим различитим окружењима. Због уске величине чланова популације, могуће је изоловати АСкЛ5Т бактерије из каше методом одвајања фага. Геномска релевантност АСкЛ5Т за чланове породице морских бактерија оцеаноспириллацеае је изненађујућа, иако је организам толерантан на со и може да расте на медијуму који садржи 5% соли. Анализа квалитета воде у суспензији је показала да је садржај натријум хлорида мањи од 0,1%. Због тога је блато далеко од морског окружења - и географски и хемијски. Присуство три сродна, али различита изолата из истог извора пружа доказ да ови грабежљивци напредују у овом неморском окружењу. Поред тога, анализа микробиома (датотеке са подацима доступне на хттпс://ввв.еби.ац.ук/ена/бровсер/виев/ПРЈЕБ38990) показала је да се иста секвенца гена 16С рРНА налази у 50 најзаступљенијих оперативних таксона (ОТУ). ) У неколико интервала узорковања муља. Неколико некултурних бактерија пронађено је у бази података Генбанк, које имају секвенце гена 16С рРНА сличне АСкЛ5Т бактеријама. Ове секвенце, заједно са секвенцама АСкЛ5Т, АСкС5 и АСкО5, изгледа да представљају различите кладе одвојене од Тхалассолитуус и Оцеанобацтер (Слика 2). Три врсте некултурних бактерија (ГК921362, ГК921357 и ГК921396) изоловане су из воде у пукотини на дубини од 1,3 километра у јужноафричком руднику злата 2009. године, а друге две (ДК256320 и ДК337006) су из подземних вода Јужне Африке ( 2005. године). Секвенца 16С рРНА гена која је најближа АСкЛ5Т део је секвенце гена 16С рРНА добијене из културе обогаћивања пешчаних седимената добијених са плажа северне Француске 2006. године (приступни број АМ29240828). Још једна блиско сродна секвенца гена 16С рРНА из некултивисане бактерије ХК183822.1 добијена је из сабирног резервоара испупченог са општинске депоније у Кини. Очигледно, АСкЛ5Т бактерије нису високо репрезентативне у таксономским базама података, али ове секвенце из некултивисаних бактерија вероватно представљају организме сличне АСкЛ5Т, који су дистрибуирани широм света, обично у изазовним окружењима. Из целе филогенетске анализе генома, најближи сродник АСкЛ5Т је Тхалассолитуус сп. Ц2-1, Т. маринус, Т. олеиворанс. И О. криегии 23, 24, 25, 26, 27. Тхалассолитуус је члан морских обавезних бактерија фрагментације угљоводоника (ОХЦБ), која је распрострањена у морским и копненим срединама, и обично постаје доминантна након инцидената загађења угљоводоницима30,31. Морске бактерије нису чланови ОХЦБ групе, већ су изоловане из морске средине.
Фенотипски подаци указују да је АСкЛ5Т нова врста и члан раније непризнатог рода у породици морских спироспирацеае. Тренутно не постоји јасан стандард за класификацију новоизолованих сојева у нови род. Учињени су покушаји да се утврде универзалне границе родова, на пример, на основу процента генома конзервативног протеина (ПОЦП), препоручује се да гранична вредност буде 50% идентична референтном соју33. Други предлажу коришћење ААИ вредности, које имају предности у односу на ПОЦП јер се могу добити из некомплетних генома34. Аутор сматра да ако је вредност ААИ мања од 74% у поређењу са моделним сојем моделне врсте, сој је представник другог рода. Моделни род у морским спириллацеае је морски спирилум, а моделни сој је О. линум АТЦЦ 11336Т. Вредност ААИ између АСкЛ5Т и О. линум АТЦЦ 11336Т је 54,34%, а вредност ААИ између АСкЛ5Т и Т. олеиворанс МИЛ-1Т (сојеви типа рода) је 67,61%, што указује да АСкЛ5Т представља нови род другачији од Тхалассолитуус. Користећи секвенцу гена 16С рРНА као класификациони стандард, предложена граница разграничења