Новий тип грамнегативних, аеробних, солестійких, активних, паличкоподібних і хижих бактерій ASxL5T був виділений із ставка коров’ячого гною в Ноттінгемширі, Англія, і використовував Campylobacter як свою здобич. Згодом інші види Campylobacter і члени родини Enterobacteriaceae були виявлені як здобич. Після субкультури без клітин-господарів було досягнуто слабке асептичне зростання на мозково-серцевому агарі. Оптимальними умовами росту є 37 °C і рН 7. Просвічуюча електронна мікроскопія виявила деякі дуже незвичайні морфологічні особливості, пов’язані з доступністю здобичі. Філогенетичний аналіз із застосуванням послідовності гена 16S рРНК показав, що ізолят пов’язаний із членом родини морських спірулін, але не може бути чітко класифікований як представник будь-якого відомого роду. Секвенування повного генома ASxL5T підтвердило спорідненість з представниками морських спірохет. Пошук у базі даних виявив, що кілька ASxL5T мають спільні послідовності генів 16S рРНК з кількома некультивованими бактеріями з океану, поверхні суші та підземних вод. Ми припускаємо, що штам ASxL5T представляє новий вид у новому роду. Ми рекомендуємо назву Venatorbacter cucullus gen. Листопад, зр. У листопаді як типовий штам був використаний ASxL5T.
Хижі бактерії - це бактерії, які виявляють здатність вистежувати та вбивати інші живі бактерії для отримання біосинтетичних матеріалів та енергії. Це відрізняється від загального відновлення поживних речовин із мертвих мікроорганізмів, а також від паразитичних взаємодій, під час яких бактерії встановлюють тісний зв’язок зі своїм господарем, не вбиваючи їх. Хижі бактерії розвинули різні життєві цикли, щоб скористатися багатими джерелами їжі в нішах, де вони знаходяться (наприклад, морські середовища існування). Це таксономічно різноманітна група, яку об’єднує лише унікальний життєвий цикл стерилізації1. Приклади хижих бактерій були знайдені в кількох різних типах, включаючи: Proteobacteria, Bacteroides і Chlorella.3. Однак найбільш добре вивченими хижими бактеріями є Bdellovibrio і Bdellovibrio і подібні організми (BALOs4). Хижі бактерії є перспективним джерелом нових біологічно активних сполук і антибактеріальних засобів5.
Вважається, що хижі бактерії збільшують мікробну різноманітність і позитивно впливають на здоров’я, продуктивність і стабільність екосистем6. Незважаючи на ці позитивні властивості, існує небагато досліджень нових хижих бактерій через складність культивування бактерій і необхідність уважно спостерігати за взаємодією клітин, щоб зрозуміти їхній складний життєвий цикл. Цю інформацію нелегко отримати за допомогою комп’ютерного аналізу.
В епоху зростання резистентності до антимікробних засобів вивчаються нові стратегії боротьби з бактеріальними патогенами, такі як використання бактеріофагів і хижих бактерій7,8. Бактерії ASxL5T були виділені в 2019 році за допомогою технології виділення фагів із коров’ячого гною, зібраного в Центрі молочних продуктів Ноттінгемського університету, графство Ноттінгемшир. Метою дослідження є виділення організмів, потенційних агентів біологічного контролю. Campylobacter hyointestinalis є зоонозним патогеном, який все частіше асоціюється з кишковими захворюваннями людини10. Він всюдисущий у сироватці крові та використовується як цільовий господар.
Бактерія ASxL5T була виділена з яловичого желе, оскільки було помічено, що бляшки, які вона утворює на галявині C. hyointestinalis, були схожі на ті, що виробляються бактеріофагами. Це несподівана знахідка, оскільки частина процесу виділення фага включає фільтрацію через фільтр 0,2 мкм, який призначений для видалення бактеріальних клітин. Мікроскопічне дослідження матеріалу, виділеного з нальоту, показало, що маленькі грамнегативні вигнуті паличкоподібні бактерії не накопичували полігідроксибутират (ПГБ). Асептична культура незалежно від клітин жертви реалізується на насиченому твердому середовищі (такому як мозковий серцевий інфузійний агар (BHI) і кров’яний агар (BA)), і її ріст слабкий. Отримують після пересівання з інокулятом. Він однаково добре росте в мікроаеробних (7% об./об. кисню) і атмосферних умовах, але не в анаеробній атмосфері. Через 72 години діаметр колонії був дуже малим, досягаючи 2 мм, і вона була бежевою, напівпрозорою, круглою, опуклою та блискучою. Стандартне біохімічне тестування ускладнене, оскільки ASxL5T не можна надійно культивувати в рідкому середовищі, що свідчить про те, що він може покладатися на складний життєвий цикл утворення біоплівки. Проте суспензія планшета показала, що ASxL5T є аеробним, позитивним на оксидазу та каталазу, і може переносити 5% NaCl. ASxL5T стійкий до 10 мкг стрептоміцину, але чутливий до всіх інших протестованих антибіотиків. Бактеріальні клітини ASxL5T досліджували за допомогою ПЕМ (рис. 1). При вирощуванні без клітин-жертви на BA клітини ASxL5T є невеликими Campylobacter із середньою довжиною 1,63 мкм (± 0,4), шириною 0,37 мкм (± 0,08) і одним довгим (до 5 мкм) полюсом. Статеві джгутики. Приблизно 1,6% клітин мають ширину менше 0,2 мкм, що дозволить проходити через фільтруючий пристрій. На вершині деяких клітин спостерігалося незвичайне структурне розширення, схоже на обтічник (лат. cucullus) (див. стрілки на 1D, E, G). Здається, це складається з надлишкової зовнішньої мембрани, що може бути пов’язано зі швидким зменшенням розміру периплазматичної оболонки, тоді як зовнішня мембрана залишається неушкодженою, демонструючи «вільний» вигляд. Культивування ASxL5T за відсутності поживних речовин (у PBS) протягом тривалого часу при 4 °C призвело до того, що більшість (але не всі) клітини демонструють кокову морфологію (рис. 1C). Коли ASxL5T росте з Campylobacter jejuni як здобич протягом 48 годин, середній розмір клітини значно довший і вужчий, ніж клітини, вирощені без хазяїна (таблиця 1 і малюнок 1E). Навпаки, коли ASxL5T росте з E. coli як здобич протягом 48 годин, середній розмір клітини довший і ширший, ніж коли він росте без здобичі (Таблиця 1), а довжина клітини є змінною, зазвичай демонструючи ниткоподібність (Малюнок 1F). При інкубації з Campylobacter jejuni або кишковою паличкою як здобиччю протягом 48 годин клітини ASxL5T взагалі не показали джгутиків. Таблиця 1 підсумовує спостереження за змінами розміру клітини на основі присутності, відсутності та типу жертви ASxL5T.
