En ny typ av gramnegativa, aerobiska, salttoleranta, aktiva, stavformade och rovbakterier ASxL5T isolerades från en kogödseldamm i Nottinghamshire, England, och använde Campylobacter som sitt byte. Därefter upptäcktes andra Campylobacter-arter och medlemmar av familjen Enterobacteriaceae som bytesdjur. Efter subkultur utan värdceller uppnåddes svag aseptisk tillväxt på Brain Heart Infusion Agar. De optimala tillväxtförhållandena är 37 °C och pH är 7. Transmissionselektronmikroskopi avslöjade några mycket ovanliga morfologiska egenskaper relaterade till tillgängligheten av bytesdjur. Fylogenetisk analys med användning av 16S rRNA-gensekvensen indikerade att isolatet är relaterat till en medlem av familjen Marine Spirulina, men kan inte tydligt klassificeras som en medlem av något känt släkte. Helgenomsekvensering av ASxL5T bekräftade förhållandet med medlemmar av de marina spiroketerna. En databassökning visade att flera ASxL5T delar 16S rRNA-gensekvenser med flera oodlade bakterier från havet, landytan och grundvattnet. Vi föreslår att stammen ASxL5T representerar en ny art i ett nytt släkte. Vi rekommenderar namnet Venatorbacter cucullus gen. november, sp. I november användes ASxL5T som typstam.
Rovbakterier är bakterier som uppvisar förmågan att jaga och döda andra levande bakterier för att få biosyntetiska material och energi. Detta skiljer sig från den allmänna återvinningen av näringsämnen från döda mikroorganismer, och det skiljer sig också från parasitiska interaktioner, där bakterier bildar en nära relation med sin värd utan att döda dem. Rovbakterier har utvecklat olika livscykler för att dra fördel av rikliga matkällor i de nischer där de finns (som marina livsmiljöer). De är en taxonomiskt mångfaldig grupp, som bara är sammankopplade genom sin unika steriliseringslivscykel1. Exempel på rovbakterier har hittats i flera olika phyla, inklusive: Proteobacteria, Bacteroides och Chlorella.3. De mest väl studerade rovbakterierna är dock organismerna Bdellovibrio och Bdellovibrio och liknande (BALOs4). Rovbakterier är en lovande källa till nya biologiskt aktiva föreningar och antibakteriella medel5.
Rovbakterier tros förbättra mikrobiell mångfald och ha en positiv inverkan på ekosystemens hälsa, produktivitet och stabilitet6. Trots dessa positiva egenskaper finns det få studier på nya rovbakterier på grund av svårigheten att odla bakterier och behovet av att noggrant observera cellinteraktioner för att förstå deras komplexa livscykler. Denna information är inte lätt att få från datoranalys.
I en tid av ökande antimikrobiell resistens studeras nya strategier för att rikta in sig på bakteriella patogener, såsom användningen av bakteriofager och rovbakterier7,8. ASxL5T-bakterier isolerades 2019 med hjälp av fagisoleringsteknik från kogödsel som samlats in från Dairy Center vid University of Nottingham, Nottinghamshire. Syftet med undersökningen är att isolera organismer med potential som biologiska bekämpningsmedel. Campylobacter hyointestinalis är en zoonotisk patogen som i allt högre grad förknippas med mänskliga tarmsjukdomar10. Det är allestädes närvarande i serum och används som målvärd.
ASxL5T-bakterien isolerades från nötköttsgelé eftersom det observerades att placken den bildade på gräsmattan av C. hyointestinalis liknade de som producerades av bakteriofager. Detta är ett oväntat fynd, eftersom en del av fagisoleringsprocessen involverar filtrering genom ett 0,2 µm filter, som är utformat för att ta bort bakterieceller. Mikroskopisk undersökning av materialet extraherat från placket visade att de små gramnegativa krökta stavformade bakterierna inte ackumulerade polyhydroxibutyrat (PHB). Den aseptiska odlingen oberoende av bytesceller realiseras på rikt fast medium (såsom hjärnhjärtinfusionsagar (BHI) och blodagar (BA)), och dess tillväxt är svag. Det erhålls efter subkultur med kraftig inokulum förbättras. Den växer lika bra under mikroaeroba (7 % v/v syre) och atmosfäriska syreförhållanden, men inte i en anaerob atmosfär. Efter 72 timmar var diametern på kolonin mycket liten och nådde 2 mm, och den var beige, genomskinlig, rund, konvex och glänsande. Standard biokemisk testning försvåras eftersom ASxL5T inte kan odlas på ett tillförlitligt sätt i flytande media, vilket tyder på att det kan förlita sig på den komplexa livscykeln för biofilmbildning. Plattsuspensionen visade dock att ASxL5T är aerobt, positivt för oxidas och katalas och kan tolerera 5 % NaCl. ASxL5T är resistent mot 10 µg streptomycin, men är känsligt för alla andra testade antibiotika. ASxL5T-bakteriecellerna undersöktes med TEM (Figur 1). När de odlas utan bytesceller på BA, är ASxL5T-celler små Campylobacter, med en genomsnittlig längd på 1,63 μm (± 0,4), en bredd på 0,37 μm (± 0,08) och en enda lång (upp till 5 μm) pol. Sexuell flagella. Cirka 1,6 % av cellerna verkar ha en bredd på mindre än 0,2 μm, vilket tillåter passage genom filteranordningen. En ovanlig strukturell förlängning observerades på toppen av vissa celler, liknande en kåpa (latin cucullus) (se pilarna i 1D, E, G). Detta verkar vara sammansatt av överskott av yttre membran, vilket kan bero på den snabba minskningen av storleken på det periplasmatiska höljet, medan det yttre membranet förblir intakt och visar ett "löst" utseende. Att odla ASxL5T i frånvaro av näringsämnen (i PBS) under lång tid vid 4°C resulterade i att de flesta (men inte alla) celler uppvisade en kockmorfologi (Figur 1C). När ASxL5T växer med Campylobacter jejuni som byte i 48 timmar är den genomsnittliga cellstorleken betydligt längre och smalare än celler som odlats utan värd (tabell 1 och figur 1E). Däremot, när ASxL5T växer med E. coli som byte i 48 timmar, är den genomsnittliga cellstorleken längre och bredare än när den växer utan byte (tabell 1), och celllängden är variabel och visar vanligtvis filamentös (Figur 1F). När de inkuberades med Campylobacter jejuni eller E. coli som bytesdjur i 48 timmar visade ASxL5T-celler inga flageller alls. Tabell 1 sammanfattar observationerna av förändringar i cellstorlek baserat på närvaro, frånvaro och bytestyp av ASxL5T.