рода је 94,5%35. АСкЛ5Т се може ставити у род Тхалассолитуус, показујући 95,03% идентичност секвенце 16С рРНА са Т. олеиворанс МИЛ-1Т и 96,17%. маринус ИМЦЦ1826Т. Међутим, такође ће бити стављен у род Бацтероидес који има 94,64% идентичност 16С рРНА гена са Б. саниенсис НВ9, што указује да употреба једног гена као што је 16С рРНА ген може довести до произвољног разврставања и додељивања. Други предложени метод користи АНИ и оцену поравнања генома (АФ) да испита груписање тачака података из свих типова и нетипских сојева постојећих родова. Аутор препоручује комбиновање границе рода са преломном тачком процењеног рода специфичног за таксоне који се анализира. Међутим, ако нема довољно комплетних секвенци генома из изолата Тхалассолитуус, овим методом је немогуће утврдити да ли АСкЛ5Т припада роду Тхалассолитуус. Због ограничене доступности комплетних секвенци генома за анализу, целокупно филогенетско стабло генома треба тумачити са опрезом. Друго, методе поређења целог генома не могу објаснити значајне разлике у величини упоређених генома. Они су мерили сличност конзервираних гена са једном копијом између сродних родова, али нису узели у обзир велики број гена који нису присутни у много мањем геному АСкЛ5Т. Очигледно, АСкЛ5Т и групе укључујући Тхалассолитуус, Оцеанобацтер и Бацтериопланес имају заједничког претка, али еволуција је кренула другачијим путем, што је довело до смањења генома, што може бити прилагођавање предаторском начину живота. Ово је у супротности са Т. олеиворанс МИЛ-1Т, који је 28% већи и који је еволуирао под различитим притисцима животне средине да би искористио угљоводонике23,30. Може се направити занимљиво поређење са обавезним интрацелуларним паразитима и симбионтима, као што су Рицкеттсиа, Цхламидиа и Буцхнера. Величина њиховог генома је око 1 Мб. Способност коришћења метаболита ћелије домаћина доводи до губитка гена, па је подвргнут значајној еволуционој геномској деградацији. Еволуционе промене од морских хемијских хранљивих организама до предаторских начина живота могу довести до сличног смањења величине генома. ЦОГ и КЕГГ анализа наглашава број гена који се користе за специфичне функције и глобалне разлике у геномским путевима између АСкЛ5Т и Т. олеиворанс МИЛ-1Т, које нису последица широко распрострањене доступности мобилних генетских елемената. Разлика у Г + Ц односу целог генома АСкЛ5Т је 56,1%, а Т. олеиворанс МИЛ-1Т 46,6%, што такође указује на сегрегацију.
Испитивање садржаја кодирања АСкЛ5Т генома пружа функционални увид у фенотипске карактеристике. Присуство гена који кодирају фимбрије типа ИВ (Тфп) је од посебног интереса јер промовишу кретање ћелија, названо социјално клизање или конвулзије, без флагела на површини. Према извештајима, Тфп има и друге функције, укључујући грабежљивост, патогенезу, формирање биофилма, природно узимање ДНК, аутоматску агрегацију ћелија и развој38. АСкЛ5Т геном садржи 18 гена који кодирају дигванилат циклазу (ензим који катализује конверзију 2 гванозин трифосфата у гванозин 2 фосфат и циклични диГМП) и 6 гена који кодирају одговарајући дигванилат циклаза фосфат дигуанилат фосфат. Ген за естеразу (катализујући разградњу цикличног ди-ГМП до гванозин монофосфата) је интересантан јер је цикл-ди-ГМП важан други гласник укључен у развој и раздвајање биофилма, кретање, везивање ћелија и вируленцију 39, 40 у том процесу. Такође треба напоменути да се код Бделловибрио бацтериоворус показало да циклични двоструки ГМП контролише транзицију између слободног живота и предаторског начина живота41.