TEM-дисплей ASx5LT: (A) ASx5LT показує довгий хлист; (B) типовий акумулятор ASx5LT; (C) клітини коків ASx5LT після тривалої інкубації без поживних речовин; (D) група клітин ASx5LT демонструє аномалію (E) Група клітин ASx5LT, інкубована з жертвою Campylobacter, показала збільшену довжину клітин порівняно з клітинами без росту жертви (D) також показала апікальну структуру; (F) Великі ниткоподібні джгутики, клітини ASx5LT, після інкубації зі здобиччю E. coli; (G) Одна клітина ASx5LT після інкубації з кишковою паличкою, що демонструє незвичайну верхню структуру. Смуга відповідає 1 мкм.
Визначення послідовності гена 16S рРНК (номер доступу MT636545.1) дає змогу здійснювати пошук у базі даних для встановлення послідовностей, подібних до тих, що належать до класу Gammaproteobacteria, і є найближчими до морських бактерій у родині морських спірил (рис. 2), а також належать до роду Thalassolituus Найближчий родич морської палички. Послідовність гена 16S рРНК явно відрізняється від хижих бактерій, що належать до родини Bdelvibrionaceae (Deltaproteobacteria). Попарне порівняння B. bacteriovorus HD100T (штам типу, DSM 50701) і B. bacteriovorus DM11A склало 48,4% і 47,7%, а для B. exovorus JSS — 46,7%. Бактерії ASxL5T мають 3 копії гена 16S рРНК, дві з яких ідентичні одна одній, а третя знаходиться на 3 основи. Два інших ізоляти хижих бактерій (ASx5S та ASx5O; номери доступу до гена 16S рРНК MT636546.1 та MT636547.1 відповідно) з подібними морфологічними та фенотиповими характеристиками з того самого місця не є однаковими, але вони відрізняються від ASxL5T та некультивованої бактерії. послідовності бази даних згруповані разом з іншими родами в Oceanospirillaceae (рис. 2). Повна послідовність генома ASxL5T була визначена та збережена в базі даних NCBI, а номер доступу CP046056. Геном ASxL5T складається з кільцевої хромосоми розміром 2 831 152 bp із співвідношенням G + C 56,1%. Послідовність генома містить 2653 CDS (загалом), з яких 2567, як передбачається, кодують білки, з яких 1596 можуть бути призначені як передбачувані функції (60,2%). Геном містить 67 генів, що кодують РНК, включаючи 9 рРНК (по 3 для 5S, 16S і 23S) і 57 тРНК. Геномні характеристики ASxL5T порівнювали з наявними геномами штамів найближчого родича, ідентифікованого за послідовністю гена 16S рРНК (табл. 2). Використовуйте ідентичність амінокислот (AAI), щоб порівняти всі доступні геноми Thalassolituus з ASxL5T. Найближчою доступною (неповною) послідовністю геному, визначеною за допомогою AAI, є Thalassolituus sp. C2-1 (додати NZ_VNIL01000001). Цей штам було виділено з глибоководних відкладень Маріанської западини, але наразі немає фенотипічної інформації про цей штам для порівняння. Порівняно з 2,82 Мб ASxL5T, геном організму більший на 4,36 Мб. Середній розмір геному морських спірохет становить близько 4,16 Мб (± 1,1; n = 92 повних еталонних геномів, досліджених за посиланням https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly), тому геном ASxL5T відповідає порядок Порівняно з іншими членами, він досить малий. Використовуйте GToTree 1.5.54 для створення філогенетичного дерева максимальної вірогідності на основі геному (рис. 3A), використовуючи вирівняні та пов’язані послідовності амінокислот 172 однокопійних генів, специфічних для гаммапротеобактерій 11,12,13,14,15,16, 17 ,18. Аналіз показав, що він тісно пов’язаний з Thalassolituus, Bacterial Plane і Marine Bacterium. Однак ці дані вказують на те, що ASxL5T відрізняється від своїх родичів у морській спіруліні, і дані про послідовність його геному доступні.
Філогенетичне дерево з використанням послідовності гена 16S рРНК підкреслює положення штамів ASxL5T, ASxO5 і ASxS5 (з нутрощами) відносно штамів некультивованих і морських бактерій у морських Spirulinaceae. Номер доступу Genbank слідує за назвою штаму в дужках. Використовуйте ClustalW для вирівнювання послідовностей і використовуйте метод максимальної правдоподібності та модель Тамура-Нея для висновку про філогенетичні зв’язки та виконайте 1000 керованих реплікацій у програмі MEGA X. Цифра на гілці вказує на те, що значення керованої копії перевищує 50%. Escherichia coli U/541T використовували як аутгрупу.
(A) Філогенетичне дерево на основі генома, яке показує зв’язок між морською бактерією Spirospiraceae ASxL5T та її близькими родичами E. coli U 5/41T як зовнішньою групою. (B) Порівняно з T. oleivorans MIL-1T, розподіл функціональних категорій генів прогнозується на основі кластера ортологічної групи (COG) білка ASx5LT. На малюнку ліворуч показано кількість генів у кожній функціональній категорії COG у кожному геномі. На графіку праворуч показано відсоток геномів, що містяться в кожній функціональній групі COG. (C) Порівняно з T. oleiverans MIL-1T, аналіз повного модульного шляху KEGG (Кіотська енциклопедія генів і геномів) ASxL5T.