TEM-visning av ASx5LT: (A) ASx5LT visar lång piska; (B) typiskt ASx5LT-batteri; (C) kocker ASx5LT-celler efter lång inkubation utan näringsämnen; (D) en grupp ASx5LT-celler visar abnormitet (E) ASx5LT-cellgrupp inkuberad med Campylobacter-byte visade ökad celllängd jämfört med de utan bytesväxt (D) visade också apikal struktur; (F) Stora filamentösa flageller, ASx5LT-celler, efter inkubation med E. coli-byte; (G) En enda ASx5LT-cell efter inkubation med E. coli, som visar en ovanlig toppstruktur. Stapeln representerar 1 μm.
Genom att bestämma 16S rRNA-gensekvensen (accessionsnummer MT636545.1) möjliggör databassökningar att etablera sekvenser som liknar de i Gammaproteobacteria-klassen och som ligger närmast marina bakterier i den marina spirillumfamiljen (Figur 2), och är medlemmar av Thalassolituus-släktet Den närmaste släktingen till Marine Bacillus. 16S rRNA-gensekvensen skiljer sig klart från de rovbakterier som tillhör familjen Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria). De parvisa jämförelserna av B. bacteriovorus HD100T (typ stam, DSM 50701) och B. bacteriovorus DM11A var 48,4 % och 47,7 %, och för B. exovorus JSS var det 46,7 %. ASxL5T-bakterier har 3 kopior av 16S rRNA-genen, varav två är identiska med varandra, och den tredje är 3 baser från varandra. Två andra predatoriska bakterieisolat (ASx5S och ASx5O; 16S rRNA-genaccessionsnummer är MT636546.1 respektive MT636547.1) med liknande morfologiska och fenotypiska egenskaper från samma plats är inte desamma, men de skiljer sig från ASxL5T och oodlade Bakterier. databassekvenser är klustrade tillsammans med andra släkten i Oceanospirillaceae (Figur 2). Hela genomsekvensen för ASxL5T har bestämts och sparats i NCBI-databasen, och accessionsnumret är CP046056. Genomet av ASxL5T består av en cirkulär kromosom på 2 831 152 bp med ett G + C-förhållande på 56,1 %. Genomsekvensen innehåller 2653 CDS (totalt), varav 2567 förutsägs koda för proteiner, varav 1596 kan tilldelas som förmodade funktioner (60,2%). Genomet innehåller 67 RNA-kodande gener, inklusive 9 rRNA (3 vardera för 5S, 16S och 23S) och 57 tRNA. De genomiska egenskaperna hos ASxL5T jämfördes med de tillgängliga genomen av stammar av den närmaste relativa typen som identifierats från 16S rRNA-gensekvensen (tabell 2). Använd aminosyraidentitet (AAI) för att jämföra alla tillgängliga Thalassolituus-genom med ASxL5T. Den närmaste tillgängliga (ofullständiga) genomsekvensen som bestäms av AAI är Thalassolituus sp. C2-1 (lägg till NZ_VNIL01000001). Denna stam isolerades från djuphavssedimenten i Mariana Trench, men det finns för närvarande ingen fenotypisk information om denna stam för jämförelse. Jämfört med ASxL5T:s 2,82 Mb är organismens genom större med 4,36 Mb. Den genomsnittliga genomstorleken för marina spiroketer är cirka 4,16 Mb (± 1,1; n = 92 fullständiga referensgenom undersökta från https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), så genomet av ASxL5T är i linje med ordning Jämfört med de andra medlemmarna är den ganska liten. Använd GToTree 1.5.54 för att generera ett genombaserat uppskattat fylogenetiskt träd med maximal sannolikhet (Figur 3A), med hjälp av de justerade och länkade aminosyrasekvenserna av 172 enkelkopiagener specifika för Gammaproteobacteria 11,12,13,14,15,16, 17,18. Analysen visade att det är nära besläktat med Thalassolituus, Bacterial Plane och Marine Bacterium. Dessa data indikerar dock att ASxL5T skiljer sig från sina släktingar i Marine Spirulina och dess genomsekvensdata är tillgänglig.
Det fylogenetiska trädet som använder 16S rRNA-gensekvensen framhäver positionen för ASxL5T-, ASxO5- och ASxS5-stammarna (med tarmen) i förhållande till de oodlade och marina bakteriestammarna i Marine Spirulinaceae. Genbanks anslutningsnummer följer stamnamnet inom parentes. Använd ClustalW för att justera sekvenser och använd metoden för maximal sannolikhet och Tamura-Nei-modellen för att härleda fylogenetiska förhållanden, och utför 1000 guidade replikationer i MEGA X-programmet. Siffran på grenen indikerar att det guidade kopieringsvärdet är större än 50 %. Escherichia coli U/541T användes som en utgrupp.
(A) Ett fylogenetiskt träd baserat på genomet, som visar förhållandet mellan den marina Spirospiraceae-bakterien ASxL5T och dess nära släktingar, E. coli U 5/41T som en utgrupp. (B) Jämfört med T. oleivorans MIL-1T, förutsägs den funktionella kategorifördelningen av gener baserat på den ortologa gruppen (COG)-klustret av ASx5LT-protein. Figuren till vänster visar antalet gener i varje funktionell COG-kategori i varje genom. Grafen till höger visar procentandelen genom som finns i varje funktionell COG-grupp. (C) Jämfört med T. oleiverans MIL-1T, analysen av den kompletta KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) modulära vägen för ASxL5T.