Већина истраживања о предаторским бактеријама фокусирана је на Бделловибрио, организме сличне Бделловибрио и врсте Микоцоццус. Ови и други познати примери предаторских бактерија чине разнолику групу. Упркос овој разноликости, идентификован је скуп карактеристичних породица протеина који одражавају фенотипове 11 познатих предаторских бактерија3,22. Међутим, идентификовани су само гени који кодирају О антиген лигазу (вааЛ), што је посебно често код Грам-негативних бактерија. Овај облик анализе није од помоћи у означавању АСкЛ5Т као предатора, вероватно зато што користи нову стратегију напада. Доступност разноврснијих предаторских бактеријских генома помоћи ће да се развију анализе финије резолуције које узимају у обзир доказе о функционалним и еколошким разликама између чланова групе. Примери предаторских бактерија које нису укључене у ову анализу укључују чланове Цуприавидус нецатор42 и Брадимонабацтериа43, јер док истраживачи истражују различите микробне заједнице, успоставља се више предаторских таксона.
Најзначајнија карактеристика АСкЛ5Т бактерија снимљених ТЕМ сликом је њена јединствена и флексибилна морфологија, која може промовисати интеракцију са бактеријама плена. Уочена врста интеракције се разликује од других предаторских бактерија и није раније откривена или пријављена. Предложени животни циклус грабежљиваца АСкЛ5Т приказан је на слици 5. Постоји неколико примера у литератури са сличним апикалним структурама као што овде извештавамо, али ови примери укључују Терасакииспира папаханаумокуакеенсис, морску спирилум бактерију са повременим повећањем врха 44, и Алпхапротеобацтериа пу тералла, , који је раније припадао роду Оцеаноспириллум, са такозваним "поларним филмом" 45. Форме кока се често примећују у старијим културама, посебно код бактерија са закривљеним облицима, као што су Вибрио, Цампилобацтер и Хелицобацтер 46, 47, 48, који могу представљати деградирано стање. Потребан је даљи рад да би се разјаснио прецизан животни циклус АСкЛ5Т бактерија. Да се ​​утврди како хвата и плени, и да ли његов геном кодира биолошки активна једињења која се могу користити у медицинске или биотехнолошке сврхе.
Опис Венаторбацтер ген. Новембар Венаторбацтер (Вен.а.тор, ба'ц.тер, Л. се састоји од венатора од Л. н. венатор, 'ловац' и Гр. н. бацтер, 'штап'. Венаторбацтер, 'ловачки штап' Ћелије су аеробне, закривљене по Граму, активност каталазе и оксидазе се не акумулира Температура у распону од 4 до 42 °Ц Урасли у опсегу пХ вредности од 4 до 9 Код морских пужева, већина је нетолерантна на кисели пХ. Ц18:1ω9 ; Ц12:0 3-ОХ и Ц10:0 3-ОХ налазе се као хидрокси масне киселине не расте у бујону. Садржај ДНК Г + Ц је 56,1 мол%.
Опис Венаторбацтер цуцуллус сп. Новембар Венаторбацтер цуцуллус (цу'цулл.ус.; Л. н. цуцуллус значи оплата).
Поред тога, дескриптивна карактеристика овог рода је да када се узгајају на БА или БХИ, ћелије су дугачке 1,63 µм и широке 0,37 µм. Колоније на БХИ агару су веома мале, достижу 2 мм у пречнику након 72 сата. Они су беж, провидни, округли, конвексни и сјајни. Припадници ове врсте могу користити Есцхерицхиа цоли и Клебсиелла. Кампилобактер и неколико других грам-негативних бактерија служе као плен.
Типични сој АСкЛ5Т изолован је из говеђег млека у Нотингемширу, УК, и депонован у Националну колекцију типских култура (УК): приступни број НЦТЦ 14397 и Холандска збирка бактеријских култура (НЦЦБ) приступни број НЦЦБ 100775. Комплетна секвенца генома АСкЛ5Т је депонован у Генбанк према додатку ЦП046056.