Використання бази даних KEGG для вивчення компонентів генів, присутніх у геномі ASxL5T, виявило типовий метаболічний шлях аеробного гамма-протея. ASxL5T містить загалом 75 генів, пов’язаних з моторними білками бактерій, включаючи гени, що беруть участь у хемотаксисі, збірці джгутиків і системі фімбрій IV типу. В останній категорії 9 з 10 генів відповідають за посмикування ряду інших організмів. Геном ASxL5T містить повний шлях біосинтезу тетрагідропіримідину, який бере участь у захисній відповіді на осмотичний стрес20, як і очікувалося для галофілів. Геном також містить багато повних шляхів для кофакторів і вітамінів, включаючи шляхи синтезу рибофлавіну. Хоча ген алкан-1-монооксигенази (alkB2) присутній в ASxL5T, шлях утилізації вуглеводнів не завершений. У послідовності генома ASxL5T гомологи генів, ідентифікованих як головним чином відповідальних за деградацію вуглеводнів у T. oleiverans MIL-1T21, таких як TOL_2658 (alkB) і TOL_2772 (алкогольдегідрогеназа), очевидно, відсутні. На малюнку 3B показано порівняння розподілу генів у категорії COG між ASxL5T і оливковою олією MIL-1T. Загалом, менший геном ASxL5T містить пропорційно менше генів з кожної категорії COG порівняно з більшим пов’язаним геномом. Коли кількість генів у кожній функціональній категорії виражається у відсотках геному, відзначаються відмінності у відсотках генів у категоріях трансляції, рибосомної структури та біогенезу, а також у категоріях функції виробництва та перетворення енергії, які складають більший ASxL5T геном Відсоток порівнюється з тією ж групою, присутньою в геномі T. oleiverans MIL-1T. Навпаки, порівняно з геномом ASxL5T, T. oleivorans MIL-1T має вищий відсоток генів у категоріях реплікації, рекомбінації та репарації та транскрипції. Цікаво, що найбільшою різницею у вмісті кожної функціональної категорії двох геномів є кількість невідомих генів, присутніх у ASxL5T (рис. 3B). Було проведено аналіз збагачення модулів KEGG, де кожен модуль KEGG представляє набір визначених вручну функціональних одиниць для анотації та біологічної інтерпретації даних послідовності геному. Порівняння розподілу генів у повному шляху модуля KOG ASxL5T і оливи MIL-1T показано на малюнку 3C. Цей аналіз показує, що хоча ASxL5T має повний шлях метаболізму сірки та азоту, T. oleiverans MIL-1T цього не робить. Навпаки, T. oleiverans MIL-1T має повний метаболічний шлях цистеїну та метіоніну, але він неповний у ASxL5T. Таким чином, ASxL5T має характерний модуль для асиміляції сульфату (визначається як набір генів, які можуть бути використані як фенотипові маркери, такі як метаболічна здатність або патогенність; https://www.genome.jp/kegg/module.html) у T Олейвери МІЛ-1Т. Порівняння вмісту гена ASxL5T зі списком генів, які вказують на хижацький спосіб життя, не є остаточним. Хоча ген waaL, що кодує лігазу, асоційовану з полісахаридом антигену О до ядра, присутній у геномі ASxL5T (але він поширений у багатьох грамнегативних бактерій), гени триптофан-2,3-діоксигенази (TDO) можуть включати 60 амінокислот. кислотні області, які зазвичай зустрічаються у хижих бактерій, яких немає. У геномі ASxL5T немає інших хижих характерних генів, включаючи ті, що кодують ферменти, залучені до біосинтезу ізопреноїдів у мевалонатному шляху. Зверніть увагу, що в дослідженій групі хижаків немає регуляторного гена транскрипції gntR, але в ASxL5T можна ідентифікувати три gntR-подібні гени.
Фенотипові характеристики ASxL5T підсумовані в таблиці 3 і порівнюються з фенотиповими характеристиками споріднених родів 23, 24, 25, 26 і 27, про які повідомляється в літературі. Ізоляти T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis і Oceanobacter kriegii є активними, стійкими до солі, оксидазопозитивними паличкоподібними тільцями, але майже не мають інших фенотипових характеристик з ASxL5T. Середній pH океану становить 8,1 (https://ocean.si.edu/ocean-life/invertebrates/ocean-acidification#section_77), що відображається на T. marinus, T. olevorans, B. sanyensis і O. kriegii. ASxL5T підходить для ширшого діапазону pH (4-9), характерного для неморських видів. Фенотипові характеристики Thalassolituus sp. C2-1. Невідомий. Температурний діапазон росту ASxL5T, як правило, ширший, ніж у морських штамів (4–42 °C), хоча деякі, але не всі ізоляти T. marinus є термостійкими. Нездатність вирощувати ASxL5T у бульйонному середовищі завадила подальшій фенотиповій характеристиці. Використовуйте API 20E для перевірки матеріалів, зіскоблених з пластини BA, ONPG, аргінін-дигідролази, лізин-декарбоксилази, орнітин-декарбоксилази, утилізації цитрату, уреази, триптофандезамінази, ферменту гідролізу желатину, усі результати тесту були негативними, але не було індолу, ацетоїну та H2S були виготовлені. До неферментованих вуглеводів відносяться: глюкоза, маноза, інозит, сорбіт, рамноза, сахароза, мелібіоза, амігдалін і арабіноза. Порівняно з опублікованими відповідними еталонними штамами, клітинний профіль жирних кислот штаму ASxL5T наведено в таблиці 4. Основними клітинними жирними кислотами є C16:1ω6c та/або C16:1ω7c, C16:0 і C18:1ω9. Також існують гідроксижирні кислоти C12:0 3-OH і C10:0 3-OH. Співвідношення C16:0 в ASxL5T вище, ніж зареєстроване значення споріднених родів. Навпаки, порівняно з зареєстрованим T. marinus IMCC1826TT, співвідношення C18:1ω7c та/або C18:1ω6c у ASxL5T зменшилося. oleivorans MIL-1T і O. kriegii DSM 6294T, але не виявлено в B. sanyensis KCTC 32220T. Порівняння профілів жирних кислот ASxL5T і ASxLS виявило тонкі відмінності в кількості окремих жирних кислот між двома штамами, які узгоджуються з послідовністю геномної ДНК того самого виду. Жодних частинок полі-3-гідроксибутирату (PHB) не виявлено за допомогою тесту Sudan black.