Att använda KEGG-databasen för att undersöka komponentgener som finns i ASxL5T-genomet avslöjade den typiska metaboliska vägen för aerob gamma Proteus. ASxL5T innehåller totalt 75 gener tilldelade bakteriella motorproteiner, inklusive gener involverade i kemotaxi, flagellamontering och typ IV fimbriae-system. I den sista kategorin är 9 av 10 gener ansvariga för ryckningar hos en rad andra organismer. Genomet av ASxL5T innehåller en komplett biosyntesväg för tetrahydropyrimidin som deltar i det skyddande svaret på osmotisk stress20, som förväntat för halofiler. Genomet innehåller också många kompletta vägar för kofaktorer och vitaminer, inklusive riboflavinsyntesvägar. Även om genen för alkan 1-monooxygenas (alkB2) finns i ASxL5T, är kolväteanvändningsvägen inte komplett. I genomsekvensen av ASxL5T är homologer av gener identifierade som huvudsakligen ansvariga för nedbrytningen av kolväten i T. oleiverans MIL-1T21, såsom TOL_2658 (alkB) och TOL_2772 (alkoholdehydrogenas), uppenbarligen frånvarande. Figur 3B visar jämförelsen av gendistribution i COG-kategorin mellan ASxL5T och Olivolja MIL-1T. Sammantaget innehåller det mindre ASxL5T-genomet proportionellt färre gener från varje COG-kategori jämfört med det större relaterade genomet. När antalet gener i varje funktionell kategori uttrycks som en procentandel av genomet noteras skillnader i procentandelen gener i kategorierna translation, ribosomstruktur och biogenes, och kategorierna energiproduktion och omvandlingsfunktioner, som utgör den större ASxL5T genom Procentandelen jämförs med samma grupp som finns i T. oleiverans MIL-1T-genom. Jämfört med ASxL5T-genomet har T. oleivorans MIL-1T däremot en högre procentandel gener i kategorierna replikering, rekombination och reparation samt transkription. Intressant nog är den största skillnaden i innehållet i varje funktionell kategori av de två genomen antalet okända gener som finns i ASxL5T (Figur 3B). En anrikningsanalys av KEGG-moduler utfördes, där varje KEGG-modul representerar en uppsättning manuellt definierade funktionella enheter för anteckning och biologisk tolkning av genomsekvensdata. Jämförelsen av gendistribution i den kompletta KOG-modulvägen för ASxL5T och oliv MIL-1T visas i figur 3C. Denna analys visar att även om ASxL5T har en fullständig metabolisk väg för svavel och kväve, så har inte T. oleiverans MIL-1T det. Däremot har T. oleiverans MIL-1T en fullständig metabolisk väg för cystein och metionin, men den är ofullständig i ASxL5T. Därför har ASxL5T en karakteristisk modul för sulfatassimilering (definierad som en uppsättning gener som kan användas som fenotypiska markörer, såsom metabolisk kapacitet eller patogenicitet; https://www.genome.jp/kegg/module.html) I T oleiverans MIL-1T. Att jämföra geninnehållet i ASxL5T med listan över gener som tyder på en rovlivsstil är inte avgörande. Även om waaL-genen som kodar för ligas associerad med O-antigenpolysackariden till kärnan finns i ASxL5T-genomet (men den är vanlig i många gramnegativa bakterier), kan tryptofan 2,3-dioxygenas (TDO) gener inkludera 60 aminos sura regioner som vanligtvis finns i rovbakterier som inte är närvarande. Det finns inga andra predatoriska karakteristiska gener i ASxL5T-genomet, inklusive de som kodar för enzymer involverade i isoprenoidbiosyntes i mevalonatvägen. Observera att det inte finns någon transkriptionell regulatorisk gen gntR i den undersökta rovdjursgruppen, men tre gntR-liknande gener kan identifieras i ASxL5T.
De fenotypiska egenskaperna hos ASxL5T sammanfattas i tabell 3 och jämförs med de fenotypiska egenskaperna för besläktade släkten 23, 24, 25, 26 och 27 som rapporterats i litteraturen. Isolat från T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis och Oceanobacter kriegii är aktiva, salttoleranta, oxidaspositiva stavformade kroppar, men har nästan inga andra fenotypiska egenskaper med ASxL5T. Havets genomsnittliga pH är 8,1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77), vilket återspeglas i T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis och O. kriegii. ASxL5T är lämplig för det större pH-intervallet (4-9) som är typiskt för icke-marina arter. Fenotypiska egenskaper hos Thalassolituus sp. C2-1. Okänd. Tillväxttemperaturintervallet för ASxL5T är i allmänhet bredare än för marina stammar (4–42 °C), även om vissa men inte alla T. marinus-isolat är värmetoleranta. Oförmågan att odla ASxL5T i buljongmedia förhindrade ytterligare fenotypisk karakterisering. Använd API 20E för att testa materialen som skrapats från BA-plattan, ONPG, arginindihydrolas, lysindekarboxylas, ornitindekarboxylas, citratanvändning, ureas, tryptofan deaminas, gelatinhydrolysenzym, testresultaten var alla negativa, men ingen indol, acetoin och H2S producerades. Ofermenterade kolhydrater inkluderar: glukos, mannos, inositol, sorbitol, ramnos, sackaros, melibios, amygdalin och arabinos. Jämfört med de publicerade relaterade referensstammarna visas den cellulära fettsyraprofilen för ASxL5T-stammen i tabell 4. De huvudsakliga cellulära fettsyrorna är C16:1ω6c och/eller C16:1ω7c, C16:0 och C18:1ω9. Hydroxifettsyrorna C12:0 3-OH och C10:0 3-OH finns också. Förhållandet C16:0 i ASxL5T är högre än det rapporterade värdet för relaterade släkten. Jämfört med den rapporterade T. marinus IMCC1826TT, är förhållandet mellan C18:1ω7c och/eller C18:1ω6c i ASxL5T däremot reducerat. oleivorans MIL-1T och O. kriegii DSM 6294T, men inte upptäckt i B. sanyensis KCTC 32220T. Att jämföra fettsyraprofilerna för ASxL5T och ASxLS avslöjade subtila skillnader i mängden individuella fettsyror mellan de två stammarna, vilket är förenligt med den genomiska DNA-sekvensen för samma art. Inga poly-3-hydroxibutyrat (PHB)-partiklar detekterades med Sudan Black-testet.