АСкЛ5Т бактерије су изоловане из говеђег млека коришћењем технологије изолације фага9,49. Суспензија је разблажена 1:9 (в/в) у СМ пуферу (50 мМ Трис-ХЦл [пХ 7,5], 0,1 М НаЦл, 8 мМ МгСО4.7Х2О и 0,01% желатина; Сигма Алдрицх, Гиллингхам, УК), затим инкубирајте на 4°Ц током 24 сата, полако ротирајући да се елуира предатора у тампон. Суспензија је центрифугирана на 3000 г током 3 минута. Супернатант је сакупљен и центрифугиран на 13,000 г по други пут током 5 минута. Супернатант је затим пропуштен кроз 0,45 µм мембрански филтер (Минисарт; Сарториус, Готтинген, Немачка) и 0,2 µм мембрански филтер (Минисарт) да би се уклониле све преостале бактеријске ћелије. АСкЛ5Т може проћи ове филтере. Меки агар травњак од Цампилобацтер ентеросус С12 (НЦБИ приступни број ЦП040464) из исте суспензије је припремљен коришћењем стандардних техника. Филтрирана суспензија је распоређена на сваку од ових плоча ћелије домаћина у капљицама од 10 ул у три примерка и остављена да се осуши. Плоча је инкубирана у микроаерофилном резервоару на 37°Ц током 48 сати у микроаеробним условима (5% О2, 5% Х2, 10% ЦО2 и 80% Н2). Добијени видљиви плак је екстрахован у СМ пуфер и пренет на свеж травњак Ц. хиоинтестиналис С12 да би се даље размножавали лизирани организми. Када се утврди да су бактерије узрок литичког плака, а не фага, покушајте да узгајате организам независно од домаћина и даље га карактеришете. Аеробна култура је изведена на 37 °Ц са 5% в/в дефибринисане коњске крви (ТЦС Биосциенцес Лт, Буцкингхам, УК, додатак). Према смерницама Националног комитета за клиничке стандарде, метода дифузије диска се користи за тестирање осетљивости на антибактерије. БХИ агар је култивисан на 37 °Ц коришћењем диска који садржи следеће антибиотике (Окоид) за аеробну културу: амоксицилин и клавуланска киселина 30 µг; цефотаксим 30 µг; стрептомицин 10 µг; ципрофлоксацин 5 µг; Цефтазидим 30 µг Налидиксична киселина 30 µг; Имипенем 10 µг; Азитромицин 15 µг; Хлорамфеникол 30 µг; цефокситин 30 µг; Тетрациклин 30 µг; Нитрофурантоин 300 µг; Азтреонам 30 µг; ампицилин 10 µг; Цефподоксим 10 µг; Триметоприм-Сулфаметоксазол 25 µг. Толеранција соли је утврђена аеробном инкубацијом на БХИ агар плочама на 37 °Ц. Додатни НаЦл је додат на БХИ агар плоче да би се обезбедио опсег концентрације до 10% в/в. Опсег пХ је одређен аеробном културом на БХИ агар плочама на 37°Ц, где је пХ опсег подешен на између 4 и 9 помоћу стерилне ХЦл или стерилног НаОХ, а циљна пХ вредност је верификована пре изливања плоче. За анализу ћелијске масне киселине, АСкЛ5Т је култивисан на БХИ агару 3 дана и аеробно на 37 ° Ц. Према МИДИ (Схерлоцк Мицробиал Идентифицатион Систем, верзија 6.10) стандардном протоколу ФЕРА Сциенце Лтд, (Иорк, УК), ћелијске масне киселине су екстраховане, припремљене и анализиране.
За ТЕМ, АСкЛ5Т је култивисан аеробно расипањем на БА на 37°Ц током 24 сата, а затим сакупљен у 1 мл 3% (в/в) глутаралдехида у 0,1 М какодилатном пуферу на собној температури Фиксирајте 1 сат, затим центрифугирајте на 10.000 г током 3 минута. Затим нежно ресуспендујте пелет у 600 μл 0,1 М какодилатног пуфера. Пренесите фиксирану суспензију АСкЛ5Т на Формвар/карбонски филм на бакарној мрежи од 200 месх. Бактерије су обојене са 0,5% (в/в) уранил ацетата током 1 минута и испитане ТЕМ помоћу ТЕИ Тецнаи Г2 12 Биотвин микроскопа. Као што је горе поменуто, комбинујте исти број плена и предатора у НЗЦИМ бујону (БД Дифцо™, Фисхер Сциентифиц УК Лтд, Лоугхбороугх) и инкубирајте 48 сати у микроаеробним условима Цампилобацтер или Цампилобацтер на 37°Ц, Интеракција предатора и плена прегледао је и ТЕМ. Аеробни услови за Есцхерицхиа цоли. Независно испитајте плен и предаторске бактерије да бисте утврдили било какве промене у морфологији ћелија услед предаторства. За оптичку микроскопију акумулације ПХБ коришћена је метода Судан блацк.