Вивчали хижацьку активність бактерій ASxL5T, щоб визначити діапазон здобичі. Ця бактерія може утворювати бляшки на видах Campylobacter, зокрема: Campylobacter suis 11608T, Campylobacter jejuni PT14, Campylobacter jejuni 12662, Campylobacter jejuni NCTC 11168T; Escherichia coli NCTC 12667; C. helveticus NCTC 12472; C lari NCTC 11458 і C. upsaliensis NCTC 11541T. Використовуйте культури, перелічені в розділі визначення діапазону господарів цього методу, щоб перевірити ширший спектр грамнегативних і грампозитивних бактерій. Результати показують, що ASxL5T також можна використовувати в Escherichia coli NCTC 86 і Citrobacter freundii NCTC 9750T. Бляшки утворилися на Klebsiella oxytoca 11466. Взаємодія ТЕМ з E. coli NCTC 86 показана на рисунку 4A-D, а взаємодія з Campylobacter jejuni PT14 і Campylobacter suis S12 показана на малюнку 4E-H посередині. Механізм атаки, здається, різний для досліджуваних типів здобичі, з однією або кількома клітинами E. coli, прикріпленими до кожної клітини ASxL5T і розташованими збоку вздовж розширеної клітини перед адсорбцією. Навпаки, ASxL5T, здається, приєднується до Campylobacter через одну точку контакту, зазвичай у контакті з вершиною клітини хижака та поблизу вершини клітини Campylobacter (рис. 4H).
TEM показує взаємодію між ASx5LT і здобиччю: (AD) і здобиччю E. coli; (EH) і C. jejuni prey. (A) Типова клітина ASx5LT, з’єднана з однією клітиною E. coli (EC); (B) Ниткоподібний ASx5LT, прикріплений до однієї клітини EC; (C) Ниткоподібна клітина ASx5LT, з’єднана з кількома клітинами EC; (D) Приєднання менших клітин ASx5LT до однієї клітини E. coli (EC); (E) одна клітина ASx5LT, з'єднана з клітиною Campylobacter jejuni (CJ); (F) ASx5LT атакує клітини C. hyointestinalis (CH); (G) дві Одна клітина ASx5LT атакувала клітину CJ; (H) Вид зблизька точки прикріплення ASx5LT біля верхівки клітини CJ (ширина 0,2 мкм). Смужка позначає 1 мкм у (A–G).
Хижі бактерії еволюціонували, щоб скористатися багатими джерелами здобичі. Очевидно, що вони широко присутні в багатьох різних середовищах. Через вузький розмір членів популяції можна виділити бактерії ASxL5T із суспензії за допомогою методу розділення фагів. Геномна значущість ASxL5T для членів сімейства океаноспірилових морських бактерій є дивною, хоча організм стійкий до солі та може рости на середовищі, що містить 5% солі. Аналіз якості води в розчині показав, що вміст хлориду натрію був менше 0,1%. Тому мул знаходиться далеко від морського середовища - як географічно, так і хімічно. Наявність трьох споріднених, але різних ізолятів з одного джерела свідчить про те, що ці хижаки процвітають у цьому неморському середовищі. Крім того, аналіз мікробіома (файли даних доступні за адресою https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB38990) показав, що та сама послідовність гена 16S рРНК розташована в топ-50 найпоширеніших таксонів (OTU ) Через кілька інтервалів відбору проб грязі. У базі даних Genbank було знайдено кілька некультивованих бактерій, які мають послідовності генів 16S рРНК, схожі на бактерії ASxL5T. Ці послідовності разом із послідовностями ASxL5T, ASxS5 і ASxO5, здається, представляють різні клади, відокремлені від Thalassolituus і Oceanobacter (рис. 2). Три види некультивованих бактерій (GQ921362, GQ921357 і GQ921396) були виділені з води тріщини на глибині 1,3 кілометра в південноафриканській золоторудній шахті в 2009 році, а інші два (DQ256320 і DQ337006) були виділені з підземних вод (також у Південній Африці). у 2005 році). Послідовність гена 16S рРНК, найбільш пов’язана з ASxL5T, є частиною послідовності гена 16S рРНК, отриманої з культури збагачення піщаних відкладень, отриманих з пляжів північної Франції в 2006 році (номер доступу AM29240828). Ще одна близькоспоріднена послідовність гена 16S рРНК з некультивованої бактерії HQ183822.1 була отримана з резервуара для збору, вимитого з муніципального звалища в Китаї. Очевидно, що бактерії ASxL5T не дуже репрезентативні в таксономічних базах даних, але ці послідовності некультивованих бактерій, ймовірно, представляють організми, подібні до ASxL5T, які поширені по всьому світу, зазвичай у складних середовищах. З філогенетичного аналізу всього геному найближчим родичем до ASxL5T є Thalassolituus sp. C2-1, T. marinus, T. oleivorans. І O. kriegii 23, 24, 25, 26, 27. Thalassolituus є членом морських облігатних бактерій фрагментації вуглеводнів (OHCB), які широко поширені в морських і наземних середовищах і зазвичай стають домінуючими після інцидентів забруднення вуглеводнями30,31. Морські бактерії не є членами групи OHCB, але ізольовані з морського середовища.