Predationsaktiviteten hos ASxL5T-bakterier studerades för att bestämma bytesområdet. Denna bakterie kan bilda plack på Campylobacter-arter, inklusive: Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T; Escherichia coli NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; C lari NCTC 11458 och C. upsaliensis NCTC 11541T. Använd de kulturer som anges i avsnittet för bestämning av värdintervall i metoden för att testa ett bredare utbud av gramnegativa och grampositiva bakterier. Resultaten visar att ASxL5T även kan användas i Escherichia coli NCTC 86 och Citrobacter freundii NCTC 9750T. Plack bildade på Klebsiella oxytoca 11466. TEM-interaktionen med E. coli NCTC 86 visas i figur 4A-D, och interaktionen med Campylobacter jejuni PT14 och Campylobacter suis S12 visas i figur 4E-H mitten. Attackmekanismen verkar vara olika mellan de testade bytestyperna, med en eller flera E. coli-celler fästa vid varje ASxL5T-cell och placerade i sidled längs den utsträckta cellen före adsorption. Däremot verkar ASxL5T fästa till Campylobacter genom en enda kontaktpunkt, vanligtvis i kontakt med spetsen av predatorcellen och nära spetsen av Campylobacter-cellen (Figur 4H).
TEM som visar interaktionen mellan ASx5LT och bytesdjur: (AD) och E. coli byte; (EH) och C. jejuni byte. (A) En typisk ASx5LT-cell kopplad till en enda E. coli (EC)-cell; (B) En filamentös ASx5LT fäst till en enda EC-cell; (C) En filamentös ASx5LT-cell kopplad till flera EC-celler; (D) Fastsättning av mindre ASx5LT-celler på en enda E. coli (EC)-cell; (E) en enda ASx5LT-cell kopplad till en Campylobacter jejuni (CJ)-cell; (F) ASx5LT angriper C. hyointestinalis (CH)-celler; (G) två En ASx5LT-cell attackerade en CJ-cell; (H) En närbild av ASx5LT-fästpunkten, nära spetsen av CJ-cellen (bar 0,2 μm). Stapeln representerar 1 μm i (A–G).
Rovbakterier har utvecklats för att dra fördel av rikliga byteskällor. Uppenbarligen är de allmänt närvarande i många olika miljöer. På grund av den smala storleken på populationsmedlemmarna är det möjligt att isolera ASxL5T-bakterier från slammet med hjälp av fagseparationsmetoden. Den genomiska relevansen av ASxL5T för medlemmar av oceanospirillaceae-familjen av marina bakterier är överraskande, även om organismen är salttolerant och kan växa på ett medium som innehåller 5 % salt. Vattenkvalitetsanalys av slurryn visade att natriumkloridhalten var mindre än 0,1 %. Därför är lera långt borta från den marina miljön - både geografiskt och kemiskt. Närvaron av tre relaterade men olika isolat från samma källa ger bevis på att dessa rovdjur frodas i denna icke-marina miljö. Dessutom visade mikrobiomanalys (datafiler tillgängliga från https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990) att samma 16S rRNA-gensekvens finns i de 50 mest förekommande operationella taxa (OTU) ) I några få provtagningsintervaller av leran. Flera oodlade bakterier hittades i Genbank-databasen, som har 16S rRNA-gensekvenser som liknar ASxL5T-bakterier. Dessa sekvenser, tillsammans med sekvenserna för ASxL5T, ASxS5 och ASxO5, verkar representera olika klader separerade från Thalassolituus och Oceanobacter (Figur 2). Tre sorters oodlade bakterier (GQ921362, GQ921357 och GQ921396) isolerades från sprickvattnet på ett djup av 1,3 kilometer i den sydafrikanska guldgruvan 2009, och de andra två (DQ256320 och DQ337006 var också från grundvatten) år 2005). 16S rRNA-gensekvensen som är närmast besläktad med ASxL5T är en del av 16S rRNA-gensekvensen erhållen från anrikningskulturen av sandiga sediment erhållen från stränderna i norra Frankrike 2006 (accessionsnummer AM29240828). En annan närbesläktad 16S rRNA-gensekvens från den oodlade bakterien HQ183822.1 erhölls från en uppsamlingstank som lakades ut från en kommunal deponi i Kina. Uppenbarligen är ASxL5T-bakterier inte särskilt representativa i taxonomiska databaser, men dessa sekvenser från oodlade bakterier representerar sannolikt organismer som liknar ASxL5T, som är distribuerade över hela världen, vanligtvis i utmanande miljöer. Från den fylogenetiska analysen av hela genomet är den närmaste släktingen till ASxL5T Thalassolituus sp. C2-1, T. marinus, T. oleivorans. Och O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus är en medlem av marina obligate kolvätefragmenteringsbakterier (OHCB), som är utbredd i marina och terrestra miljöer och vanligtvis blir den dominerande efter kolväteföroreningsincidenter30,31. Marina bakterier är inte medlemmar i OHCB-gruppen, utan är isolerade från den marina miljön.