Узгајати АСкЛ5Т културе преко ноћи размазујући раст на БХИ или БА плоче стерилним тампоном. Сакупите АСкЛ5Т ћелије и суспендујте их у МРД (ЦМ0733, Оксоид), а затим их ставите на 4°Ц током 7 дана да изгладњују ћелије. НЦТЦ референтна или лабораторијска основна бактеријска култура је инокулисана у БХИ бујон или хранљиву бујон бр. 2 (ЦМ007, Окоид), инкубирана преко ноћи, центрифугирана на 13,000 г и ресуспендована у МРД док ОД600 није била 0,4. Култура: Бациллус субтилис НЦТЦ 3610Т, Цитробацтер фреундии НЦТЦ 9750Т, Ентеробацтер аерогенес НЦТЦ 10006Т, Ентероцоццус фаецалис НЦТЦ 775Т, Есцхерицхиа цоли НЦТЦ 86, Клебсиелла1уцоност НЦТЦ 66, Клебсиелла1уцоност НЦТЦ6 10817, Листериа Специјалне бактерије НЦТЦ 4885, Бациллус мацеранс НЦТЦ 6355Т, Провиденциа стуартсии НЦТЦ 10318, Псеудомонас флуоресценс СМДЛ, Рходоцоццус подморски хамбургер НЦТЦ 1621Т, бактерије салмонела 4 НЦТЦ 1621Т7, Салмонелла 7 НЦТЦ 10861, Стапхилоцоццус ауреус НЦТЦ 8532Т, Стрептоцоццус пнеумониае НЦТЦ 7465Т, Иерсиниа ентероцолитица НЦТЦ 10460. Домаћин Цампилобацтер је микроаеробно инкубиран на БАЗЦ плочама и суспендован у Н°Ц брошуру. Тестирани домаћини Цампилобацтер су: Ц. цоли 12667 НЦТЦ, Ц. јејуни 12662, Ц. јејуни ПТ14, Ц. јејуни НЦТЦ 11168Т, Ц. хелветицус НЦТЦ 12472, Ц. лари НЦТЦ 11458, Ц. лари НЦТЦ 11458, 11458 НЦТЦ. ПТ14, Ц... Сакупите ћелије у МРД, центрифугирајте на 13,000 г и ресуспендујте у МРД док ОД600 не буде 0,4. Додајте аликвот од 0,5 мл суспензије у 5 мл растопљеног НЗЦИМ горњег агара (0,6% агара) и сипајте га на доњу плочу од 1,2% НЗЦИМ. Након очвршћавања и сушења, серијски разблажени АСкЛ5Т је распоређен као капљице од 20 µл на сваку даску за травњак у три примерка. Температура културе и атмосфера зависе од захтева тестираних бактерија.