Фенотипічні дані вказують на те, що ASxL5T є новим видом і членом раніше невідомого роду в сімействі морських спіроспірових. Наразі немає чіткого стандарту для класифікації нещодавно виділених штамів у новий рід. Були зроблені спроби визначити універсальні межі пологів, наприклад, на основі відсотка геному консервативного білка (POCP), рекомендовано, щоб граничне значення було на 50% ідентичним еталонному штаму33. Інші пропонують використовувати значення AAI, які мають переваги перед POCP, оскільки їх можна отримати з неповних геномів34. Автор вважає, що якщо значення AAI менше 74% порівняно з модельним штамом модельного виду, штам є представником інших родів. Модельним родом у морських спірилових є морська спірилла, а модельним штамом є O. linum ATCC 11336T. Значення AAI між ASxL5T і O. linum ATCC 11336T становить 54,34%, а значення AAI між ASxL5T і T. oleivorans MIL-1T (штами типу роду) становить 67,61%, що вказує на те, що ASxL5T представляє новий рід, відмінний від Thalassolituus. Використовуючи послідовність гена 16S рРНК як стандарт класифікації, запропонована межа розмежування роду становить 94,5%35. ASxL5T можна віднести до роду Thalassolituus, демонструючи 95,03% ідентичності послідовності 16S рРНК з T. oleivorans MIL-1T і 96,17%. marinus IMCC1826T. Однак його також буде поміщено в рід Bacteroides, який має 94,64% ідентичності гена 16S рРНК з B. sanyensis NV9, що вказує на те, що використання одного гена, такого як ген 16S рРНК, може призвести до довільної класифікації та призначення. Інший запропонований метод використовує ANI та оцінку вирівнювання генома (AF) для вивчення кластеризації точок даних усіх типів і нетипових штамів існуючих родів. Автор рекомендує поєднувати межу роду з точкою перегину оцінюваного роду, специфічного для таксонів, що аналізуються. Однак, якщо недостатньо повних геномних послідовностей ізолятів Thalassolituus, неможливо визначити, чи належить ASxL5T до роду Thalassolituus за допомогою цього методу. Через обмежену доступність повних геномних послідовностей для аналізу все філогенетичне дерево генома слід інтерпретувати з обережністю. По-друге, методи порівняння цілого геному не можуть пояснити суттєві відмінності в розмірі порівнюваних геномів. Вони виміряли подібність збережених основних однокопійних генів між спорідненими родами, але не врахували велику кількість генів, яких немає в набагато меншому геномі ASxL5T. Очевидно, що ASxL5T і групи, включаючи Thalassolituus, Oceanobacter і Bacterioplanes, мають спільного предка, але еволюція пішла іншим шляхом, що призвело до зменшення геному, яке, можливо, було пов’язане з адаптацією до хижацького способу життя. Це на відміну від T. oleivorans MIL-1T, який на 28% більший і еволюціонував під різним тиском навколишнього середовища для використання вуглеводнів23,30. Цікаве порівняння можна провести з облігатними внутрішньоклітинними паразитами та симбіонтами, такими як Rickettsia, Chlamydia та Buchnera. Розмір їх геному становить близько 1 Мб. Здатність використовувати метаболіти клітини-господаря призводить до втрати генів, тому зазнав значної еволюційної геномної деградації. Еволюційні зміни від морських хімічних поживних організмів до хижацького способу життя можуть призвести до подібного зменшення розміру геному. Аналіз COG і KEGG підкреслює кількість генів, які використовуються для певних функцій, і глобальні відмінності в геномних шляхах між ASxL5T і T. oleivorans MIL-1T, які не пов’язані з широкою доступністю мобільних генетичних елементів. Різниця у співвідношенні G + C всього геному ASxL5T становить 56,1%, а T. oleivorans MIL-1T – 46,6%, що також свідчить про його сегрегацію.
Дослідження кодуючого вмісту геному ASxL5T дає функціональне уявлення про фенотипові характеристики. Наявність генів, що кодують фімбрії типу IV (Tfp), представляє особливий інтерес, оскільки вони сприяють руху клітин, що називається соціальним ковзанням або конвульсіями, без джгутиків на поверхні. Згідно з повідомленнями, Tfp виконує інші функції, включаючи хижацтво, патогенез, формування біоплівки, природне поглинання ДНК, автоматичну агрегацію та розвиток клітин38. Геном ASxL5T містить 18 генів, що кодують дигуанілатциклазу (фермент, який каталізує перетворення 2-гуанозинтрифосфату в гуанозин-2-фосфат і циклічний diGMP), і 6 генів, що кодують відповідний дигуанілатциклазу, фосфатдигуанілат. Ген естерази (каталізує деградацію циклічного di-GMP до гуанозинмонофосфату) є цікавим, оскільки cycl-di-GMP є важливим вторинним месенджером, який бере участь у розвитку та відділенні біоплівки, переміщенні, прикріпленні клітин і вірулентності 39, 40 у цьому процесі. Слід також зазначити, що у Bdellovibrio bacteriovorus було показано, що циклічний подвійний GMP контролює перехід між вільним життям і хижацьким способом життя41.
Більшість досліджень хижих бактерій зосереджено на Bdellovibrio, Bdellovibrio-подібних організмах і видах Myxococcus. Ці та інші відомі приклади хижих бактерій утворюють різноманітну групу. Незважаючи на це різноманіття, було ідентифіковано набір характерних сімейств білків, які відображають фенотипи 11 відомих хижих бактерій3,22. Однак ідентифіковано лише гени, що кодують О-антиген-лігазу (waaL), яка особливо поширена у грамнегативних бактерій. Ця форма аналізу не допомагає визначити ASxL5T як хижака, ймовірно тому, що він використовує нову стратегію атаки. Наявність більш різноманітних геномів хижих бактерій допоможе розробити більш точний аналіз роздільної здатності, який враховує докази функціональних та екологічних відмінностей між членами групи. Приклади хижих бактерій, які не включені в цей аналіз, включають представників Cupriavidus necator42 і Bradymonabacteria43, тому що, коли дослідники досліджують різні мікробні спільноти, встановлюється більше хижих таксонів.