Fenotypiska data indikerar att ASxL5T är en ny art och en medlem av ett tidigare okänt släkte i familjen marina spirospiraceae. Det finns för närvarande ingen tydlig standard för att klassificera nyligen isolerade stammar i ett nytt släkte. Försök har gjorts att fastställa universella släktgränser, till exempel, baserat på procentandelen av genomet av ett konservativt protein (POCP), rekommenderas att gränsvärdet är 50 % identiskt med referensstammen33. Andra föreslår att man använder AAI-värden, som har fördelar jämfört med POCP eftersom de kan erhållas från ofullständiga genom34. Författaren tror att om AAI-värdet är mindre än 74 % jämfört med modellstammen för modellarten, är stammen en representant för ett annat släkte. Modellsläktet i marina spirillaceae är marina spirillum, och modellstammen är O. linum ATCC 11336T. AAI-värdet mellan ASxL5T och O. linum ATCC 11336T är 54,34 %, och AAI-värdet mellan ASxL5T och T. oleivorans MIL-1T (stammar av släkttyp) är 67,61 %, vilket indikerar att ASxL5T representerar ett nytt släkte som skiljer sig från Thalassolituus. Genom att använda 16S rRNA-gensekvensen som klassificeringsstandard är den föreslagna genusavgränsningsgränsen 94,5 %35. ASxL5T kan placeras i Thalassolituus-släktet och visar 95,03 % 16S rRNA-sekvensidentitet med T. oleivorans MIL-1T och 96,17 %. marinus IMCC1826T. Den kommer dock också att placeras i släktet Bacteroides som har 94,64 % 16S rRNA-genidentitet med B. sanyensis NV9, vilket indikerar att användningen av en enda gen såsom 16S rRNA-genen kan leda till godtycklig klassificering och tilldelning. En annan föreslagen metod använder ANI och Genome Alignment Score (AF) för att undersöka klustringen av datapunkter från alla typer och icke-typstammar av befintliga släkten. Författaren rekommenderar att man kombinerar släktets gräns med böjningspunkten för det uppskattade släktet som är specifikt för den taxa som analyseras. Men om det inte finns tillräckligt med kompletta genomsekvenser från Thalassolituus-isolat är det omöjligt att avgöra om ASxL5T tillhör Thalassolituus-släktet med denna metod. På grund av den begränsade tillgängligheten av kompletta genomsekvenser för analys bör hela genomets fylogenetiska träd tolkas med försiktighet. För det andra kan jämförelsemetoder för hela genom inte ta hänsyn till väsentliga skillnader i storleken på de jämförda genomen. De mätte likheten mellan bevarade kärn-enkopiagener mellan besläktade släkten, men tog inte hänsyn till det stora antalet gener som inte finns i det mycket mindre genomet av ASxL5T. Uppenbarligen har ASxL5T och grupper inklusive Thalassolituus, Oceanobacter och Bacterioplanes en gemensam förfader, men evolutionen har tagit en annan väg, vilket leder till en minskning av genomet, vilket kan vara att anpassa sig till en rovlivsstil. Detta i motsats till T. oleivorans MIL-1T, som är 28 % större och har utvecklats under olika miljötryck för att utnyttja kolväten23,30. En intressant jämförelse kan göras med obligata intracellulära parasiter och symbionter, såsom Rickettsia, Chlamydia och Buchnera. Deras genomstorlek är cirka 1 Mb. Förmågan att använda värdcellsmetaboliter leder till genförlust, så genomgick betydande evolutionär genomisk nedbrytning. Evolutionära förändringar från marina kemiska näringsorganismer till rovdjurslivsstilar kan resultera i en liknande minskning av genomstorleken. COG- och KEGG-analysen belyser antalet gener som används för specifika funktioner och de globala skillnaderna i de genomiska vägarna mellan ASxL5T och T. oleivorans MIL-1T, som inte beror på den utbredda tillgängligheten av mobila genetiska element. Skillnaden i G + C-förhållandet för hela genomet hos ASxL5T är 56,1 % och för T. oleivorans MIL-1T är 46,6 %, vilket också indikerar att det är segregerat.
Undersökning av det kodande innehållet i ASxL5T-genomet ger funktionella insikter om fenotypiska egenskaper. Närvaron av gener som kodar för typ IV fimbriae (Tfp) är av särskilt intresse eftersom de främjar cellrörelser, som kallas social glidning eller kramper, utan flageller på ytan. Enligt rapporter har Tfp andra funktioner, inklusive predation, patogenes, biofilmbildning, naturligt DNA-upptag, automatisk cellaggregation och utveckling38. ASxL5T-genomet innehåller 18 gener som kodar för diguanylatcyklas (ett enzym som katalyserar omvandlingen av 2 guanosintrifosfat till guanosin 2-fosfat och cykliskt diGMP) och 6 gener som kodar för motsvarande diguanylatcyklasfosfatdiguanylat. Genen för esteras (katalyserar nedbrytningen av cykliskt di-GMP till guanosinmonofosfat) är intressant eftersom cykl-di-GMP är en viktig andra budbärare involverad i biofilmutveckling och separation, rörelse, cellvidhäftning och virulens 39, 40 i processen. Det bör också noteras att i Bdellovibrio bacteriovorus har cyklisk dubbel GMP visats kontrollera övergången mellan fritt liv och rovlivsstil41.
Mest forskning om rovbakterier har fokuserat på Bdellovibrio, Bdellovibrio-liknande organismer och Myxococcus-arter. Dessa och andra kända exempel på rovbakterier bildar en mångfaldig grupp. Trots denna mångfald har en uppsättning karakteristiska proteinfamiljer som återspeglar fenotyperna hos 11 kända rovbakterier identifierats3,22. Endast gener som kodar för O-antigenligas (waaL) har dock identifierats, vilket är särskilt vanligt hos gramnegativa bakterier. Denna form av analys är inte till hjälp för att utse ASxL5T som ett rovdjur, förmodligen för att den använder en ny attackstrategi. Tillgången till mer olika rovbakteriella genom kommer att bidra till att utveckla finare upplösningsanalyser som tar hänsyn till bevis på funktionella och miljömässiga skillnader mellan gruppmedlemmarna. Exempel på rovbakterier som inte ingår i denna analys inkluderar medlemmar av Cupriavidus necator42 och Bradymonabacteria43, eftersom forskare undersöker olika mikrobiella samhällen, etableras fler rovdjur.