Користите ГенЕлуте™ комплет за бактеријску геномску ДНК (Сигма Алдридге) да припремите ДНК из бактеријских изолата. Стандардне методе су коришћене за ПЦР амплификацију 16С рРНА гена и одређивање секвенце производа коришћењем хемије терминације боје (Еурофинс Валуе Реад Сервице, Немачка). Користите програм БЛАСТ-Н да упоредите ове секвенце са другим секвенцама гена 16С рРНА да бисте идентификовали и прикупили блиско сродне врсте. Они су поравнати помоћу ЦлусталВ у МЕГА Кс програму. Филогенетско стабло је реконструисано коришћењем МЕГА Кс коришћењем методе максималне вероватноће засноване на Тамура-Неи моделу, са 1000 вођених копија54. Користите ПуреЛинк™ Геномиц ДНК Кит (Фисхер Сциентифиц, Лоугхбороугх, УК) да бисте издвојили ДНК за секвенцирање целог генома. Секвенца генома АСкЛ5Т одређена је коришћењем комбинације Иллумина МиСек, која се састоји од двостраних читања од 250 бп састављених од библиотеке припремљене коришћењем Нектера комплета за обележавање и 2 до 20 кб дугих читања са ПацБио платформе. Истраживачка установа за секвенцирање геномике ДНК на Универзитету Сембиа. Геном је састављен коришћењем ЦЛЦ Геномицс Воркбенцх 12.0.3 (Киаген, Аархус, Данска). АСкЛ5Т културе су депоноване у Националној колекцији типских култура (УК) и Холандској колекцији бактеријских култура (НЦЦБ). Геноми сродних организама који се користе за поређење су: Тхалассолитуус олеиворанс МИЛ-1Т (приступни број ХФ680312, комплетан); Бацтериопланес саниенсис КЦТЦ 32220Т (приступни број БМИИ01000001, непотпун); Оцеанобацтер криегии ДСМ 6294Т (приступни број НЗ_АУГВ00000000, непотпун); Маринамонас заједница ДСМ 5604Т (додат АСМ436330в1, непотпун), Оцеаноспируллум линум АТЦЦ 11336Т (додат МТСД02000001, непотпун) и Тхалассолитуус сп. Ц2-1 (додати НЗ_ВНИЛ01000001, непотпуно). Користите ЈГИ Геноме Портал36 на хттпс://имг.јги.дое.гов//цги-бин/мер/маин.цги?сецтион=АНИ&паге= да бисте одредили резултат поравнања (АФ) и просечни идентитет нуклеинске киселине (АНИ). У паровима. За одређивање идентитета аминокиселина (ААИ) коришћен је метод Родригуез-Р & Константинидис55. Користите ГТоТрее 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 да генеришете процењено филогенетско стабло максималне вероватноће. Улазни геном који представља доступни референтни геном је изабран из референтних родова идентификованих као сродних са АСкЛ5Т из филогеније 16С рРНА. Означио дрво користећи интерактивни онлајн алат за дрво живота (хттпс://итол.ембл.де/). Функционална анотација и анализа АСкЛ5Т генома се врши коришћењем БластКОАЛА КЕГГ онлајн алата користећи КЕГГ (Кјото Енциклопедија гена и генома) модул за дистрибуцију обогаћивања. Дистрибуција ЦОГ категорија (ортологне групе) се утврђује коришћењем еггНОГ-маппер онлајн алата.
Перез, Ј., Мораледа-Муноз, А., Марцос-Торрес, ФЈ и Муноз-Дорадо, Ј. Бактеријска грабежљивост: 75 година и наставља се! . животне средине. микроорганизам. 18, 766–779 (2016).
Линарес-Отоиа, Л. итд. Разноврсност и антибактеријски потенцијал предаторских бактерија на перуанској обали. мартовске дроге. 15. Е308. хттпс://дои.орг/10.3390/мд15100308 (2017).
Пастернак, З. ет ал. Кроз њихове гене ћете их разумети: геномске карактеристике предаторских бактерија. ИСМЕ Ј. 7, 756–769 (2013).
Соцкетт, РЕ Предаторски начин живота бактериофага Бделловибрио. инсталирати. Пастор микроби. 63, 523–539 (2009).
Корп, Ј., Вела Гуровић, МС & Нетт, М. Антибиотици из предаторских бактерија. Беилстеин Ј. Хистоцхемистри 12, 594–607 (2016).
Јохнке, Ј., Фрауне, С., Босцх, ТЦГ, Хентсцхел, У. & Сцхуленбург, Х. Бделловибрио и слични организми су предиктори диверзитета микробиома у различитим популацијама домаћина. микроорганизам. Екологија. 79, 252–257 (2020).
Вила, Ј., Морено-Моралес, Ј. и Баллесте-Делпиерре, Ц. Откријте тренутни статус нових антибактеријских средстава. клинички. микроорганизам. Инфецт. хттпс://дои.орг/10.1016/ј.цми.2019.09.015 (2019).