Найпомітнішою особливістю бактерій ASxL5T, отриманих за допомогою ТЕМ-зображення, є їх унікальна та гнучка морфологія, яка може сприяти взаємодії з бактеріями-жертвами. Тип спостережуваної взаємодії відрізняється від інших хижих бактерій і раніше не був виявлений або не повідомлявся. Пропонований хижацький життєвий цикл ASxL5T показаний на малюнку 5. У літературі є кілька прикладів із подібними апікальними структурами, як ми наводимо тут, але ці приклади включають Terasakiispira papahanaumokuakeensis, морську бактерію спіриллум із випадковим розширенням верхівки 44, і Alphaproteobacteria, Terasakiella pusilla , раніше належав до роду Oceanospirillum, що демонструє так звану «полярну плівку» 45. Форми коків часто спостерігаються в старих культурах, особливо для бактерій із вигнутими формами, таких як Vibrio, Campylobacter і Helicobacter 46, 47, 48, які можуть представляти деградований стан. Необхідна подальша робота, щоб з’ясувати точний життєвий цикл бактерій ASxL5T. Щоб визначити, як він захоплює та видобуває, і чи кодує його геном біологічно активні сполуки, які можна використовувати в медичних чи біотехнологічних цілях.
Опис Venatorbacter gen. Листопад Venatorbacter (Ven.a.tor, ba'c.ter, L. складається з венаторів від L. n. venator, «мисливець» і гр. n. bacter, «паличка». Venatorbacter, «мисливська паличка» Клітини аеробні, фарбуються за Грамом, активність каталази та оксидази не накопичується Діапазон температур від 4 до 42 °C. У морських равликів є непереносимість кислотних кислот C16:1ω7c і C16:0. C18:1ω9; C12:0 3-OH і C10:0 3-OH зустрічаються як гідрокси жирні кислоти не росте в бульйонних середовищах.Члени цього роду виявляють резистентність до сімейства Enterobacteriaceae.
Опис Venatorbacter cucullus sp. Листопад Venatorbacter cucullus (cu'cull.us.; L. n. cucullus означає обтічник).
Крім того, характерною ознакою цього роду є те, що при вирощуванні на BA або BHI клітини мають довжину 1,63 мкм і ширину 0,37 мкм. Колонії на агарі BHI дуже маленькі, досягаючи 2 мм у діаметрі через 72 години. Вони бувають бежевими, напівпрозорими, круглими, опуклими і блискучими. Представники цього виду можуть використовувати кишкову паличку і клебсієлу. Здобиччю служать Campylobacter і деякі інші грамнегативні бактерії.
Типовий штам ASxL5T було виділено з яловичого молока в Ноттінгемширі, Великобританія, і депоновано в Національній колекції типових культур (Великобританія): номер доступу NCTC 14397 і Нідерландська колекція бактеріальних культур (NCCB) номер доступу NCCB 100775. Повна послідовність геному ASxL5T було депоновано в Genbank згідно з додатком CP046056.
Бактерії ASxL5T були виділені з яловичого молока за допомогою технології ізоляції фагів9,49. Суспензію розводили 1:9 (маса/об’єм) у буфері SM (50 мМ Tris-HCl [pH 7,5], 0,1 М NaCl, 8 мМ MgSO4,7H2O та 0,01% желатину; Sigma Aldrich, Gillingham, UK), потім інкубували. при 4°C протягом 24 годин, повільно обертаючи для елюювання хижаків у буфер. Суспензію центрифугували при 3000 g протягом 3 хвилин. Супернатант збирали і центрифугували при 13 000 g вдруге протягом 5 хвилин. Потім супернатант пропускали через мембранний фільтр 0,45 мкм (Minisart; Sartorius, Геттінген, Німеччина) і мембранний фільтр 0,2 мкм (Minisart) для видалення будь-яких залишкових бактеріальних клітин. ASxL5T може пропускати ці фільтри. Газон з м’якого агару Campylobacter enterosus S12 (номер доступу NCBI CP040464) з тієї ж суспензії був виготовлений за стандартними методами. Відфільтровану суспензію розподіляли по 10 мкл крапель на кожну з цих чашок з клітинами-господарями в трьох повторах і давали висохнути. Планшет інкубували в мікроаерофільному резервуарі при 37°C протягом 48 годин в мікроаеробних умовах (5% O2, 5% H2, 10% CO2 і 80% N2). Отриману видиму бляшку екстрагували в буфер SM і переносили на свіжий газон C. hyointestinalis S12 для подальшого розмноження лізованих організмів. Коли буде встановлено, що причиною літичного нальоту є бактерія, а не фаг, спробуйте виростити організм незалежно від господаря та охарактеризуйте його далі. Аеробне культивування проводили при 37 °C з 5% об./об. дефібринованої кінської крові (TCS Biosciences Lt, Букінгем, Великобританія, додаток). Відповідно до вказівок Національного комітету з клінічних стандартів, метод дискової дифузії використовується для визначення антибактеріальної чутливості. BHI-агар культивували при 37 °C з використанням диска, що містить такі антибіотики (Oxoid) для аеробної культури: амоксицилін і клавуланова кислота 30 мкг; цефотаксим 30 мкг; стрептоміцин 10 мкг; ципрофлоксацин 5 мкг; Цефтазидим 30 мкг Налідиксова кислота 30 мкг; Іміпенем 10 мкг; Азитроміцин 15 мкг; Хлорамфенікол 30 мкг; Цефокситин 30 мкг; Тетрациклін 30 мкг; Нітрофурантоїн 300 мкг; азтреонам 30 мкг; ампіцилін 10 мкг; Цефподоксим 10 мкг; Триметоприм-Сульфаметоксазол 25 мкг. Стійкість до солі була встановлена ​​шляхом аеробної інкубації на чашках з агаром BHI при 37 °C. До чашок з агаром BHI додали додаткову кількість NaCl для забезпечення діапазону концентрації до 10% мас./об. Діапазон рН визначається за допомогою аеробного культивування на чашках з агаром BHI при 37°C, де діапазон рН був відрегульований до 4-9 за допомогою стерильної HCl або стерильного NaOH, а цільове значення рН перевіряється перед розливом чашки. Для аналізу клітинних жирних кислот ASxL5T культивували на агарі BHI протягом 3 днів і в аеробних умовах при 37 °C. Відповідно до стандартного протоколу MIDI (Sherlock Microbial Identification System, версія 6.10) FERA Science Ltd, (Йорк, Великобританія), клітинні жирні кислоти екстрагували, готували та аналізували.