Den mest anmärkningsvärda egenskapen hos ASxL5T-bakterier som fångas av TEM-bild är dess unika och flexibla morfologi, som kan främja interaktion med bytesbakterier. Typen av interaktion som observeras skiljer sig från andra rovbakterier och har inte tidigare upptäckts eller rapporterats. Den föreslagna rovdjurscykeln för ASxL5T visas i figur 5. Det finns få exempel i litteraturen med liknande apikala strukturer som vi rapporterar här, men dessa exempel inkluderar Terasakiispira papahanaumokuakeensis, en marin spirillum-bakterie med enstaka spetsförstoring 44, och Alphaproteobacteria, Terasakiella pusilla , som tidigare tillhörde släktet Oceanospirillum, uppvisar den så kallade "polära filmen" 45. Kocciformer observeras ofta i äldre kulturer, särskilt för bakterier med krökta former, såsom Vibrio, Campylobacter och Helicobacter 46, 47, 48, som kan representera ett nedbrutet tillstånd. Ytterligare arbete behövs för att klargöra den exakta livscykeln för ASxL5T-bakterier. För att bestämma hur det fångar och byter, och om dess genom kodar för biologiskt aktiva föreningar som kan användas för medicinska eller biotekniska ändamål.
Beskrivning av Venatorbacter allm. November Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. är sammansatt av venatorer från L. n. venator,'hunter' och Gr. n. bacter,'en rod'. Venatorbacter,'en hunting Rod' Celler är aeroba, salttoleranta, krökta gramfärgningsnegativa, motionsstavar och oxidasaktiviteten ackumuleras inte. I temperaturintervallet 4 till 42 °C Inåtväxande pH-intervallet 4-9 är ovanligt Hos marina sniglar är de flesta intoleranta för surt pH. 0 och C18:1ω9; C12:0 3-OH och C10:0 3-OH återfinns som hydroxifett syror De växer inte i buljongmedia. DNA G + C-innehållet är 56,1 mol%. .
Beskrivning av Venatorbacter cucullus sp. November Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus betyder kåpa).
Dessutom är den beskrivande egenskapen hos detta släkte att när de odlas på BA eller BHI är cellerna 1,63 µm långa och 0,37 µm breda. Kolonierna på BHI-agar är mycket små och når 2 mm i diameter efter 72 timmar. De är beige, genomskinliga, runda, konvexa och glänsande. Medlemmarna av denna art kan använda Escherichia coli och Klebsiella. Campylobacter och flera andra gramnegativa bakterier fungerar som bytesdjur.
Den typiska stammen ASxL5T isolerades från köttmjölk i Nottinghamshire, Storbritannien, och deponerades i National Type Culture Collection (UK): accessionsnummer NCTC 14397 och Netherlands Bacterial Culture Collection (NCCB) accessionsnummer NCCB 100775. Den fullständiga genomsekvensen av ASxL5T har deponerats i Genbank enligt tillägget av CP046056.
ASxL5T-bakterier isolerades från köttmjölk med hjälp av fagisoleringsteknik9,49. Uppslamningen späddes 1:9 (vikt/volym) i SM-buffert (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,1 M NaCl, 8 mM MgSO4.7H2O och 0,01 % gelatin; Sigma Aldrich, Gillingham, Storbritannien), inkubera sedan vid 4°C under 24 timmar, roterande långsamt för att eluera rovdjuren i bufferten. Suspensionen centrifugerades vid 3000 g under 3 minuter. Supernatanten uppsamlades och centrifugerades vid 13 000 g en andra gång under 5 minuter. Supernatanten passerades sedan genom ett 0,45 µm membranfilter (Minisart; Sartorius, Göttingen, Tyskland) och ett 0,2 µm membranfilter (Minisart) för att avlägsna eventuella kvarvarande bakterieceller. ASxL5T kan passera dessa filter. En mjuk agarmatta av Campylobacter enterosus S12 (NCBI accessionsnummer CP040464) från samma uppslamning framställdes med användning av standardtekniker. Den filtrerade uppslamningen fördelades på var och en av dessa värdcellsplattor i 10 ul droppar i tre exemplar och fick torka. Plattan inkuberades i en mikroaerofil tank vid 37°C under 48 timmar under mikroaeroba förhållanden (5% O2, 5% H2, 10% CO2 och 80% N2). Det erhållna synliga placket extraherades i SM-buffert och överfördes till den färska gräsmattan av C. hyointestinalis S12 för att ytterligare föröka de lyserade organismerna. När det väl har fastställts att bakterierna är orsaken till det lytiska placket och inte fagen, försök att odla organismen oberoende av värden och ytterligare karakterisera den. Den aeroba odlingen utfördes vid 37 °C med 5 % v/v defibrinerat hästblod (TCS Biosciences Lt, Buckingham, Storbritannien, tillägg). Enligt riktlinjerna från National Clinical Standards Committee används diskdiffusionsmetoden för antibakteriell känslighetstestning. BHI-agar odlades vid 37°C med användning av en skiva innehållande följande antibiotika (Oxoid) för aerob odling: amoxicillin och klavulansyra 30 µg; cefotaxim 30 ug; streptomycin 10 ug; ciprofloxacin 5 µg; Ceftazidim 30 µg Nalidixinsyra 30 µg; Imipenem 10 µg; Azitromycin 15 µg; Kloramfenikol 30 µg; Cefoxitin 30 µg; tetracyklin 30 ug; nitrofurantoin 300 µg; Aztreonam 30 µg; Ampicillin 10 ug; Cefpodoxim 10 ug; Trimetoprim-sulfametoxazol 25 µg. Salttoleransen fastställdes genom aerob inkubation på BHI-agarplattor vid 37 °C. Ytterligare NaCl tillsattes till BHI-agarplattorna för att ge ett koncentrationsområde på upp till 10 % vikt/volym. pH-intervallet bestäms av aerob odling på BHI-agarplattor vid 37°C, där pH-intervallet har justerats till mellan 4 och 9 med steril HCl eller steril NaOH, och mål-pH-värdet verifieras innan plattan hälls upp. För cellulär fettsyraanalys odlades ASxL5T på BHI-agar i 3 dagar och aerob vid 37 °C. Enligt MIDI (Sherlock Microbial Identification System, version 6.10) standardprotokoll från FERA Science Ltd, (York, Storbritannien), extraherades, preparerades och analyserades cellfettsyror.