Хоблеи, Л. ет ал. Двострука грабежљивост фага и фага може искоренити плен Е. цоли без иједног предаторства. Ј. Бацтериа. 202, е00629-19. хттпс://дои.орг/10.1128/ЈБ.00629-19 (2020).
Ел-Схибини, А., Цоннертон, ПЛ & Цоннертон, ИФ Број и разноликост Цампилобацтер и бактериофага изолованих током циклуса храњења пилића из слободног узгоја и органских пилића. Окружење апликације. микроорганизам. 71, 1259–1266 (2005).
Вилкинсон, ДА итд. Ажурирање геномске таксономије и епидемиологије свиња Цампилобацтер. науке. Представник 8, 2393. хттпс://дои.орг/10.1038/с41598-018-20889-к (2018).
Лее, МД ГТоТрее: Ток рада лак за употребу за системску геномику. Биоинформатика 35, 4162–4164 (2019).
Едгар, РЦ МУСЦЛЕ: Метода вишеструког поравнања секвенци која смањује сложеност времена и простора. БМЦ биолошке информације. 5, 113 (2004).
Цапелла-Гутиеррез, С., Силла-Мартинез, ЈМ & Габалдон, Т. ТримАл: Алат за аутоматско поравнавање и подрезивање у великој филогенетској анализи. Биоинформатика 25, 1972–1973 (2009).
Хиатт, Д., ЛоЦасцио, ПФ, Хаусер, Љ & Убербацхер, ЕЦ ген и метагеномска секвенца предвиђање почетног места транслације. Биоинформатика 28, 2223-2230 (2012).
Схен, В. & Ксионг, Ј. ТаконКит: Вишеплатформски и ефикасан НЦБИ алат за класификацију. Био Ркив. (Приступљено 1. јуна 2021.); хттпс://ввв.биоркив.орг/цонтент/10.1101/513523в1 (2019).
Прице, МН, Дехал, ПС & Аркин, АП ФастТрее 2-приближно стабло максималне вероватноће са великим поравнањем. ПЛоС Оне 5, е9490 (2010).
Танге, О. ГНУ Параллел. (Приступљено 1. јуна 2021.); хттпс://зенодо.орг/рецорд/1146014#.ИОХаиЈхКиУк (2018).
Канехиса, М. & Гото, С. КЕГГ: Кјото енциклопедија гена и генома. Истраживање нуклеинских киселина. 28, 27-30 (2000).
Чешка Република, Л. итд. Улога екстремолита ектоина и хидроксиектоина као заштитника стреса и нутријената: генетика, системска геномика, биохемија и структурна анализа. Гене (Базел). 9. Е177. хттпс://дои.орг/10.3390/генес9040177 (2018).
Грегсон, БХ, Методиева, Г., Методиев, МВ, Голисхин, ПН & МцКев, БА Диференцијална експресија протеина током раста обавезне морске бактерије која разграђује угљоводонике Тхалассолитуус олеиворанс МИЛ-1 током раста алкана средњег и дугог ланца. фронт. микроорганизам. 9, 3130 (2018).
Пастернак, З., Бен Сассон, Т., Цохен, И., Сегев, Е., анд Јуркевитцх, Е. Нова компаративна геномичка метода за дефинисање фенотипско-специфичних индикатора открива специфично наслеђе код предаторских бактерија. Јавна научна библиотека један. 10. е0142933. хттпс://дои.орг/10.1371/јоурнал.поне.0142933 (2015).
Иакимов, ММ и др. Тхалассолитуус олеиворанс ген. новембар, сп. нов., нова врста морских бактерија која је специјализована за употребу угљоводоника. интернационалност. Ј. Систем. еволуција. микроорганизам. 54, 141–148 (2004).
Ванг, И., Иу, М., Лиу, И., Ианг, Кс. & Зханг, КСХ Бацтериопланоидес пацифицум ген. новембар, сп. У новембру се одвојио од морске воде која циркулише у јужном Пацифику. интернационалност. Ј. Систем. еволуција. микроорганизам. 66, 5010–5015 (2016).