Для TEM ASxL5T культивували аеробно шляхом рівномірного розподілу на BA при 37°C протягом 24 годин, а потім збирали в 1 мл 3% (об’єм/об’єм) глутарового альдегіду в 0,1 М какодилатному буфері при кімнатній температурі. Фіксували протягом 1 години, потім центрифугували. при 10000 г протягом 3 хвилин. Потім обережно ресуспендуйте осад у 600 мкл 0,1 М какодилатного буфера. Перенесіть фіксовану суспензію ASxL5T на Formvar/вуглецеву плівку на мідну сітку 200 меш. Бактерії фарбували 0,5% (мас./об.) уранілацетату протягом 1 хвилини та досліджували за допомогою ТЕМ за допомогою мікроскопа TEI Tecnai G2 12 Biotwin. Як зазначалося вище, об’єднайте однакову кількість здобичі та хижака в бульйоні NZCYM (BD Difco™, Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough) та інкубуйте протягом 48 годин у мікроаеробних умовах Campylobacter або Campylobacter при 37°C. Взаємодія хижака та здобичі також була обстежена ТЕМ. Аеробні умови для Escherichia coli. Незалежно досліджуйте здобич і хижі бактерії, щоб визначити будь-які зміни в морфології клітин через хижацтво. Для оптичної мікроскопії накопичення ПГБ використовували метод Sudan black.
Вирощуйте культури ASxL5T протягом ночі, розмазуючи ріст на чашках BHI або BA стерильним тампоном. Зберіть клітини ASxL5T і суспендуйте їх у MRD (CM0733, Oxoid), а потім помістіть їх при 4 °C на 7 днів, щоб знищити клітини. Еталонну або лабораторну базову бактеріальну культуру NCTC інокулювали в бульйон BHI або поживний бульйон № 2 (CM007, Oxoid), інкубували протягом ночі, центрифугували при 13 000 g і ресуспендували в MRD, поки OD600 не становив 0,4. Культура: Bacillus subtilis NCTC 3610T, Citrobacter freundii NCTC 9750T, Enterobacter aerogenes NCTC 10006T, Enterococcus faecalis NCTC 775T, Escherichia coli NCTC 86, Klebsiella oxytoca 11466, Leuconostoc NCTC 10817, Спеціальні бактерії Listeria NCTC 4885, Bacillus macerans NCTC 6355T, Providencia stuartsii NCTC 10318, Pseudomonas fluorescens SMDL, Rhodococcus submarine hamburger NCTC 1621T, кишкові бактерії Salmonella Mondeville NCTC 5747, слиз NCTC 10861, Staphylococcus aureus NCTC 8532T, Streptococcus pneumoniae NCTC 7465T, Yersinia enterocolitica NCTC 10460. Хазяїна Campylobacter мікроаеробно інкубували на чашках BA при 37°C і суспендували в бульйоні NZCYM. Тестовані господарі Campylobacter: C. coli 12667 NCTC, C. jejuni 12662, C. jejuni PT14, C. jejuni NCTC 11168T, C. helveticus NCTC 12472, C. lari NCTC 11458, C. lari NCTC 11458, C. jejuni PT14, C... Зберіть клітини в MRD, центрифугуйте при 13 000 g і ресуспендуйте в MRD, поки OD600 не стане 0,4. Додайте аліквоту 0,5 мл суспензії до 5 мл розплавленого верхнього агару NZCYM (0,6% агару) і вилийте на нижню пластину з 1,2% NZCYM. Після затвердіння та сушіння серійно розведений ASxL5T розподіляли у вигляді крапель по 20 мкл на кожну дошку газону в трьох примірниках. Температура та атмосфера культури залежать від вимог досліджуваних бактерій.
Використовуйте GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma Aldridge), щоб підготувати ДНК із бактеріальних ізолятів. Для ПЛР-ампліфікації гена 16S рРНК та визначення послідовності продукту використовували стандартні методи за допомогою хімії термінації барвника (Eurofins Value Read Service, Німеччина). Використовуйте програму BLAST-N, щоб порівняти ці послідовності з іншими послідовностями генів 16S рРНК, щоб ідентифікувати та зібрати близькоспоріднені види. Вони вирівнюються за допомогою ClustalW у програмі MEGA X. Філогенетичне дерево було реконструйовано за допомогою MEGA X із застосуванням методу максимальної правдоподібності на основі моделі Тамура-Нея з 1000 керованими копіями54. Використовуйте набір геномної ДНК PureLink™ (Fisher Scientific, Лафборо, Великобританія), щоб витягнути ДНК для секвенування всього генома. Послідовність генома ASxL5T була визначена за допомогою комбінації Illumina MiSeq, яка складається з двосторонніх зчитувань довжиною 250 bp, що складаються з бібліотеки, підготовленої за допомогою набору для маркування Nextera, і зчитувань довжиною від 2 до 20 кб з платформи PacBio. Дослідницький центр секвенування геномної ДНК в Університеті Сембія. Геном був зібраний за допомогою CLC Genomics Workbench 12.0.3 (Qiagen, Орхус, Данія). Культури ASxL5T зберігаються в Національній колекції типових культур (Великобританія) і Нідерландській колекції бактеріальних культур (NCCB). Геноми споріднених організмів, які використовуються для порівняння: Thalassolituus oleivorans MIL-1T (номер доступу HF680312, повний); Bacterioplanes sanyensis KCTC 32220T (інвентарний номер BMYY01000001, неповний); Oceanobacter kriegii DSM 6294T (номер доступу NZ_AUGV00000000, неповний); Marinamonas community DSM 5604T (доданий ASM436330v1, неповний), Oceanospirullum linum ATCC 11336T (доданий MTSD02000001, неповний) і Thalassolituus sp. C2-1 (додати NZ_VNIL01000001, неповне). Використовуйте JGI Genome Portal36 за адресою https://img.jgi.doe.gov//cgi-bin/mer/main.cgi?section=ANI&page=, щоб визначити оцінку вирівнювання (AF) і середню ідентичність нуклеїнової кислоти (ANI). У парах. Для визначення ідентичності амінокислот (AAI) використовували метод Rodriguez-R & Konstantinidis55. Використовуйте GToTree 1.5.5411,12,13,14,15,16,17,18 для створення оціненого філогенетичного дерева максимальної ймовірності. Вхідний геном, що представляє доступний еталонний геном, вибирається з еталонних родів, визначених як пов’язані з ASxL5T з філогенії 16S рРНК. Додав примітки до дерева за допомогою онлайн-інструменту інтерактивного дерева життя (https://itol.embl.de/). Функціональна анотація та аналіз геному ASxL5T виконується за допомогою онлайн-інструменту BlastKOALA KEGG з використанням розповсюдження модулів KEGG (Кіотська енциклопедія генів і геномів). Розподіл категорій COG (ортологічних груп) визначається за допомогою онлайн-інструменту eggNOG-mapper.