För TEM odlades ASxL5T aerobt genom att sprida jämnt på BA vid 37°C under 24 timmar och skördades sedan i 1 ml 3% (v/v) glutaraldehyd i 0,1 M kakodylatbuffert vid rumstemperatur Fixa i 1 timme, sedan centrifugera vid 10 000 g i 3 minuter. Resuspendera sedan försiktigt pelleten i 600 μl 0,1 M kakodylatbuffert. Överför den fixerade ASxL5T-suspensionen till Formvar/kolfilmen på ett 200 mesh koppargaller. Bakterierna färgades med 0,5 % (vikt/volym) uranylacetat under 1 minut och undersöktes med TEM med användning av ett TEI Tecnai G2 12 Biotwin-mikroskop. Som nämnts ovan, kombinera samma antal bytesdjur och rovdjur i NZCYM-buljong (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) och inkubera i 48 timmar under mikroaeroba förhållanden av Campylobacter eller Campylobacter vid 37°C, Interaktionen mellan rovdjur och byte undersöktes också av TEM. Aeroba förhållanden för Escherichia coli. Undersök självständigt bytesdjur och rovbakterier för att fastställa eventuella förändringar i cellmorfologi på grund av predation. Sudan black-metoden användes för optisk mikroskopi av PHB-ackumulering.
Odla ASxL5T-kulturer över natten genom att smeta ut tillväxt på BHI- eller BA-plattor med en steril pinne. Samla ASxL5T-celler och suspendera dem i MRD (CM0733, Oxoid), och placera dem sedan vid 4°C i 7 dagar för att svälta cellerna. NCTC-referens- eller laboratoriebakteriekulturen inokulerades i BHI-buljong eller nr 2-näringsbuljong (CM007, Oxoid), inkuberades över natten, centrifugerades vid 13 000 g och återsuspenderades i MRD tills OD600 var 0,4. Kultur: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, Klebsiella 4oxyto6, LeNCiella 4oxyto6, LeNCiella 14oxyto6 10817, Listeria Special bacteria NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, Rhodococcus ubåthamburgare NCTC 1621T, Salmonella intestinage 7 NCTC Mon7ville NCTC 10861, Staphylococcus aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. Campylobacter-värden inkuberades mikroaerobt på BA-plattor vid 37°C NZ och CYM suspenderad. De testade Campylobacter-värdarna är: C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11458, C.i lari NCTC 11458, C.i lari je PT14, C... Samla celler i MRD, centrifugera vid 13 000 g och återsuspendera i MRD tills OD600 är 0,4. Tillsätt en alikvot av 0,5 ml suspension till 5 ml smält NZCYM toppagar (0,6 % agar) och häll den på en 1,2 % NZCYM bottenplatta. Efter härdning och torkning fördelades den serieutspädda ASxL5T som 20 µl droppar på varje gräsmatta i tre exemplar. Odlingstemperaturen och atmosfären beror på testbakteriernas krav.
Använd GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma Aldridge) för att förbereda DNA från bakterieisolat. Standardmetoder användes för PCR-amplifiering av 16S rRNA-genen och produktsekvensbestämning med användning av färgämnestermineringskemi (Eurofins Value Read Service, Tyskland). Använd BLAST-N-programmet för att jämföra dessa sekvenser med andra 16S rRNA-gensekvenser för att identifiera och samla in närbesläktade arter. Dessa är justerade med ClustalW i MEGA X-programmet. Det fylogenetiska trädet rekonstruerades med MEGA X med maximal sannolikhetsmetoden baserad på Tamura-Nei-modellen, med 1000 guidade kopior54. Använd PureLink™ Genomic DNA Kit (Fisher Scientific, Loughborough, Storbritannien) för att extrahera DNA för helgenomsekvensering. Genomsekvensen för ASxL5T bestämdes med hjälp av Illumina MiSeq-kombinationen, som består av 250 bp dubbeländade läsningar bestående av ett bibliotek framställt med hjälp av Nextera-märkningssatsen och 2 till 20 kb långa läsningar från PacBio-plattformen. Genomics DNA Sequencing Research Facility vid Sembia University. Genomet sammansattes med användning av CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen, Aarhus, Danmark). ASxL5T-kulturer deponeras i National Type Culture Collection (UK) och Netherlands Bacterial Culture Collection (NCCB). Genomen för besläktade organismer som används för jämförelse är: Thalassolituus oleivorans MIL-1T (accessionsnummer HF680312, komplett); Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (accessionsnummer BMYY01000001, ofullständig); Oceanobacter kriegii DSM 6294T (accessionsnummer NZ_AUGV00000000, ofullständig); Marinamonas community DSM 5604T (tillagd ASM436330v1, ofullständig), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (tillagd MTSD02000001, ofullständig) och Thalassolituus sp. C2-1 (lägg till NZ_VNIL01000001, ofullständig). Använd JGI Genome Portal36 på https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page= för att bestämma anpassningspoäng (AF) och genomsnittlig nukleinsyraidentitet (ANI). Parvis. Metoden enligt Rodriguez-R & Konstantinidis55 användes för att bestämma aminosyraidentitet (AAI). Använd GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 för att generera ett uppskattat fylogenetiskt träd med maximal sannolikhet. Ingångsgenomet som representerar det tillgängliga referensgenomet väljs från referenssläkten identifierade som relaterade till ASxL5T från 16S rRNA-fylogenin. Kommenterade trädet med hjälp av det interaktiva livets träd onlineverktyg (https://itol.embl.de/). Den funktionella anteckningen och analysen av ASxL5T-genomet utförs med hjälp av BlastKOALA KEGG-onlineverktyget med hjälp av KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) modulberikningsdistribution. Fördelningen av COG-kategorier (ortologa grupper) bestäms med hjälp av onlineverktyget eggNOG-mapper.
Pérez, J., Moraleda-Muñoz, A., Marcos-Torres, FJ och Muñoz-Dorado, J. Bakteriell predation: 75 år och det fortsätter! . miljö. mikroorganism. 18, 766–779 (2016).
Linares-Otoya, L. etc. Mångfald och antibakteriell potential hos rovbakterier på den peruanska kusten. Mars droger. 15. E308. https://doi.org/10.3390/md15100308 (2017).
Pasternak, Z. et al. Genom deras gener kommer du att förstå dem: de genomiska egenskaperna hos rovbakterier. ISME J. 7, 756–769 (2013).
Sockett, RE Den rovdjurslivsstil som bakteriofagen Bdellovibrio har. installera. Pastormikrober. 63, 523–539 (2009).
Korp, J., Vela Gurovic, MS & Nett, M. Antibiotika från rovbakterier. Beilstein J. Histochemistry 12, 594–607 (2016).
Johnke, J., Fraune, S., Bosch, TCG, Hentschel, U. & Schulenburg, H. Bdellovibrio och liknande organismer är prediktorer för mikrobiomdiversitet i olika värdpopulationer. mikroorganism. Ekologi. 79, 252–257 (2020).
Vila, J., Moreno-Morales, J. och Ballesté-Delpierre, C. Upptäck den aktuella statusen för nya antibakteriella medel. klinisk. mikroorganism. Infektera. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2019.09.015 (2019).
Hobley, L. et al. Den dubbla predationen av fag och fag kan utrota E. coli-byten utan en enda predation. J. Bakterier. 202, e00629-19. https://doi.org/10.1128/JB.00629-19 (2020).
El-Shibiny, A., Connerton, PL & Connerton, IF Antalet och mångfalden av Campylobacter och bakteriofager som isolerats under utfodringscykeln för frigående och ekologiska kycklingar. Applikationsmiljö. mikroorganism. 71, 1259–1266 (2005).
Wilkinson, DA etc. Uppdatera den genomiska taxonomin och epidemiologin för Campylobacter-svin. vetenskap. Representant 8, 2393. https://doi.org/10.1038/s41598-018-20889-x (2018).
Lee, MD GToTree: Användarvänligt arbetsflöde för systemgenomik. Bioinformatics 35, 4162–4164 (2019).
Edgar, RC MUSCLE: En multipelsekvensjusteringsmetod som reducerar tid och rumskomplexitet. BMC biologisk information. 5, 113 (2004).
Capella-Gutiérrez, S., Silla-Martínez, JM & Gabaldón, T. TrimAl: Ett verktyg för automatisk justering och trimning i storskalig fylogenetisk analys. Bioinformatics 25, 1972–1973 (2009).
Hyatt, D., LoCascio, PF, Hauser, LJ & Uberbacher, EC-gen och metagenomisk sekvensöversättningsstart förutsägelse. Bioinformatics 28, 2223-2230 (2012).
Shen, W. & Xiong, J. TaxonKit: Plattformsöverskridande och effektiv NCBI-klassificeringsverktygssats. Bio Rxiv. (Nådd den 1 juni 2021); https://www.biorxiv.org/content/10.1101/513523v1 (2019).
Pris, MN, Dehal, PS & Arkin, AP FastTree 2-ungefärligt maximalt sannolikhetsträd med stor uppriktning. PLoS One 5, e9490 (2010).
Tange, O. GNU Parallell. (Nådd den 1 juni 2021); https://zenodo.org/record/1146014#.YOHaiJhKiUk (2018).
Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Nukleinsyraforskning. 28, 27-30 (2000).
Tjeckien, L. etc. Rollen av extremolyter ektoin och hydroxiektoin som stressskyddare och näringsämnen: genetik, systemgenomik, biokemi och strukturanalys. Gene (Basel). 9. E177. https://doi.org/10.3390/genes9040177 (2018).
Gregson, BH, Metodieva, G., Metodiev, MV, Golyshin, PN & McKew, BA Differentiellt proteinuttryck under tillväxten av den obligatoriska marina kolvätenedbrytande bakterien Thalassolituus oleivorans MIL-1 under tillväxten av medel- och långkedjiga alkaner. främre. mikroorganism. 9, 3130 (2018).
Pasternak, Z., Ben Sasson, T., Cohen, Y., Segev, E. och Jurkevitch, E. En ny jämförande genomikmetod för att definiera fenotypspecifika indikatorer avslöjar specifik arv i rovbakterier. Public Science Library One. 10. e0142933. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142933 (2015).
Yakimov, MM, etc. Thalassolituus oleivorans gen. november, sp. nov., en ny typ av marina bakterier som är specialiserade på användning av kolväten. internationalitet. J. System. evolution. mikroorganism. 54, 141–148 (2004).
Wang, Y., Yu, M., Liu, Y., Yang, X. & Zhang, XH. Bacterioplanoides pacificum gen. november, sp. I november separerade den sig från havsvattnet som cirkulerade i södra Stilla havet. internationalitet. J. System. evolution. mikroorganism. 66, 5010–5015 (2016).