Перес, Дж., Мораледа-Муньос, А., Маркос-Торрес, Ф. Дж. і Муньос-Дорадо, Дж. Бактеріальне хижацтво: 75 років, і воно триває! . середовище. мікроорганізм. 18, 766–779 (2016).
Лінарес-Отоя, Л. та ін. Різноманітність та антибактеріальний потенціал хижих бактерій на узбережжі Перу. Березневі наркотики. 15. E308. https://doi.org/10.3390/md15100308 (2017).
Пастернак З. та ін. Через їхні гени ви зрозумієте їх: геномні характеристики хижих бактерій. ISME J. 7, 756–769 (2013).
Sockett, RE Хижацький спосіб життя бактеріофага Bdellovibrio. встановити. Пастор мікроби. 63, 523–539 (2009).
Korp, J., Vela Gurovic, MS & Nett, M. Антибіотики від хижих бактерій. Beilstein J. Histochemistry 12, 594–607 (2016).
Johnke, J., Fraune, S., Bosch, TCG, Hentschel, U. & Schulenburg, H. Bdellovibrio та подібні організми є предикторами різноманітності мікробіомів у різних популяціях господарів. мікроорганізм. Екологія. 79, 252–257 (2020).
Vila, J., Moreno-Morales, J. і Ballesté-Delpierre, C. Дізнайтеся про поточний статус нових антибактеріальних засобів. клінічний. мікроорганізм. Інфікувати. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2019.09.015 (2019).
Hobley, L. та ін. Подвійне хижацтво фага та фага може знищити здобич E. coli без єдиного хижацтва. Ж. Бактерії. 202, e00629-19. https://doi.org/10.1128/JB.00629-19 (2020).
Ель-Шибіні, А., Коннертон, П. Л. та Коннертон, І. Ф. Кількість і різноманітність Campylobacter і бактеріофагів, виділених під час циклу годівлі курей, які вирощуються на вільному вигулі та органічних курей. Середовище застосування. мікроорганізм. 71, 1259–1266 (2005).
Wilkinson, DA та ін. Оновлення геномної таксономії та епідеміології Campylobacter свиней. наука. Представник 8, 2393. https://doi.org/10.1038/s41598-018-20889-x (2018).
Лі, доктор медицини GToTree: Зручний робочий процес для системної геноміки. Біоінформатика 35, 4162–4164 (2019).
Edgar, RC MUSCLE: метод вирівнювання кількох послідовностей, який зменшує складність часу та простору. BMC біологічна інформація. 5, 113 (2004).
Capella-Gutiérrez, S., Silla-Martínez, JM & Gabaldón, T. TrimAl: Інструмент для автоматичного вирівнювання та обрізання у великомасштабному філогенетичному аналізі. Біоінформатика 25, 1972–1973 (2009).
Hyatt, D., LoCascio, PF, Hauser, LJ & Uberbacher, EC ген і прогноз метагеномної послідовності трансляції початкового сайту. Біоінформатика 28, 2223-2230 (2012).
Shen, W. & Xiong, J. TaxonKit: Кросплатформенний і ефективний інструментарій класифікації NCBI. Біо Rxiv. (Дата перегляду 1 червня 2021 р.); https://www.biorxiv.org/content/10.1101/513523v1 (2019).
Price, MN, Dehal, PS & Arkin, AP FastTree 2-наближене дерево максимальної ймовірності з великим вирівнюванням. PLoS One 5, e9490 (2010).
Танге, О. GNU Parallel. (Дата перегляду 1 червня 2021 р.); https://zenodo.org/record/1146014#.YOHaiJhKiUk (2018).
Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: Кіотська енциклопедія генів і геномів. Дослідження нуклеїнових кислот. 28, 27-30 (2000).
Чеська Республіка, Л. та ін. Роль екстремолітів ектоїну та гідроксіектоїну як захисників стресу та поживних речовин: генетика, системна геноміка, біохімія та структурний аналіз. Ген (Базель). 9. E177. https://doi.org/10.3390/genes9040177 (2018).
Грегсон Б. Х., Методієва Г., Методієв М. В., Голишин П. Н. та МакКью Б. А. Диференціальна експресія білка під час росту облігатної морської бактерії Thalassolituus oleivorans oleivorans MIL-1, що розкладає вуглеводні, під час росту алканів із середнім і довгим ланцюгом. спереду. мікроорганізм. 9, 3130 (2018).
Pasternak, Z., Ben Sasson, T., Cohen, Y., Segev, E., and Jurkevitch, E. Новий метод порівняльної геноміки для визначення фенотипічних специфічних показників виявляє специфічну спадковість у знаку хижих бактерій. Громадська наукова бібліотека 1. 10. e0142933. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142933 (2015).
Якимов М. М. та ін Thalassolituus oleivorans ген. Листопад, зр. nov., новий вид морських бактерій, що спеціалізується на використанні вуглеводнів. інтернаціональність. J. Система. еволюція. мікроорганізм. 54, 141–148 (2004).
Wang, Y., Yu, M., Liu, Y., Yang, X. & Zhang, XH Bacterioplanoides pacificum gen. Листопад, зр. У листопаді він відокремився від морської води, що циркулює в південній частині Тихого океану. інтернаціональність. J. Система. еволюція. мікроорганізм. 66, 5010–5015 (2016).